引用本文： 應軍, 趙靜. 四種方法檢測抗雙鏈DNA抗體診斷效能的對比分析. 華西醫學, 2014, 29(7): 1305-1308. doi: 10.7507/1002-0179.20140398 復制
抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體自1957年被首次發現以來，一直被公認為系統性紅斑狼瘡（SLE）的診斷標志物，也是監測SLE疾病活動度的優良指標[1]，其水平升高通常先于病情加重（有時超過2年）[2]。目前臨床上用于抗dsDNA抗體檢測的方法主要有綠蠅短膜蟲間接熒光免疫法（CLIFT）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、線性免疫分析法（LIA）和化學發光免疫分析法（CLIA）。本研究旨在通過臨床診斷試驗，評價這4種方法檢測抗dsDNA抗體對SLE疾病的診斷效能，現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選擇2012年7月－2013年6月來我院就診的86例SLE患者（SLE組）、62例其他自身免疫性疾病患者（OAID組）和30例健康體檢者（對照組）為研究對象。SLE患者的診斷參照中華醫學會風濕病學分會于2010年發布的《系統性紅斑狼瘡診斷及治療指南》[3]，其中男6例，女80例；年齡16～73歲，平均35歲；發病年齡（26.3 ± 10.5）歲；初診34例，復診52例。其他自身免疫性疾病患者的診斷同樣參照2010年中華醫學會風濕病學分會發布的診療指南，其中男17例，女45例；年齡18～69歲，平均42歲；發病年齡（31.5 ± 18.7）歲；包括類風濕關節炎30例，干燥綜合征19例，混合性結締組織病10例，系統性硬化癥2例，多肌炎1例。對照組男8例，女22例，年齡18～50歲，平均38歲。兩組患者臨床特征見表 1。
表1
兩組患者臨床特征比較[例（%）]
1.2 方法
1.2.1 標本采集
在研究對象門診就診時，即用紅頭管（美國BD公司產品）采集3～4 mL靜脈血，靜置30 min后以2 500 r/min離心10 min，收集血清凍存于?80 ℃冰箱中待用。
1.2.2 儀器和試劑
CLIFT：采用EUROStarⅢ plus熒光顯微鏡及IIF-dsDNA試劑盒，均來自德國歐蒙醫學實驗診斷股份公司，截斷值：1+。LIA：采用XD236自動蛋白印跡儀（上海迅達醫療儀器有限公司），試劑盒：ANA-12H試劑盒（四川新健康成生物股份有限公司），截斷值：≥cutoff帶。ELISA：采用ST-360酶標儀、ST-36W洗板機（上海科華生物工程股份有限公司），試劑盒：ELISA-dsDNA試劑盒（四川新健康成生物股份有限公司），截斷值：30 U/mL。CLIA：采用LIAISON全自動化學發光儀及其CLIA-dsDNA試劑盒（意大利索靈公司），截斷值：25 U/mL。本室采用的截斷值與廠家提供的截斷值相同。
1.2.3 實驗操作
將待測標本進行室溫復溶，嚴格按照試劑盒操作說明書進行實驗。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。4種方法檢測抗dsDNA抗體對SLE的診斷靈敏度和特異度分析采用四格表分類計算。4種方法檢測抗dsDNA抗體對SLE診斷的一致性比較采用Kappa一致性分析。設定特異度為95.0%時，ELISA和CLIA靈敏度的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各方法檢測抗dsDNA抗體對SLE的診斷靈敏度和特異度分析
以廠家提供的截斷值為判斷標準，4種方法中，ELISA的靈敏度最高（67.4%），而CLIA的特異度最高（95.6%），診斷效能從高到低依次為ELISA、CLIA、CLIFT和LIA。見表 2。
表2
各方法檢測dsDNA抗體對SLE的診斷效能分析表
2.2 各方法檢測抗dsDNA抗體對SLE診斷一致性
以CLIFT為比較方法，其他3種實驗方法與比較方法相比，Kappa值均＞0.8，表明一致性非常好。見表 3。
表3
各方法的診斷一致性
2.3 設定診斷特異度為95.0%時ELISA和CLIA的靈敏度比較
