引用本文： 楊興林, 熊金鳳, 李麗, 王義光. 熒光聚合酶鏈式反應與酶聯免疫吸附法篩查腸道病毒71型病原感染的比較研究. 華西醫學, 2014, 29(7): 1309-1312. doi: 10.7507/1002-0179.20140399 復制
手足口病是兒童常見病，多種腸道病毒均可引起手足口病，其中腸道病毒71型（EV71）為常見的病毒之一。在臨床上與其他腸道病毒感染所引起的手足口病難以區別，EV71對人群普遍具有易感性，但感染成人一般癥狀較輕，而兒童發病時，癥狀較重且其并發癥發生率和病死率均較高[1]。因此，手足口病一定要早診斷、早治療。大部分患兒會在發熱1～2 d后，出現斑丘疹或皰疹，因此，為了不錯過重癥患兒的最佳搶救時間，在疾病高發期，居住在流行區域或接觸過手足口病患兒的兒童，尤其是3歲以下幼兒，一旦出現發熱癥狀，應立刻到醫療機構就診，進行EV71核酸檢測或EV71血清學檢測，及時明確是否感染了EV71所致的手足口病，這對挽救重癥患兒的生命極其重要。2011年4月－9月，我們采用實時熒光聚合酶鏈式反應（PCR）與血清標本EV71-IgM抗體的聯合檢測方法，對我市手足口病疑似患兒進行診斷，并就兩種方法的檢測情況進行比較。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選擇2011年4月20日－9月10日，在貴陽市第五人民醫院（貴陽市手足口病的定點醫院）感染科住院治療的手足口病患兒1 379例，其中男817例，女562例。按年齡段分組，0歲組425例，1歲組517例，2歲組243例，3歲組122例，4歲組44例，≥5歲28例。診斷符合原衛生部發布的《手足口病診療指南》（2010年版）。所有臨床診斷病例入院后均進行EV71核酸及EV71-IgM抗體檢測。
1.2 標本的采集
EV71核酸檢測標本采集用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數下，拔出后，迅速將棉簽放入病毒采樣管（北京友康基業生物科技有限公司）中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，放?20℃冰箱保存備檢。EV71-IgM抗體檢測用真空靜脈采血管抽取其靜脈血3 mL，3 000 r/min離心分離血清檢測IgM抗體。
1.3 檢測試劑與方法
EV71核酸檢測試劑盒及病毒RNA的提取試劑盒均為上海之江生物科技有限公司生產的產品，核酸提取采用磁珠柱提取法，檢測用熒光PCR方法均嚴格按照說明書操作。在博日FQD-66A熒光定量PCR儀上進行檢測。結果判斷：按照說明書，檢測Ct≤38，檢測結果報告為陽性，如果檢測Ct值在38～40之間，重復檢測1次，如果重復檢測Ct值仍在38～40之間，則判為陰性。
EV71-IgM抗體檢測試劑購自北京貝爾生物制品有限公司，利用酶聯免疫吸附法（ELISA）間接法定性檢測EV71-IgM抗體，按照試劑說明書操作，酶標儀讀取A值計算截斷值，截斷值≥2.1判為陽性，酶標儀為雷杜RT-2100C。
1.4 統計學方法
所有患兒信息及檢測結果輸入Excel 2007，采用SPSS 11.0軟件對有關計數資料行統計分析。組間比較采用χ2檢驗進行統計，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EV71-IgM抗體檢測情況
共收集到1 379例手足口病住院患兒的血清樣本，平均IgM抗體的陽性率為5.95%（82/1 379），男童IgM抗體的陽性率為6.12%（50/817），女童總IgM抗體的陽性率5.69%（32/562），男童略高于女童，性別差異無統計學意義（χ2=0.108，P=0.744）。
