引用本文： 徐定平. 不同促滲劑對苗藥秤鉤風的透皮吸收特性研究. 華西醫學, 2014, 29(7): 1316-1318. doi: 10.7507/1002-0179.20140401 復制
秤鉤風又名穿墻風、華防己、過山龍等，來源于防己科秤鉤風屬植物秤鉤風的木質莖和根，主要分布于長江流域及其以南各省區，湖北省恩施土家苗族自治州是其主要分布產地之一[1, 2]。秤鉤風味苦性平，具有清熱利濕、活血止痛、解毒消腫等功效，民間常用于治療風濕骨痛、膽囊炎、尿路感染、小便淋澀及毒蛇咬傷等癥[2, 3]。青藤堿為其主要成分之一[4]，研究表明，青藤堿是一種副作用小、效果好的非甾體類消炎止痛藥物，具有顯著的鎮靜、鎮痛、消炎、降血壓和抑制免疫等作用，此外，青藤堿還有望用于戒除藥物成癮性的治療[5, 6]。但青藤堿口服生物利用度低，半衰期短，且需長時間口服給藥[7]，而在苗族醫藥中，秤鉤風多作為外用皮膚給藥，提示青藤堿可以通過皮膚進入人體而發揮治療作用。
本實驗研究擬以離體小鼠腹部皮膚為實驗屏障，采用改良擴散池法研究氮酮、油酸和冰片對秤鉤風提取物中青藤堿的經皮吸收的影響，為苗族醫藥中秤鉤風外用提供理論依據。
1 一般資料
1.1 儀器與試藥
1.1.1 實驗儀器
Waters高效液相色譜儀（515泵，2487紫外檢測器，美國Waters公司）；N3000色譜工作站（浙江大學）；安捷倫C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫公司）；TK-12A型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；AUW120電子分析天平（日本島津公司）；KQ5200DE型數控超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。
1.1.2 藥品與試劑
秤鉤風藥材采集于湖北省恩施州利川市汪營鎮，經恩施州藥檢所鑒定為防己科秤鉤風屬植物秤鉤風；色譜乙腈（美國TE-DA公司），色譜甲醇（美國TE-DA公司），其他試劑如石油醚、濃氨試液、甲醇、氯仿等均為分析純；含量測定用青藤堿對照品（中國藥品生物制品檢定所）；氮酮（分析純級，天津市北聯精細化學品開發有限公司）；油酸（分析純級，廣州化學試劑廠）；冰片（中國藥品生物制品檢定所）；水為去離子雙蒸水。
1.1.3 實驗動物
昆明小鼠，雌雄不限，6～7周齡，體質量（30 ± 5）g，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，衛生許可證號：SCXK（粵）2013-0020。
1.2 試液配制
1.2.1 樣品前處理
取秤鉤風干燥根莖適量，粉碎，過40目篩，備用。
1.2.2 供試品溶液制備
采用文獻[4]的方法：稱取秤鉤風藥材粉末600 g，加石油醚適量，浸漬過夜（24 h），過濾。濾渣用6 000 mL pH值為3.0的酸水提取3次，2 h/次，過濾，將濾液濃縮并溶解于甲醇中，再以pH值8.0的氨水堿化2 h，過濾，保留浸膏。浸膏加甲醇溶解后以氯仿萃取，揮去溶劑，得青藤堿粗提取物，加雙蒸水溶解定容至50 mL。
1.2.3 儲備對照品溶液的配制
精密稱取60℃下干燥至恒重的青藤堿對照品5 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加雙蒸水溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL的儲備對照品溶液。
1.2.4 陰性對照溶液的制備
取雙蒸水1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，取濾液，即為空白陰性對照液。
1.3 分析方法的建立
1.3.1 色譜條件