如果特異度設定為95.0%，ELISA的截斷值將調整為50 U/mL，靈敏度為58.1%；CLIA的截斷值將調整為22 U/mL，靈敏度為60.5%。2種方法的靈敏度差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 4。
表4
設定特異度為95%時ELISA和CLIA的診斷靈敏度比較
3 討論
SLE是臨床上最常見的、復雜的和高度異質性的自身免疫性疾病之一。免疫失調導致了自身抗體和免疫復合物過量生產和補體過量活化，與SLE患者體內潛在的組織炎癥一起，共同導致多器官受累的臨床綜合征，因此，SLE已成為臨床診斷和治療的最大挑戰之一[4, 5]。早期診斷和治療對于延緩病情進展、保護器官功能、改善預后和提高生存率都至關重要。在過去的幾十年里，醫學工作者投入巨大的熱情和努力，致力于SLE的發病機制、診斷標志物和治療藥物的研究，盡管已取得重大進展，但仍有許多難題尚待解決[4]。傳統的生物標志物包括抗核抗體、抗dsDNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗Ro/SSA抗體等[6]，最新的研究進展顯示，Fc受體基因、補體C4d結合紅細胞、CD27漿細胞、干擾素指紋和抗C1q抗體等都是SLE特異的生物標志物[7]。
盡管如此，抗dsDNA抗體仍是臨床上使用最為廣泛、最經典的SLE特異標志物。目前臨床上用于抗dsDNA抗體檢測的方法主要有CLIFT、ELISA、LIA、CLIA和放射免疫法[8]。關于幾種方法檢測抗dsDNA抗體的效能比較，已有較多臨床報道[9-11]，總體來說，雖然這幾種方法的診斷效能有所差異，但總體符合度較高，均適用于SLE患者的臨床診斷。
本研究通過對86例SLE患者、62例其他自身免疫性疾病患者和30例健康體檢者的比較分析，驗證了CLIFT、ELISA、LIA和CLIA 4種方法對SLE診斷效能的差異，總體結論與國外報道基本相符[9-13]。從表 2中可以看到，4種方法對SLE的診斷靈敏度和特異度分別為58.1%和88.0%（CLIFT）、67.4%和90.2%（ELISA）、54.7%和85.9%（LIA）、55.8%和95.6%（CLIA），診斷效能從高到低依次為ELISA、CLIA、CLIFT和LIA，其中以ELISA法的靈敏度最高（67.4%），而CLIA法的特異度最高（95.6%）。Janyapoon等[14]研究顯示，ELISA法與CLIFT法相比，特異度相當，而靈敏度更高。Yang等[15]通過對6種試劑盒的比較研究發現，Human公司的ELISA試劑盒靈敏度顯著高于其他5種試劑盒（Salmon和Plasmid的ELISA試劑盒、CLIFT、CLIA、LIA），而Salmon-ELISA和LIA的特異度最低，這與本研究結果相同。從4種方法的檢測一致性結果來看，3種實驗方法（ELISA、LIA、CLIA）與比較方法（CLIFT）相比，Kappa值均大于0.8，表明一致性非常高，也就是3個方法檢測結果的符合度較高。如表 3所示，如果特異度設定為95.0%，ELISA的截斷值將調整為50 U/mL，靈敏度為58.1%；CLIA的截斷值將調整為22 U/mL，靈敏度為60.5%，此時2個方法的靈敏度差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，通過本次研究，我們發現，4種方法對SLE的診斷效能取決于方法學本身以及所使用的截斷值，總體來說，4種方法檢測一致性較高，均可用于臨床實驗室診斷。
CLIFT是國內最早用于抗dsDNA抗體檢測的實驗方法，迄今已有近20年歷史，也是目前臨床上使用最廣泛的方法之一。CLIFT具有特異性高、結果直觀等優點，但也存在操作繁瑣、耗時較長、需要檢驗師有大量的臨床經驗、價格昂貴、需要熒光顯微鏡等高端設備的缺點，難以在中小型臨床實驗室推廣。隨著對自身抗體研究的不斷深入，ELISA和LIA的方法應運而生，因其操作簡便、快速、價廉、診斷效能較高、無需大量臨床經驗等優點而迅速為臨床實驗室所接受，尤其是檢驗力量較為薄弱的中小型實驗室。CLIA是近年來發展起來的具有高特異度、自動化等特點的方法，也存在需要特殊設備和價格高昂等缺點，目前主要應用于三級以上醫院的臨床實驗室。
