引用本文： 崔艷, 曹小平. 有機磷農藥中毒致Sprague-Dawley大鼠急性肺損傷的實驗研究. 華西醫學, 2014, 29(6): 1025-1028. doi: 10.7507/1002-0179.20140313 復制
有機磷農藥是目前使用最廣泛的農藥。有機磷農藥中毒居各種農藥中毒之首，在一些發展中國家甚至占所有農藥中毒的80% [1]，是急診科常見的急危重癥之一。急性有機磷農藥中毒（AOPP）患者發病急驟，常并發肺損傷。肺水腫是重度AOPP患者最常見的并發癥[2]。有機磷農藥中毒時，在臨床表現、治療及預后中占主要地位的是呼吸系統，但對于呼吸衰竭的治療效果目前并不樂觀[3]。近年來研究發現非膽堿能機制在臟器損傷過程中的作用明顯，大量的研究表明，細胞因子在AOPP肺水腫的發生過程中起重要作用[4]。有研究顯示，AOPP大鼠血清及肺組織腫瘤壞死因子-α表達增高，且表達程度與肺損傷程度呈正相關[5]。AOPP時，機體同時存在促炎和抗炎反應，炎癥介質與抗炎介質的過度釋放及二者之間的失衡是AOPP引起多器官功能障礙的重要機制之一[6]。Ansaldi等[7]認為，核轉錄因子-κB（NF-κB）的活化是炎癥反應的中心環節，并參與了肺部疾病的病理過程。目前AOPP的治療主要包括毒物的清除、解毒劑的應用、對癥支持治療等。本實驗通過測定氧化樂果中毒Sprague-Dawley（SD）大鼠血清NF-κB的濃度、肺組織NF-κB表達水平、肺系數，探討有機磷農藥中毒致大鼠肺損傷的機制，為AOPP的治療提供新的靶點。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
選擇健康雄性清潔級SD大鼠（6周齡）96只，體質量200～250 g，由川北醫學院實驗動物中心提供。
1.2 主要材料與儀器
實驗試劑與藥品：40%氧化樂果乳液[重慶農藥（化工）集團有限公司]，大鼠NF-κB（ELISA）試劑盒（上海卡努生物有限公司），兔抗NF-κB（英國abcam公司），兔二步法檢測試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）。
實驗器材：ThermoFisher Sorvall ST 16R離心機（美國賽默飛世爾科技公司），YP6000N電子天平（上海雙旭電子有限公司，精度1 g），BMJ-A包埋機（常州市中咸電子儀器有限公司），徠卡1900冷凍切片機（德國徠卡公司），Olympus DP71顯微鏡照相系統（日本Olympus公司），KHB ST-360酶標儀（上海科華實驗系統有限公司），恒溫箱（重慶永恒實驗儀器廠），MDF-382E（N）深低溫冰箱（日本三洋公司）。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組及模型制備
將大鼠隨機分為兩組，A組為對照組，B組為染毒組，每組各48只。A組灌胃注射無菌生理鹽水，為保證與B組灌胃體積等容，以公式0.011 2 mL/g×體質量（g）計算灌胃體積（mL）。將B組以0.4%氧化樂果乳液工作液（40%氧化樂果乳液1 mL加99 mL生理鹽水稀釋而成）以45 mg/kg灌胃染毒建立AOPP模型，以公式0.011 2 mL/g×體質量（g）計算灌胃體積。B組以出現流涎、肌顫、呼吸困難、步態不穩為標準選擇AOPP模型，剔除中毒不明顯以及死亡個體。將實驗過程分為染毒后30 min及3、6、12、24、48 h。
1.3.2 留取標本
在對應時間點分別于各組隨機抽取6只大鼠，用1%的戊巴比妥鈉（1 g戊巴比妥鈉溶于100 mL生理鹽水）按5 mg/100 g麻醉大鼠后，分離腹主動脈，抽取全血，4℃靜置3 h自然凝固，然后高速冷凍離心機3 000 r/min離心5 min，小心提取上層血清放置-80℃冰箱內備用；用頸椎脫臼法處死大鼠，打開胸腔，取出肺組織，用生理鹽水沖去表面血跡后用濾紙擦干并稱質量，肺組織按1 cm×1 cm×1 cm取材后用4%多聚甲醛固定。
1.3.3 檢測指標
肺系數測定公式：肺系數=肺濕質量（g）/體質量（g）×100%。肺組織脫水，包埋，切片后用蘇木精-伊紅（HE）染色并觀察肺泡、肺間質形態學改變。用免疫組織化學法測肺組織NF-κB水平，于200倍光學顯微鏡下拍照，圖片中棕黃色代表NF-κB，主要位于細胞核內，細胞質中也可有少量表達，肺組織中NF-κB越高，棕黃色部分著色越深。用IPP 6.0軟件分析圖片吸光度（舊稱光密度），用吸光度值代表肺組織的NF-κB水平。所有標本采集完畢后，將血清標本凍融，用酶聯免疫吸附試驗法測定血清NF-κB濃度。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差表示，用隨機區組設計的方差分析比較兩組大鼠的血清NF-κB濃度、肺NF-κB水平、肺系數，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 灌胃后兩組大鼠的反應
