引用本文： 王雪萍, 劉輝. RAS相關區域家族1A基因在外陰癌中的表達及其意義. 華西醫學, 2014, 29(7): 1263-1266. doi: 10.7507/1002-0179.20140387 復制
外陰癌是一種較少見的婦科惡性腫瘤，占女性生殖系統惡性腫瘤的6%～8%，占婦女惡性腫瘤的1%[1]。近年來外陰癌的發病率有上升趨勢，在發達國家中，發病率為2/10萬[2]。RAS相關區域家族（RASSF）包括10個成員[3]，RASSF1A是從3號染色體短臂克隆出來的一種新型抑癌基因。研究發現多種婦科腫瘤的發生與RASSF1A的表達缺失有密切關系。大量國內外文獻報道RASSF1A基因表達缺失與宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌的發生發展有密切關系，但其與外陰癌發生、發展的關系尚不清楚[4-9]。外陰癌組織中RASSF1A基因表達情況的研究甚少，國內外文獻無相關報道。本研究采用免疫組織化學技術鏈霉柔和素-生物素復合物（SABC）法檢測外陰正常組織、外陰上皮內瘤變及外陰癌組織中RASSF1A蛋白的表達的情況，旨在初步探索RASSF1A基因在外陰癌發生、發展中所起的作用，為進一步的研究奠定基礎。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2008年1月－2010年12月在我院住院治療的外陰鱗狀細胞癌患者35例，患者年齡23～82歲，平均50歲。手術病理分期及病理分級分別按照國際婦產科聯盟（FIGO）2000年分期標準和WHO分級標準，其中Ⅰ期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期10例，ⅣA期2例；高分化19例，中分化13例，低分化3例。選取同期于本院就診的外陰上皮內瘤變患者12例，患者年齡20～73歲，平均45歲，其中VINⅠ3例，VINⅡ8例，VINⅢ 1例；另選取因反復外陰瘙癢活體組織檢查證實為正常外陰組織患者9例，患者年齡26～66歲，平均42歲。所有病例術前均未接受過放射、化學療法，診斷均經2位病理專家復核確認。
1.2 標本及主要試劑
1.2.1 標本收集與處理
手術及活檢標本均在離體后30 min內置于?80℃保存。
1.2.2 主要試劑
RASSF1（N-15）sc-18722多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒（SA1023-IgG）（武漢博士德生物工程有限公司）；二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（AR1022）（武漢博士德生物工程有限公司），其余試劑均為國產分析純級產品，由我院實驗中心提供。
1.3 方法
將標本制成石蠟切片，取4 μm的石蠟連續切片3張，分別用于：免疫組織化學染色、蘇木精-伊紅（HE）染色、空白對照。免疫組織化學染色參照SABC免疫組織化學染色試劑盒說明書進行，依次經二甲苯脫蠟、梯度乙醇化、過氧化氫處理、熱修復抗原、血清封閉、滴加RASSF1多克隆抗體（1︰50），4℃過夜，加入二抗、加入SABC、DAB顯色、蘇木素輕度復染、脫水、透明，封片，顯微鏡觀察。
1.4 結果判讀
采用雙盲法，由2位經驗豐富的病理科醫師判讀結果。用已知的RASSF1A基因表達陽性的結腸癌切片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，以細胞質和（或）細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性細胞。染色結果采用半定量的判讀方法，在400倍視野下隨機選取5個區域，計算陽性細胞百分率并計分如下：① 0分，＜5%；② 1分，5%～25%；③ 2分，26%～50%；④ 3分，51%～75%；⑤ 4分，＞75%。同時觀察各個區域組織染色強度并計分如下：① 1分，淺黃色（弱陽性）；② 2分，黃色（陽性）；③ 3分，棕褐色（強陽性）。將陽性細胞百分率計分與染色強度計分相乘，即為該組織的染色積分。