ODS-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-水（60︰40），用磷酸及三乙胺調整pH值至7.8；流速為1.0 mL/min；檢測波長262 nm；柱溫為室溫；進樣量為10 μL。ODS-C18保護柱連接于分析柱前。理論塔板數按青藤堿計應不小于5 000。
1.3.2 標準曲線的制備
精密吸取儲備對照品溶液5 mL至50 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液0.5、1、2、4、6、20 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，經0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣，以峰面積平均值（A）為縱坐標，對照品濃度（C）為橫坐標，得線性回歸方程。
1.3.3 精密度試驗
精密吸取濃度為40 μg/mL的青藤堿對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過后按照1.3.1項下色譜條件進樣6次，每次進樣3針，計算平均峰面積的相對標準偏差（RSD）。
1.3.4 穩定性試驗
精密吸取濃度為40 μg/mL的青藤堿對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過后分別于2、4、6、8、12、16、20、24 h進樣，每次進樣3針，計算平均峰面積的RSD。
1.4 體外透皮實驗方法的建立
1.4.1 離體皮膚的制備
提前2 d用脫毛膏脫去小鼠的腹部皮膚上附著的毛。2 d后將小鼠脫頸椎處死，立即剝取腹部皮膚，將取下的皮膚平鋪在干凈的玻璃板上，角質層朝下。用載玻片小心刮去皮下脂肪層和結締組織，用生理鹽水沖洗至無渾濁，置于?20℃冰箱保存，實驗時目視檢視皮膚完整性，不能有任何破損。
1.4.2 實驗方法
取離體小鼠腹皮，常溫下解凍，以生理鹽水洗凈，用濾紙吸干表面水分，將處理好的皮膚固定于擴散池的供體池和接收池之間，角質層面向供體池，接收池內放置磁力攪拌子。接收池中加入30%乙醇/70%生理鹽水7 mL作為接收介質，并排出氣泡在供體池中離體鼠皮表面均勻涂抹1.5 mL供試液及促滲劑（不加、3%油酸、3%氮酮和3%冰片水溶液）。水浴保持（32.0 ± 0.5）℃，恒速200 r/min。透皮實驗開始穩定20 min后，于1、2、4、6、8、10、12、24 h從接收池取樣1 mL，同時補充等體積同溫的空白接收液。按1.3.1項下方法分別檢測接收液中秤鉤風的含量，以其滲透速率常數和增滲倍數為參考量，考察促滲劑對秤鉤風的透皮吸收特性的影響。
1.4.3 數據處理
將得到的數據依照下列公式處理，求得累積滲透量、透皮速率和增滲倍數。公式如下：
| $\begin{gathered} {Q_n} = \frac{{{C_n} \times V + \sum\limits_{i = 1}^{n - 1} {{C_i} \times 1} }}{A}\left( {i = 1,2, \ldots \ldots n - 1} \right) \hfill \\ J = d{Q_n}/dt(即是Q-t方程斜率) \hfill \\ ER = J/{J_0} \hfill \\ \end{gathered} $ |
上式中：Qn：t時間藥物的面積透過量（μg/cm2）；A：滲透面積（cm2）；Cn：t時間濃度測量值（μg/mL）；Ci：t時間以前濃度測量值（μg/mL）；V：接收液總體積（mL）；ER：增滲倍數；J：透皮速率常數[μg/（cm2·h）]；J0：未加促滲劑的透皮速率常數[μg/（cm2·h）]。在本實驗中，A=2.92 cm2，V=7 mL。秤鉤風提取物按1.3.1項下檢測，計算得青藤堿的濃度為4.476 mg/mL。