EV71-IgM陽性率主要以1歲組、2歲組檢出率最高，分別為7.54%（39/517）及8.64%（21/243），各年齡組之間總陽性率的差異有統計學意義；在2歲組，男、女IgM陽性率分別為10.52%（14/133）、6.36%（7/110），男孩IgM陽性率略高于女孩，在5歲以上患兒中未檢出陽性病例，就性別而言，男女各年齡組的IgM陽性率差異均無統計學意義。
2.2 EV71核酸檢測情況
應用PCR法檢測出EV71核酸陽性79份，檢出率為5.73%；不同年齡組EV71陽性率差異有統計學意義（χ2=12.27，P＜0.05），在l～3歲的患兒中，EV71的陽性率最高。
2.3 EV71核酸與EV71-IgM抗體檢測方法學比較
1 379例患兒EV71核酸陽性為79例，陽性率為5.73%，EV71-IgM抗體陽性為82例，陽性率為5.95%，兩種方法檢查均為陽性者32例。兩檢測方法一致率為95.2%，兩種方法之間的陽性檢出率差異無統計學意義（χ2=0.093，P=0.761），見表 1。以EV71核酸檢測為“金標準”，EV71-IgM抗體檢查靈敏度為40.50%，特異度為96.15%，陽性預測值為39.02%，陰性預測值為96.37%。
表1
手足口病患兒EV71核酸與EV71-IgM抗體檢測結果
3 討論
腸道病毒是引起嬰幼兒手足口病的病原，1957年新西蘭首次報道手足口病，1958年分離出該病的常見病毒之—柯薩奇病毒A組16型。1969年首次從美國加利福尼亞患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出病毒并鑒定為EV71[2]。我國自1981年上海市首次報道手足口病。福建省最早于1983年從患兒的糞便和皰疹中分離出病毒，1985年經血清學證實為CVA16病毒[3]。自從2008年3月我國安徽阜陽市暴發了手足口病，報告手足口病3 736例，死亡22例，已被證實為EV71感染所致[4]。由于EV71引起的手足口病會進一步發展為無菌性腦膜炎、重癥腦膜炎，甚至死亡，EV71的研究受到國內外學者的重點關注。EV71感染引起的手足口病在臨床表現上與柯薩奇病毒、埃可病毒等20多種病毒感染所引起的手足口病難以區別。隱性感染者和輕型散發病例是流行間歇和流行期的主要傳染源[5]。早期診斷EV71感染對預防和控制EV71傳播，盡早預防EV71感染引起的并發癥和死亡的發生，具有十分重要的意義。
本次研究EV71核酸檢測結果表明，本地區EV71病毒的檢出率5.73%，低于重慶的60.54%、江蘇46.62%、廣州23.72%[6-8]，可見EV71病毒還不是本地區手足口病的主要病原體。腸道患者感染率的高低存在地區差異，這些是否與當地經濟、氣候、醫療衛生水平、易感人群的累積、流行毒株等有關，有必要開展進一步的研究。EV71型IgM抗體與核酸聯合檢測差異無統計學意義，與杜陽光等[9]、彭蘭芬等[10]報道結果基本一致，說明兩種方法同時檢測具有較好的互補效果。本次研究結果用熒光PCR方法檢測EV71核酸與ELISA法檢測EV71抗體其敏感度為40.5%，陽性預測值為39.02%。主要原因病毒核酸在疾病早期甚至潛伏期可能就已經存在，檢測可以陽性；而EV71-IgM產生相對滯后，抗體檢測為陰性。通過臨床病例調查發現，出現手、足、口、臀皮疹、且2 d內體溫高達38℃以上入院或以病重急診入院的患者，此時抗體尚未出現或機體免疫系統的遲緩應答，因而出現EV71核酸陽性的79例患者中僅檢測出EV71抗體陽性者32例。然而在82例EV71-IgM陽性樣本中熒光PCR方法檢測EV71核酸僅32例陽性，主要由于手足口病可由多種腸道病毒引起，包括腸病毒EV71型和柯薩奇病毒A4、A5、A8、A10、A16、B3、B7等20多種腸道病毒，其中EV71與柯薩奇病毒A16較常見，由于CA16與EV71具有77%的核苷酸同源性和89%的氨基酸同源性[11]，要完全杜絕EV71和CA16及其他腸道病毒感染的血清學交叉反應比較困難。