1.5 統計學方法
用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。采用成組設計的方差分析，分析外陰組織各組之間，外陰癌組織的各個年齡組之間，外陰癌各個分期之間以及各個分級之間的染色積分差異，檢驗水準雙側α=0.05。采用成組設計t檢驗分析外陰鱗癌有無淋巴結受累及不同癌灶部位（中線型和側位型）的染色積分差異，檢驗水準雙側α=0.05。
2 結果
2.1 RASSF1A蛋白在外陰正常組織、外陰上皮內瘤變組織和癌組織中的表達及定位
RASSF1A蛋白主要表達在細胞質和（或）細胞膜，在外陰正常組織和外陰上皮內瘤變組織呈陽性或強陽性（圖 1、2）表達，外陰癌組織呈弱陽性表達或陰性表達（圖 3）。
圖1
外陰正常組織免疫組織化學染色病理切片可見RASSF1A蛋白表達呈強陽性（SABC ×400） ? ?圖 2 外陰上皮內瘤變組織免疫組織化學染色病理切片可見RASSF1A蛋白表達呈強陽性（SABC ×400） ? ? 圖 3外陰癌組織免疫組織化學染色病理切片可見RASSF1A蛋白表達呈陰性（SABC ×400）
外陰正常組織、外陰上皮內瘤變組織、外陰癌組織，RASSF1A蛋白表達的染色積分分別為（9.89 ± 2.20）、（5.75 ± 3.17）、（1.00 ± 1.45）分，外陰正常組織、外陰上皮內瘤變組織、癌組織兩兩相比，RASSF1A蛋白的表達差異有統計學意義（P＜0.001）。
2.2 RASSF1A蛋白的表達與外陰癌臨床病理特征的關系
外陰癌的不同年齡、分級、分期、有無淋巴結受累、不同癌灶部位RASSF1A蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。
表1
不同年齡、分級、分期、有無淋巴結受累、不同癌灶部位RASSF1A表達評分的比較
3 討論
2000年，Dammann等[10]在非小細胞肺癌的研究中，采用酵母雙相雜交篩選法在3P21.3區一個長約120 kb的區域內克隆獲得RASSF1A基因，并證實其在非小細胞肺癌的發病中扮演了抑癌基因的角色。眾多研究表明RASSF1A基因在所有正常組織中均表達，但在絕大多數惡性腫瘤組織中卻表達缺失[11, 12]。近年來研究發現多種婦科腫瘤的發生與RASSF1A基因過甲基化表達缺失有密切關系[13, 14]。RASSF1A基因作為抑癌基因的作用機制目前尚不明確，但RASSF1A可能就是編碼Ras促進細胞凋亡作用的有效蛋白，它的缺失或失活破壞了Ras的平衡作用，導致細胞的惡性轉換[15]。
本研究顯示，外陰癌中存在較高的RASSF1A蛋白表達缺失，外陰癌組織中RASSF1A蛋白表達水平與外陰上皮內瘤變、外陰正常組織中相比差異有統計學意義（P＜0.05），提示RASSF1A基因可能是外陰癌發生的重要相關抑癌基因，蛋白表達缺失而喪失了對外陰癌的抑制作用。研究還發現，RASSF1A蛋白表達缺失與外陰癌的手術病理分期、病理分級及淋巴結轉移無明顯相關（P＞0.05），提示RASSF1A蛋白的表達可能與外陰癌的進展無明顯相關性。但在大多數的外陰癌早期患者，RASSF1A蛋白的表達明顯減弱或缺失，提示RASSF1A基因的失活在外陰癌的發生中可能是早期事件。另外，在外陰癌的所有病理類型中，最常見的外陰鱗癌，約占到90%左右。而我們的研究中，納入的均為鱗癌，無其他病理類型，尚不知RASSF1A基因的蛋白表達水平與外陰癌的病理分型有無相關性的結論。外陰鱗癌多發生于大小陰唇，即側位型，而腫瘤位于陰蒂、后聯合及會陰體者為中線型。本研究中兩者相比RASSF1A蛋白的表達差異無統計學意義（P=0.778），提示RASSF1A蛋白的表達與外陰癌的癌灶部位無明顯的相關性。
目前研究表明RASSF1A基因表達缺失是由于RASSF1A基因啟動子區域過度甲基化，而導致mRNA及蛋白表達的缺失[16]。而基因甲基化是一個可逆的過程，目前已有研究表明，去甲基化藥物可以使RASSF1A重新表達[17]，應用于子宮內膜癌細胞系中可以起到抑制腫瘤細胞生長的作用[18] 。如果用去甲基化藥物后外陰癌中RASSF1A基因也能重新表達，則可能起到治療外陰癌的目的，但尚需進一步研究明確機制。