2 結果
2.1 線性回歸方程
線性回歸方程為A=10 114.6C+9 833.7，r=0.999 7。結果表明青藤堿在1～40 μg/mL的范圍內線性關系良好。
2.2 精密度試驗與穩定性試驗
精密度試驗平均峰面積的RSD為1.05%，顯示儀器的精密度良好；穩定性試驗平均峰面積的RSD為0.92%，顯示青藤堿溶液在24 h內穩定。
2.3 體外透皮實驗
數據處理結果見表 1和圖 1。由表 1可以看出，3%油酸、氮酮和冰片溶液均可較好地促進秤鉤風中青藤堿的經皮吸收能力（增滲倍數）分別為1.61、1.71和1.26）。但從滯后時間可以看出，當秤鉤風與冰片配伍使用時，滯后時間（2.965 5 h）明顯延長，提示冰片可能與青藤堿存在競爭性透過。
圖1
不同促滲劑對秤鉤風經皮吸收的影響
表1
不同促滲劑對秤鉤風提取物的透皮特性的影響
由上述結果可見，與不加滲透促進劑組相較，3種促滲劑對秤鉤風均有較好的促進滲透的作用，尤以3%油酸效果最佳。秤鉤風提取物和冰片合用可以促進青藤堿的經皮吸收，為二者的配伍提供了理論依據。
3 討論
油酸的促滲機制主要是分離脂質液化和脂質相，它和皮膚中的脂肪酸結構相似，易于插入脂質雙分子層疏水結構，使脂質雙分子層產生扭轉效應，形成細微，減少擴散阻力[10, 11]。目前認為氮酮的促滲機制主要是角質層雙分子脂質層精密結構瓦解，其有序疊集排列被破壞，分子流度增加而產生促滲效果[12]。本研究的結果表明，3%油酸、氮酮均可促進秤鉤風中青藤堿的經皮吸收，其中尤以3%油酸效果最佳。
透皮吸收促進劑在經皮給藥制劑中得到了越來越廣泛的應用，而以中藥或其有效成分作為透皮吸收的天然促進劑，更是引起了廣泛的重視[13]。本研究中，冰片對秤鉤風中青藤堿的透皮吸收有較好的促進作用，說明冰片和秤鉤風配伍外用是合理的。李熙等[14]以冰片作為促進劑，發現其對青藤堿微乳經皮滲透有顯著的促進作用，與本研究結果一致。但當以冰片作為促滲劑時，秤鉤風中青藤堿經皮吸收滯后時間延長，其原因可能與本實驗接收介質組成有關。程怡等[15]的研究表明，冰片經皮滲透的重要途徑為細胞間質通道，其次為皮膚的水合增強作用，其經皮滲透特性與溶劑和促滲劑載體有關。
秤鉤風又名穿墻風、華防己、過山龍等，來源于防己科秤鉤風屬植物秤鉤風的木質莖和根，主要分布于長江流域及其以南各省區，湖北省恩施土家苗族自治州是其主要分布產地之一[1, 2]。秤鉤風味苦性平，具有清熱利濕、活血止痛、解毒消腫等功效，民間常用于治療風濕骨痛、膽囊炎、尿路感染、小便淋澀及毒蛇咬傷等癥[2, 3]。青藤堿為其主要成分之一[4]，研究表明，青藤堿是一種副作用小、效果好的非甾體類消炎止痛藥物，具有顯著的鎮靜、鎮痛、消炎、降血壓和抑制免疫等作用，此外，青藤堿還有望用于戒除藥物成癮性的治療[5, 6]。但青藤堿口服生物利用度低，半衰期短，且需長時間口服給藥[7]，而在苗族醫藥中，秤鉤風多作為外用皮膚給藥，提示青藤堿可以通過皮膚進入人體而發揮治療作用。
本實驗研究擬以離體小鼠腹部皮膚為實驗屏障，采用改良擴散池法研究氮酮、油酸和冰片對秤鉤風提取物中青藤堿的經皮吸收的影響，為苗族醫藥中秤鉤風外用提供理論依據。
1 一般資料
1.1 儀器與試藥
1.1.1 實驗儀器
Waters高效液相色譜儀（515泵，2487紫外檢測器，美國Waters公司）；N3000色譜工作站（浙江大學）；安捷倫C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫公司）；TK-12A型透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿易有限公司）；AUW120電子分析天平（日本島津公司）；KQ5200DE型數控超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）。