國內外都曾應用EV71當地分離株或EV71的VP1基因體外表達蛋白作為抗原，建立ELISA法檢測患者血清IgM和IgG抗體，均獲得相對滿意的結果。但在多血清型同時流行時，在病原未明確的前提下，檢測IgM抗體實際可操作性不強，仍未能達到早期診斷的目的[12]。林裕龍等[13]在89例樣本中，從35例CA16感染患兒中檢測出EV71-IgM陽性樣本25例，9例其他型腸道病毒感染中檢測出EV71-IgM陽性樣本1例。本研究檢測1 379例樣本中其核酸檢測與抗體結果與其基本一致，而其方法特異度為96.15%，陰性預測為96.37%，在EV71抗體陰性排除EV71感染具有一定臨床運用價值。
EV71病毒病原學檢測方法包括：① 病原體檢測：包括病毒分離培養或特異性EV71核酸陽性。② 血清學檢查：包括中和抗體檢測、ELISA和補體結合試驗等免疫學方法來檢測患者血清中的特異性抗體。此外還有間接免疫熒光技術、免疫組織化學技術、核酸序列測定等多種檢測方法，可從更多方面作為對EV71實驗室檢查的補充。病毒分離是病毒性疾病診斷的“金標準”，于病毒的分離鑒定對技術要求較高、費用較昂貴、耗時，目前僅用于實驗研究。實時熒光定量PCR是在傳統RT-PCR的方法上進行改良的方法，具有不易污染，特異性強，操作簡便等優點，可用于手足口病暴發疫情和臨床病例的早期高通量快速診斷，但PCR法需要昂貴的儀器設備。目前國內有ELISA檢測試劑盒，其中EV71抗體（IgM）診斷試劑盒主要用于患兒發病后的早期診斷，患兒發病后2 d即能確診，大大減少了因延誤治療而致死的患兒數量。而ELISA方法檢測患者血清中的IgM抗體，是現癥感染的常用檢測方法，同時因其簡單方便、易于操作，在各級衛生機構中有廣泛的應用[14]。
綜上，EV71-IgM ELISA法具有高敏感性，操作簡單、耗時短、對人員和設備要求低、適用范圍廣、成本低等優點，有利于疾病的早發現、早治療。因此對于EV71感染的初篩和基層防控，EV71-IgM ELISA法可作為優先考慮的檢測方法。而對于有條件的單位，建議兩種方法聯合檢測。
手足口病是兒童常見病，多種腸道病毒均可引起手足口病，其中腸道病毒71型（EV71）為常見的病毒之一。在臨床上與其他腸道病毒感染所引起的手足口病難以區別，EV71對人群普遍具有易感性，但感染成人一般癥狀較輕，而兒童發病時，癥狀較重且其并發癥發生率和病死率均較高[1]。因此，手足口病一定要早診斷、早治療。大部分患兒會在發熱1～2 d后，出現斑丘疹或皰疹，因此，為了不錯過重癥患兒的最佳搶救時間，在疾病高發期，居住在流行區域或接觸過手足口病患兒的兒童，尤其是3歲以下幼兒，一旦出現發熱癥狀，應立刻到醫療機構就診，進行EV71核酸檢測或EV71血清學檢測，及時明確是否感染了EV71所致的手足口病，這對挽救重癥患兒的生命極其重要。2011年4月－9月，我們采用實時熒光聚合酶鏈式反應（PCR）與血清標本EV71-IgM抗體的聯合檢測方法，對我市手足口病疑似患兒進行診斷，并就兩種方法的檢測情況進行比較。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選擇2011年4月20日－9月10日，在貴陽市第五人民醫院（貴陽市手足口病的定點醫院）感染科住院治療的手足口病患兒1 379例，其中男817例，女562例。按年齡段分組，0歲組425例，1歲組517例，2歲組243例，3歲組122例，4歲組44例，≥5歲28例。診斷符合原衛生部發布的《手足口病診療指南》（2010年版）。所有臨床診斷病例入院后均進行EV71核酸及EV71-IgM抗體檢測。
1.2 標本的采集