外陰癌是一種較少見的婦科惡性腫瘤，占女性生殖系統惡性腫瘤的6%～8%，占婦女惡性腫瘤的1%[1]。近年來外陰癌的發病率有上升趨勢，在發達國家中，發病率為2/10萬[2]。RAS相關區域家族（RASSF）包括10個成員[3]，RASSF1A是從3號染色體短臂克隆出來的一種新型抑癌基因。研究發現多種婦科腫瘤的發生與RASSF1A的表達缺失有密切關系。大量國內外文獻報道RASSF1A基因表達缺失與宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌的發生發展有密切關系，但其與外陰癌發生、發展的關系尚不清楚[4-9]。外陰癌組織中RASSF1A基因表達情況的研究甚少，國內外文獻無相關報道。本研究采用免疫組織化學技術鏈霉柔和素-生物素復合物（SABC）法檢測外陰正常組織、外陰上皮內瘤變及外陰癌組織中RASSF1A蛋白的表達的情況，旨在初步探索RASSF1A基因在外陰癌發生、發展中所起的作用，為進一步的研究奠定基礎。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2008年1月－2010年12月在我院住院治療的外陰鱗狀細胞癌患者35例，患者年齡23～82歲，平均50歲。手術病理分期及病理分級分別按照國際婦產科聯盟（FIGO）2000年分期標準和WHO分級標準，其中Ⅰ期4例，Ⅱ期19例，Ⅲ期10例，ⅣA期2例；高分化19例，中分化13例，低分化3例。選取同期于本院就診的外陰上皮內瘤變患者12例，患者年齡20～73歲，平均45歲，其中VINⅠ3例，VINⅡ8例，VINⅢ 1例；另選取因反復外陰瘙癢活體組織檢查證實為正常外陰組織患者9例，患者年齡26～66歲，平均42歲。所有病例術前均未接受過放射、化學療法，診斷均經2位病理專家復核確認。
1.2 標本及主要試劑
1.2.1 標本收集與處理
手術及活檢標本均在離體后30 min內置于?80℃保存。
1.2.2 主要試劑
RASSF1（N-15）sc-18722多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；即用型SABC免疫組織化學染色試劑盒（SA1023-IgG）（武漢博士德生物工程有限公司）；二氨基聯苯胺（DAB）顯色試劑盒（AR1022）（武漢博士德生物工程有限公司），其余試劑均為國產分析純級產品，由我院實驗中心提供。
1.3 方法
將標本制成石蠟切片，取4 μm的石蠟連續切片3張，分別用于：免疫組織化學染色、蘇木精-伊紅（HE）染色、空白對照。免疫組織化學染色參照SABC免疫組織化學染色試劑盒說明書進行，依次經二甲苯脫蠟、梯度乙醇化、過氧化氫處理、熱修復抗原、血清封閉、滴加RASSF1多克隆抗體（1︰50），4℃過夜，加入二抗、加入SABC、DAB顯色、蘇木素輕度復染、脫水、透明，封片，顯微鏡觀察。
1.4 結果判讀
采用雙盲法，由2位經驗豐富的病理科醫師判讀結果。用已知的RASSF1A基因表達陽性的結腸癌切片作陽性對照，用磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照，以細胞質和（或）細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性細胞。染色結果采用半定量的判讀方法，在400倍視野下隨機選取5個區域，計算陽性細胞百分率并計分如下：① 0分，＜5%；② 1分，5%～25%；③ 2分，26%～50%；④ 3分，51%～75%；⑤ 4分，＞75%。同時觀察各個區域組織染色強度并計分如下：① 1分，淺黃色（弱陽性）；② 2分，黃色（陽性）；③ 3分，棕褐色（強陽性）。將陽性細胞百分率計分與染色強度計分相乘，即為該組織的染色積分。
1.5 統計學方法