1.1.2 藥品與試劑
秤鉤風藥材采集于湖北省恩施州利川市汪營鎮，經恩施州藥檢所鑒定為防己科秤鉤風屬植物秤鉤風；色譜乙腈（美國TE-DA公司），色譜甲醇（美國TE-DA公司），其他試劑如石油醚、濃氨試液、甲醇、氯仿等均為分析純；含量測定用青藤堿對照品（中國藥品生物制品檢定所）；氮酮（分析純級，天津市北聯精細化學品開發有限公司）；油酸（分析純級，廣州化學試劑廠）；冰片（中國藥品生物制品檢定所）；水為去離子雙蒸水。
1.1.3 實驗動物
昆明小鼠，雌雄不限，6～7周齡，體質量（30 ± 5）g，購于廣州中醫藥大學實驗動物中心，衛生許可證號：SCXK（粵）2013-0020。
1.2 試液配制
1.2.1 樣品前處理
取秤鉤風干燥根莖適量，粉碎，過40目篩，備用。
1.2.2 供試品溶液制備
采用文獻[4]的方法：稱取秤鉤風藥材粉末600 g，加石油醚適量，浸漬過夜（24 h），過濾。濾渣用6 000 mL pH值為3.0的酸水提取3次，2 h/次，過濾，將濾液濃縮并溶解于甲醇中，再以pH值8.0的氨水堿化2 h，過濾，保留浸膏。浸膏加甲醇溶解后以氯仿萃取，揮去溶劑，得青藤堿粗提取物，加雙蒸水溶解定容至50 mL。
1.2.3 儲備對照品溶液的配制
精密稱取60℃下干燥至恒重的青藤堿對照品5 mg，置25 mL棕色容量瓶中，加雙蒸水溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL的儲備對照品溶液。
1.2.4 陰性對照溶液的制備
取雙蒸水1 mL，過0.22 μm微孔濾膜，取濾液，即為空白陰性對照液。
1.3 分析方法的建立
1.3.1 色譜條件
ODS-C18柱（250.0 mm×4.6 mm，5 μm）；乙腈-水（60︰40），用磷酸及三乙胺調整pH值至7.8；流速為1.0 mL/min；檢測波長262 nm；柱溫為室溫；進樣量為10 μL。ODS-C18保護柱連接于分析柱前。理論塔板數按青藤堿計應不小于5 000。
1.3.2 標準曲線的制備
精密吸取儲備對照品溶液5 mL至50 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。精密吸取上述溶液0.5、1、2、4、6、20 mL分別置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，經0.45 μm微孔濾膜過濾，進樣，以峰面積平均值（A）為縱坐標，對照品濃度（C）為橫坐標，得線性回歸方程。
1.3.3 精密度試驗
精密吸取濃度為40 μg/mL的青藤堿對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過后按照1.3.1項下色譜條件進樣6次，每次進樣3針，計算平均峰面積的相對標準偏差（RSD）。
1.3.4 穩定性試驗
精密吸取濃度為40 μg/mL的青藤堿對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜濾過后分別于2、4、6、8、12、16、20、24 h進樣，每次進樣3針，計算平均峰面積的RSD。
1.4 體外透皮實驗方法的建立
1.4.1 離體皮膚的制備
提前2 d用脫毛膏脫去小鼠的腹部皮膚上附著的毛。2 d后將小鼠脫頸椎處死，立即剝取腹部皮膚，將取下的皮膚平鋪在干凈的玻璃板上，角質層朝下。用載玻片小心刮去皮下脂肪層和結締組織，用生理鹽水沖洗至無渾濁，置于?20℃冰箱保存，實驗時目視檢視皮膚完整性，不能有任何破損。
1.4.2 實驗方法