EV71核酸檢測標本采集用專用采樣棉簽，從患兒肛門輕輕插入，適度用力弧型左右擦拭數下，拔出后，迅速將棉簽放入病毒采樣管（北京友康基業生物科技有限公司）中，采樣管外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋，并密封，放?20℃冰箱保存備檢。EV71-IgM抗體檢測用真空靜脈采血管抽取其靜脈血3 mL，3 000 r/min離心分離血清檢測IgM抗體。
1.3 檢測試劑與方法
EV71核酸檢測試劑盒及病毒RNA的提取試劑盒均為上海之江生物科技有限公司生產的產品，核酸提取采用磁珠柱提取法，檢測用熒光PCR方法均嚴格按照說明書操作。在博日FQD-66A熒光定量PCR儀上進行檢測。結果判斷：按照說明書，檢測Ct≤38，檢測結果報告為陽性，如果檢測Ct值在38～40之間，重復檢測1次，如果重復檢測Ct值仍在38～40之間，則判為陰性。
EV71-IgM抗體檢測試劑購自北京貝爾生物制品有限公司，利用酶聯免疫吸附法（ELISA）間接法定性檢測EV71-IgM抗體，按照試劑說明書操作，酶標儀讀取A值計算截斷值，截斷值≥2.1判為陽性，酶標儀為雷杜RT-2100C。
1.4 統計學方法
所有患兒信息及檢測結果輸入Excel 2007，采用SPSS 11.0軟件對有關計數資料行統計分析。組間比較采用χ2檢驗進行統計，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 EV71-IgM抗體檢測情況
共收集到1 379例手足口病住院患兒的血清樣本，平均IgM抗體的陽性率為5.95%（82/1 379），男童IgM抗體的陽性率為6.12%（50/817），女童總IgM抗體的陽性率5.69%（32/562），男童略高于女童，性別差異無統計學意義（χ2=0.108，P=0.744）。
EV71-IgM陽性率主要以1歲組、2歲組檢出率最高，分別為7.54%（39/517）及8.64%（21/243），各年齡組之間總陽性率的差異有統計學意義；在2歲組，男、女IgM陽性率分別為10.52%（14/133）、6.36%（7/110），男孩IgM陽性率略高于女孩，在5歲以上患兒中未檢出陽性病例，就性別而言，男女各年齡組的IgM陽性率差異均無統計學意義。
2.2 EV71核酸檢測情況
應用PCR法檢測出EV71核酸陽性79份，檢出率為5.73%；不同年齡組EV71陽性率差異有統計學意義（χ2=12.27，P＜0.05），在l～3歲的患兒中，EV71的陽性率最高。
2.3 EV71核酸與EV71-IgM抗體檢測方法學比較
1 379例患兒EV71核酸陽性為79例，陽性率為5.73%，EV71-IgM抗體陽性為82例，陽性率為5.95%，兩種方法檢查均為陽性者32例。兩檢測方法一致率為95.2%，兩種方法之間的陽性檢出率差異無統計學意義（χ2=0.093，P=0.761），見表 1。以EV71核酸檢測為“金標準”，EV71-IgM抗體檢查靈敏度為40.50%，特異度為96.15%，陽性預測值為39.02%，陰性預測值為96.37%。
表1
手足口病患兒EV71核酸與EV71-IgM抗體檢測結果
3 討論
腸道病毒是引起嬰幼兒手足口病的病原，1957年新西蘭首次報道手足口病，1958年分離出該病的常見病毒之—柯薩奇病毒A組16型。1969年首次從美國加利福尼亞患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出病毒并鑒定為EV71[2]。我國自1981年上海市首次報道手足口病。福建省最早于1983年從患兒的糞便和皰疹中分離出病毒，1985年經血清學證實為CVA16病毒[3]。自從2008年3月我國安徽阜陽市暴發了手足口病，報告手足口病3 736例，死亡22例，已被證實為EV71感染所致[4]。由于EV71引起的手足口病會進一步發展為無菌性腦膜炎、重癥腦膜炎，甚至死亡，EV71的研究受到國內外學者的重點關注。EV71感染引起的手足口病在臨床表現上與柯薩奇病毒、埃可病毒等20多種病毒感染所引起的手足口病難以區別。隱性感染者和輕型散發病例是流行間歇和流行期的主要傳染源[5]。早期診斷EV71感染對預防和控制EV71傳播，盡早預防EV71感染引起的并發癥和死亡的發生，具有十分重要的意義。