綜上所述，CLIFT、ELISA、LIA和CLIA 4種方法均可用于檢測抗dsDNA抗體，檢測結果的一致性高，對SLE的診斷效能與方法學本身和所使用的截斷值相關。CLIFT和CLIA主要用于具有高水平檢驗師的三級以上醫院臨床實驗室，而ELISA、LIA的方法既可以用于對大型實驗室CLIFT和CLIA的補充，又便于中小型實驗室的推廣使用。只有建立了這樣的方法學分層體系，才能促進各級臨床實驗室提高對自身免疫性疾病的診斷水平，從而促進整個風濕免疫學科的進步和發展。
抗雙鏈DNA（dsDNA）抗體自1957年被首次發現以來，一直被公認為系統性紅斑狼瘡（SLE）的診斷標志物，也是監測SLE疾病活動度的優良指標[1]，其水平升高通常先于病情加重（有時超過2年）[2]。目前臨床上用于抗dsDNA抗體檢測的方法主要有綠蠅短膜蟲間接熒光免疫法（CLIFT）、酶聯免疫吸附法（ELISA）、線性免疫分析法（LIA）和化學發光免疫分析法（CLIA）。本研究旨在通過臨床診斷試驗，評價這4種方法檢測抗dsDNA抗體對SLE疾病的診斷效能，現報告如下。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選擇2012年7月－2013年6月來我院就診的86例SLE患者（SLE組）、62例其他自身免疫性疾病患者（OAID組）和30例健康體檢者（對照組）為研究對象。SLE患者的診斷參照中華醫學會風濕病學分會于2010年發布的《系統性紅斑狼瘡診斷及治療指南》[3]，其中男6例，女80例；年齡16～73歲，平均35歲；發病年齡（26.3 ± 10.5）歲；初診34例，復診52例。其他自身免疫性疾病患者的診斷同樣參照2010年中華醫學會風濕病學分會發布的診療指南，其中男17例，女45例；年齡18～69歲，平均42歲；發病年齡（31.5 ± 18.7）歲；包括類風濕關節炎30例，干燥綜合征19例，混合性結締組織病10例，系統性硬化癥2例，多肌炎1例。對照組男8例，女22例，年齡18～50歲，平均38歲。兩組患者臨床特征見表 1。
表1
兩組患者臨床特征比較[例（%）]
1.2 方法
1.2.1 標本采集
在研究對象門診就診時，即用紅頭管（美國BD公司產品）采集3～4 mL靜脈血，靜置30 min后以2 500 r/min離心10 min，收集血清凍存于?80 ℃冰箱中待用。
1.2.2 儀器和試劑
CLIFT：采用EUROStarⅢ plus熒光顯微鏡及IIF-dsDNA試劑盒，均來自德國歐蒙醫學實驗診斷股份公司，截斷值：1+。LIA：采用XD236自動蛋白印跡儀（上海迅達醫療儀器有限公司），試劑盒：ANA-12H試劑盒（四川新健康成生物股份有限公司），截斷值：≥cutoff帶。ELISA：采用ST-360酶標儀、ST-36W洗板機（上海科華生物工程股份有限公司），試劑盒：ELISA-dsDNA試劑盒（四川新健康成生物股份有限公司），截斷值：30 U/mL。CLIA：采用LIAISON全自動化學發光儀及其CLIA-dsDNA試劑盒（意大利索靈公司），截斷值：25 U/mL。本室采用的截斷值與廠家提供的截斷值相同。
1.2.3 實驗操作
將待測標本進行室溫復溶，嚴格按照試劑盒操作說明書進行實驗。
1.3 統計學方法
采用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析。4種方法檢測抗dsDNA抗體對SLE的診斷靈敏度和特異度分析采用四格表分類計算。4種方法檢測抗dsDNA抗體對SLE診斷的一致性比較采用Kappa一致性分析。設定特異度為95.0%時，ELISA和CLIA靈敏度的比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 各方法檢測抗dsDNA抗體對SLE的診斷靈敏度和特異度分析
以廠家提供的截斷值為判斷標準，4種方法中，ELISA的靈敏度最高（67.4%），而CLIA的特異度最高（95.6%），診斷效能從高到低依次為ELISA、CLIA、CLIFT和LIA。見表 2。
表2
各方法檢測dsDNA抗體對SLE的診斷效能分析表
2.2 各方法檢測抗dsDNA抗體對SLE診斷一致性
以CLIFT為比較方法，其他3種實驗方法與比較方法相比，Kappa值均＞0.8，表明一致性非常好。見表 3。
表3
各方法的診斷一致性
2.3 設定診斷特異度為95.0%時ELISA和CLIA的靈敏度比較
如果特異度設定為95.0%，ELISA的截斷值將調整為50 U/mL，靈敏度為58.1%；CLIA的截斷值將調整為22 U/mL，靈敏度為60.5%。2種方法的靈敏度差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 4。