取離體小鼠腹皮，常溫下解凍，以生理鹽水洗凈，用濾紙吸干表面水分，將處理好的皮膚固定于擴散池的供體池和接收池之間，角質層面向供體池，接收池內放置磁力攪拌子。接收池中加入30%乙醇/70%生理鹽水7 mL作為接收介質，并排出氣泡在供體池中離體鼠皮表面均勻涂抹1.5 mL供試液及促滲劑（不加、3%油酸、3%氮酮和3%冰片水溶液）。水浴保持（32.0 ± 0.5）℃，恒速200 r/min。透皮實驗開始穩定20 min后，于1、2、4、6、8、10、12、24 h從接收池取樣1 mL，同時補充等體積同溫的空白接收液。按1.3.1項下方法分別檢測接收液中秤鉤風的含量，以其滲透速率常數和增滲倍數為參考量，考察促滲劑對秤鉤風的透皮吸收特性的影響。
1.4.3 數據處理
將得到的數據依照下列公式處理，求得累積滲透量、透皮速率和增滲倍數。公式如下：
| $\begin{gathered} {Q_n} = \frac{{{C_n} \times V + \sum\limits_{i = 1}^{n - 1} {{C_i} \times 1} }}{A}\left( {i = 1,2, \ldots \ldots n - 1} \right) \hfill \\ J = d{Q_n}/dt(即是Q-t方程斜率) \hfill \\ ER = J/{J_0} \hfill \\ \end{gathered} $ |
上式中：Qn：t時間藥物的面積透過量（μg/cm2）；A：滲透面積（cm2）；Cn：t時間濃度測量值（μg/mL）；Ci：t時間以前濃度測量值（μg/mL）；V：接收液總體積（mL）；ER：增滲倍數；J：透皮速率常數[μg/（cm2·h）]；J0：未加促滲劑的透皮速率常數[μg/（cm2·h）]。在本實驗中，A=2.92 cm2，V=7 mL。秤鉤風提取物按1.3.1項下檢測，計算得青藤堿的濃度為4.476 mg/mL。
2 結果
2.1 線性回歸方程
線性回歸方程為A=10 114.6C+9 833.7，r=0.999 7。結果表明青藤堿在1～40 μg/mL的范圍內線性關系良好。
2.2 精密度試驗與穩定性試驗
精密度試驗平均峰面積的RSD為1.05%，顯示儀器的精密度良好；穩定性試驗平均峰面積的RSD為0.92%，顯示青藤堿溶液在24 h內穩定。
2.3 體外透皮實驗
數據處理結果見表 1和圖 1。由表 1可以看出，3%油酸、氮酮和冰片溶液均可較好地促進秤鉤風中青藤堿的經皮吸收能力（增滲倍數）分別為1.61、1.71和1.26）。但從滯后時間可以看出，當秤鉤風與冰片配伍使用時，滯后時間（2.965 5 h）明顯延長，提示冰片可能與青藤堿存在競爭性透過。
圖1
不同促滲劑對秤鉤風經皮吸收的影響
表1
不同促滲劑對秤鉤風提取物的透皮特性的影響
由上述結果可見，與不加滲透促進劑組相較，3種促滲劑對秤鉤風均有較好的促進滲透的作用，尤以3%油酸效果最佳。秤鉤風提取物和冰片合用可以促進青藤堿的經皮吸收，為二者的配伍提供了理論依據。
3 討論
油酸的促滲機制主要是分離脂質液化和脂質相，它和皮膚中的脂肪酸結構相似，易于插入脂質雙分子層疏水結構，使脂質雙分子層產生扭轉效應，形成細微，減少擴散阻力[10, 11]。目前認為氮酮的促滲機制主要是角質層雙分子脂質層精密結構瓦解，其有序疊集排列被破壞，分子流度增加而產生促滲效果[12]。本研究的結果表明，3%油酸、氮酮均可促進秤鉤風中青藤堿的經皮吸收，其中尤以3%油酸效果最佳。
透皮吸收促進劑在經皮給藥制劑中得到了越來越廣泛的應用，而以中藥或其有效成分作為透皮吸收的天然促進劑，更是引起了廣泛的重視[13]。本研究中，冰片對秤鉤風中青藤堿的透皮吸收有較好的促進作用，說明冰片和秤鉤風配伍外用是合理的。李熙等[14]以冰片作為促進劑，發現其對青藤堿微乳經皮滲透有顯著的促進作用，與本研究結果一致。但當以冰片作為促滲劑時，秤鉤風中青藤堿經皮吸收滯后時間延長，其原因可能與本實驗接收介質組成有關。程怡等[15]的研究表明，冰片經皮滲透的重要途徑為細胞間質通道，其次為皮膚的水合增強作用，其經皮滲透特性與溶劑和促滲劑載體有關。