本次研究EV71核酸檢測結果表明，本地區EV71病毒的檢出率5.73%，低于重慶的60.54%、江蘇46.62%、廣州23.72%[6-8]，可見EV71病毒還不是本地區手足口病的主要病原體。腸道患者感染率的高低存在地區差異，這些是否與當地經濟、氣候、醫療衛生水平、易感人群的累積、流行毒株等有關，有必要開展進一步的研究。EV71型IgM抗體與核酸聯合檢測差異無統計學意義，與杜陽光等[9]、彭蘭芬等[10]報道結果基本一致，說明兩種方法同時檢測具有較好的互補效果。本次研究結果用熒光PCR方法檢測EV71核酸與ELISA法檢測EV71抗體其敏感度為40.5%，陽性預測值為39.02%。主要原因病毒核酸在疾病早期甚至潛伏期可能就已經存在，檢測可以陽性；而EV71-IgM產生相對滯后，抗體檢測為陰性。通過臨床病例調查發現，出現手、足、口、臀皮疹、且2 d內體溫高達38℃以上入院或以病重急診入院的患者，此時抗體尚未出現或機體免疫系統的遲緩應答，因而出現EV71核酸陽性的79例患者中僅檢測出EV71抗體陽性者32例。然而在82例EV71-IgM陽性樣本中熒光PCR方法檢測EV71核酸僅32例陽性，主要由于手足口病可由多種腸道病毒引起，包括腸病毒EV71型和柯薩奇病毒A4、A5、A8、A10、A16、B3、B7等20多種腸道病毒，其中EV71與柯薩奇病毒A16較常見，由于CA16與EV71具有77%的核苷酸同源性和89%的氨基酸同源性[11]，要完全杜絕EV71和CA16及其他腸道病毒感染的血清學交叉反應比較困難。國內外都曾應用EV71當地分離株或EV71的VP1基因體外表達蛋白作為抗原，建立ELISA法檢測患者血清IgM和IgG抗體，均獲得相對滿意的結果。但在多血清型同時流行時，在病原未明確的前提下，檢測IgM抗體實際可操作性不強，仍未能達到早期診斷的目的[12]。林裕龍等[13]在89例樣本中，從35例CA16感染患兒中檢測出EV71-IgM陽性樣本25例，9例其他型腸道病毒感染中檢測出EV71-IgM陽性樣本1例。本研究檢測1 379例樣本中其核酸檢測與抗體結果與其基本一致，而其方法特異度為96.15%，陰性預測為96.37%，在EV71抗體陰性排除EV71感染具有一定臨床運用價值。
EV71病毒病原學檢測方法包括：① 病原體檢測：包括病毒分離培養或特異性EV71核酸陽性。② 血清學檢查：包括中和抗體檢測、ELISA和補體結合試驗等免疫學方法來檢測患者血清中的特異性抗體。此外還有間接免疫熒光技術、免疫組織化學技術、核酸序列測定等多種檢測方法，可從更多方面作為對EV71實驗室檢查的補充。病毒分離是病毒性疾病診斷的“金標準”，于病毒的分離鑒定對技術要求較高、費用較昂貴、耗時，目前僅用于實驗研究。實時熒光定量PCR是在傳統RT-PCR的方法上進行改良的方法，具有不易污染，特異性強，操作簡便等優點，可用于手足口病暴發疫情和臨床病例的早期高通量快速診斷，但PCR法需要昂貴的儀器設備。目前國內有ELISA檢測試劑盒，其中EV71抗體（IgM）診斷試劑盒主要用于患兒發病后的早期診斷，患兒發病后2 d即能確診，大大減少了因延誤治療而致死的患兒數量。而ELISA方法檢測患者血清中的IgM抗體，是現癥感染的常用檢測方法，同時因其簡單方便、易于操作，在各級衛生機構中有廣泛的應用[14]。
綜上，EV71-IgM ELISA法具有高敏感性，操作簡單、耗時短、對人員和設備要求低、適用范圍廣、成本低等優點，有利于疾病的早發現、早治療。因此對于EV71感染的初篩和基層防控，EV71-IgM ELISA法可作為優先考慮的檢測方法。而對于有條件的單位，建議兩種方法聯合檢測。