表4
設定特異度為95%時ELISA和CLIA的診斷靈敏度比較
3 討論
SLE是臨床上最常見的、復雜的和高度異質性的自身免疫性疾病之一。免疫失調導致了自身抗體和免疫復合物過量生產和補體過量活化，與SLE患者體內潛在的組織炎癥一起，共同導致多器官受累的臨床綜合征，因此，SLE已成為臨床診斷和治療的最大挑戰之一[4, 5]。早期診斷和治療對于延緩病情進展、保護器官功能、改善預后和提高生存率都至關重要。在過去的幾十年里，醫學工作者投入巨大的熱情和努力，致力于SLE的發病機制、診斷標志物和治療藥物的研究，盡管已取得重大進展，但仍有許多難題尚待解決[4]。傳統的生物標志物包括抗核抗體、抗dsDNA抗體、抗Sm抗體、抗RNP抗體、抗Ro/SSA抗體等[6]，最新的研究進展顯示，Fc受體基因、補體C4d結合紅細胞、CD27漿細胞、干擾素指紋和抗C1q抗體等都是SLE特異的生物標志物[7]。
盡管如此，抗dsDNA抗體仍是臨床上使用最為廣泛、最經典的SLE特異標志物。目前臨床上用于抗dsDNA抗體檢測的方法主要有CLIFT、ELISA、LIA、CLIA和放射免疫法[8]。關于幾種方法檢測抗dsDNA抗體的效能比較，已有較多臨床報道[9-11]，總體來說，雖然這幾種方法的診斷效能有所差異，但總體符合度較高，均適用于SLE患者的臨床診斷。
本研究通過對86例SLE患者、62例其他自身免疫性疾病患者和30例健康體檢者的比較分析，驗證了CLIFT、ELISA、LIA和CLIA 4種方法對SLE診斷效能的差異，總體結論與國外報道基本相符[9-13]。從表 2中可以看到，4種方法對SLE的診斷靈敏度和特異度分別為58.1%和88.0%（CLIFT）、67.4%和90.2%（ELISA）、54.7%和85.9%（LIA）、55.8%和95.6%（CLIA），診斷效能從高到低依次為ELISA、CLIA、CLIFT和LIA，其中以ELISA法的靈敏度最高（67.4%），而CLIA法的特異度最高（95.6%）。Janyapoon等[14]研究顯示，ELISA法與CLIFT法相比，特異度相當，而靈敏度更高。Yang等[15]通過對6種試劑盒的比較研究發現，Human公司的ELISA試劑盒靈敏度顯著高于其他5種試劑盒（Salmon和Plasmid的ELISA試劑盒、CLIFT、CLIA、LIA），而Salmon-ELISA和LIA的特異度最低，這與本研究結果相同。從4種方法的檢測一致性結果來看，3種實驗方法（ELISA、LIA、CLIA）與比較方法（CLIFT）相比，Kappa值均大于0.8，表明一致性非常高，也就是3個方法檢測結果的符合度較高。如表 3所示，如果特異度設定為95.0%，ELISA的截斷值將調整為50 U/mL，靈敏度為58.1%；CLIA的截斷值將調整為22 U/mL，靈敏度為60.5%，此時2個方法的靈敏度差異無統計學意義（P＞0.05）。因此，通過本次研究，我們發現，4種方法對SLE的診斷效能取決于方法學本身以及所使用的截斷值，總體來說，4種方法檢測一致性較高，均可用于臨床實驗室診斷。
CLIFT是國內最早用于抗dsDNA抗體檢測的實驗方法，迄今已有近20年歷史，也是目前臨床上使用最廣泛的方法之一。CLIFT具有特異性高、結果直觀等優點，但也存在操作繁瑣、耗時較長、需要檢驗師有大量的臨床經驗、價格昂貴、需要熒光顯微鏡等高端設備的缺點，難以在中小型臨床實驗室推廣。隨著對自身抗體研究的不斷深入，ELISA和LIA的方法應運而生，因其操作簡便、快速、價廉、診斷效能較高、無需大量臨床經驗等優點而迅速為臨床實驗室所接受，尤其是檢驗力量較為薄弱的中小型實驗室。CLIA是近年來發展起來的具有高特異度、自動化等特點的方法，也存在需要特殊設備和價格高昂等缺點，目前主要應用于三級以上醫院的臨床實驗室。
綜上所述，CLIFT、ELISA、LIA和CLIA 4種方法均可用于檢測抗dsDNA抗體，檢測結果的一致性高，對SLE的診斷效能與方法學本身和所使用的截斷值相關。CLIFT和CLIA主要用于具有高水平檢驗師的三級以上醫院臨床實驗室，而ELISA、LIA的方法既可以用于對大型實驗室CLIFT和CLIA的補充，又便于中小型實驗室的推廣使用。只有建立了這樣的方法學分層體系，才能促進各級臨床實驗室提高對自身免疫性疾病的診斷水平，從而促進整個風濕免疫學科的進步和發展。