用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。采用成組設計的方差分析，分析外陰組織各組之間，外陰癌組織的各個年齡組之間，外陰癌各個分期之間以及各個分級之間的染色積分差異，檢驗水準雙側α=0.05。采用成組設計t檢驗分析外陰鱗癌有無淋巴結受累及不同癌灶部位（中線型和側位型）的染色積分差異，檢驗水準雙側α=0.05。
2 結果
2.1 RASSF1A蛋白在外陰正常組織、外陰上皮內瘤變組織和癌組織中的表達及定位
RASSF1A蛋白主要表達在細胞質和（或）細胞膜，在外陰正常組織和外陰上皮內瘤變組織呈陽性或強陽性（圖 1、2）表達，外陰癌組織呈弱陽性表達或陰性表達（圖 3）。
圖1
外陰正常組織免疫組織化學染色病理切片可見RASSF1A蛋白表達呈強陽性（SABC ×400） ? ?圖 2 外陰上皮內瘤變組織免疫組織化學染色病理切片可見RASSF1A蛋白表達呈強陽性（SABC ×400） ? ? 圖 3外陰癌組織免疫組織化學染色病理切片可見RASSF1A蛋白表達呈陰性（SABC ×400）
外陰正常組織、外陰上皮內瘤變組織、外陰癌組織，RASSF1A蛋白表達的染色積分分別為（9.89 ± 2.20）、（5.75 ± 3.17）、（1.00 ± 1.45）分，外陰正常組織、外陰上皮內瘤變組織、癌組織兩兩相比，RASSF1A蛋白的表達差異有統計學意義（P＜0.001）。
2.2 RASSF1A蛋白的表達與外陰癌臨床病理特征的關系
外陰癌的不同年齡、分級、分期、有無淋巴結受累、不同癌灶部位RASSF1A蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。
表1
不同年齡、分級、分期、有無淋巴結受累、不同癌灶部位RASSF1A表達評分的比較
3 討論
2000年，Dammann等[10]在非小細胞肺癌的研究中，采用酵母雙相雜交篩選法在3P21.3區一個長約120 kb的區域內克隆獲得RASSF1A基因，并證實其在非小細胞肺癌的發病中扮演了抑癌基因的角色。眾多研究表明RASSF1A基因在所有正常組織中均表達，但在絕大多數惡性腫瘤組織中卻表達缺失[11, 12]。近年來研究發現多種婦科腫瘤的發生與RASSF1A基因過甲基化表達缺失有密切關系[13, 14]。RASSF1A基因作為抑癌基因的作用機制目前尚不明確，但RASSF1A可能就是編碼Ras促進細胞凋亡作用的有效蛋白，它的缺失或失活破壞了Ras的平衡作用，導致細胞的惡性轉換[15]。
本研究顯示，外陰癌中存在較高的RASSF1A蛋白表達缺失，外陰癌組織中RASSF1A蛋白表達水平與外陰上皮內瘤變、外陰正常組織中相比差異有統計學意義（P＜0.05），提示RASSF1A基因可能是外陰癌發生的重要相關抑癌基因，蛋白表達缺失而喪失了對外陰癌的抑制作用。研究還發現，RASSF1A蛋白表達缺失與外陰癌的手術病理分期、病理分級及淋巴結轉移無明顯相關（P＞0.05），提示RASSF1A蛋白的表達可能與外陰癌的進展無明顯相關性。但在大多數的外陰癌早期患者，RASSF1A蛋白的表達明顯減弱或缺失，提示RASSF1A基因的失活在外陰癌的發生中可能是早期事件。另外，在外陰癌的所有病理類型中，最常見的外陰鱗癌，約占到90%左右。而我們的研究中，納入的均為鱗癌，無其他病理類型，尚不知RASSF1A基因的蛋白表達水平與外陰癌的病理分型有無相關性的結論。外陰鱗癌多發生于大小陰唇，即側位型，而腫瘤位于陰蒂、后聯合及會陰體者為中線型。本研究中兩者相比RASSF1A蛋白的表達差異無統計學意義（P=0.778），提示RASSF1A蛋白的表達與外陰癌的癌灶部位無明顯的相關性。
目前研究表明RASSF1A基因表達缺失是由于RASSF1A基因啟動子區域過度甲基化，而導致mRNA及蛋白表達的缺失[16]。而基因甲基化是一個可逆的過程，目前已有研究表明，去甲基化藥物可以使RASSF1A重新表達[17]，應用于子宮內膜癌細胞系中可以起到抑制腫瘤細胞生長的作用[18] 。如果用去甲基化藥物后外陰癌中RASSF1A基因也能重新表達，則可能起到治療外陰癌的目的，但尚需進一步研究明確機制。