A組大鼠在整個實驗過程中無異常反應，除處死大鼠外無死亡個體。B組大鼠在氧化樂果灌胃后15 min左右開始出現有機磷殺蟲劑中毒癥狀：流涎，肌肉顫動，呼吸急促，步態不穩，腹瀉，B組共死亡大鼠8只。死亡大鼠視為造模不成功，剔除實驗。
2.2 肺組織光學顯微鏡下的病理改變
A組大鼠各時間點肺組織切片均正常。B組大鼠于染毒后30 min肺組織開始出現肺間質充血，肺泡間隔增寬，局部可見肺泡內紅細胞聚集，并逐漸加重，至12 h，病變達到高峰，24～48 h病變逐漸減輕，但未完全恢復正常。見圖 1、2。
圖1
A組大鼠生理鹽水灌胃后不同時間肺組織光學顯微鏡下病理表現（HE×200） 1a. 灌胃后30 min 1b. 灌胃后3 h 1c. 灌胃后6 h 1d. 灌胃后12 h 1e. 灌胃后24 h 1f. 灌胃后48 h ? ?圖 2 B組大鼠氧化樂果灌胃后不同時間肺組織光學顯微鏡下病理表現（HE×200） 2a. 灌胃后30 min 2b. 灌胃后3 h 2c. 灌胃后6 h 2d. 灌胃后12 h2e. 灌胃后24 h 2f. 灌胃后48 h
2.3 肺系數、血清NF-κB濃度與肺組織NF-κB表達水平的變化
A、B兩組大鼠肺系數、血清NF-κB濃度及肺組織NF-κB水平的比較差異有統計學意義，B組高于A組（P＜0.01）。見表 1，圖 3～5。
表1
大鼠肺系數、血清NF-κB濃度與肺組織NF-κB表達水平的比較（n=36，
圖3
兩組大鼠各時點肺系數條形圖
圖4
兩組大鼠各時點血清NF-κB濃度條形圖
圖5
兩組大鼠各時點肺組織NF-κB表達水平條形圖
3 討論
有機磷殺蟲劑是目前農業生產中使用最廣泛的殺蟲劑，由于其在生產、運輸及使用時的不當可造成有機磷急慢性中毒。AOPP是臨床急診中的常見病例，占急性中毒的49.1%，占中毒死亡人數的83.6% [8]。重癥AOPP患者多合并多器官功能障礙，肺往往是最早受累的器官。有文獻報道AOPP患者急性肺水腫發生率為20%～30% [9]。呼吸衰竭為AOPP患者最重要的死亡原因。亞洲地區重癥監護病房的AOPP患者后期多數死于肺水腫和呼吸衰竭[10]。
AOPP的主要機制是有機磷抑制膽堿酯酶活性，使乙酰膽堿過度堆積，從而引起中樞神經系統及膽堿能神經一系列癥狀體征。近年來研究發現非膽堿能機制在臟器損傷過程中的作用更明顯，且更為復雜。細胞因子在AOPP肺水腫的發生過程中起重要作用[11]。NF-κB是一類轉錄因子，在正常情況下，絕大多數NF-κB以無活性的形式存在于細胞質中，當細胞受到各種因素刺激后，NF-κB與其抑制蛋白IκB分離后而激活，NF-κB轉位進入細胞核內與靶基因NF-κB結合位點相結合，迅速誘導靶基因mRNA的合成及相應蛋白質的合成，從而參與感染、炎癥、免疫反應、生長等過程的調節，參與各種疾病的病理生理過程[12]。
本實驗采用氧化樂果灌胃染毒建立AOPP動物模型，染毒大鼠肺組織HE染色發現肺間質充血水腫，肺泡間隔增寬或斷裂、肺泡內紅細胞聚集，肺系數較對照組明顯增高，表明染毒SD大鼠存在確切的肺損傷。研究結果顯示染毒組大鼠血清NF-κB濃度、肺組織NF-κB表達水平明顯增高，且與對照組比較，差異具有統計學意義（P＜0.01），表明NF-κB在AOPP致肺損傷中起重要作用。
綜上所述，NF-κB是有機磷農藥中毒致肺損傷的重要因子之一，可以作為臨床治療AOPP的新靶點，這為臨床治療AOPP提供了新的思路。
有機磷農藥是目前使用最廣泛的農藥。有機磷農藥中毒居各種農藥中毒之首，在一些發展中國家甚至占所有農藥中毒的80% [1]，是急診科常見的急危重癥之一。急性有機磷農藥中毒（AOPP）患者發病急驟，常并發肺損傷。肺水腫是重度AOPP患者最常見的并發癥[2]。有機磷農藥中毒時，在臨床表現、治療及預后中占主要地位的是呼吸系統，但對于呼吸衰竭的治療效果目前并不樂觀[3]。近年來研究發現非膽堿能機制在臟器損傷過程中的作用明顯，大量的研究表明，細胞因子在AOPP肺水腫的發生過程中起重要作用[4]。有研究顯示，AOPP大鼠血清及肺組織腫瘤壞死因子-α表達增高，且表達程度與肺損傷程度呈正相關[5]。AOPP時，機體同時存在促炎和抗炎反應，炎癥介質與抗炎介質的過度釋放及二者之間的失衡是AOPP引起多器官功能障礙的重要機制之一[6]。Ansaldi等[7]認為，核轉錄因子-κB（NF-κB）的活化是炎癥反應的中心環節，并參與了肺部疾病的病理過程。目前AOPP的治療主要包括毒物的清除、解毒劑的應用、對癥支持治療等。本實驗通過測定氧化樂果中毒Sprague-Dawley（SD）大鼠血清NF-κB的濃度、肺組織NF-κB表達水平、肺系數，探討有機磷農藥中毒致大鼠肺損傷的機制，為AOPP的治療提供新的靶點。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
選擇健康雄性清潔級SD大鼠（6周齡）96只，體質量200～250 g，由川北醫學院實驗動物中心提供。
1.2 主要材料與儀器
實驗試劑與藥品：40%氧化樂果乳液[重慶農藥（化工）集團有限公司]，大鼠NF-κB（ELISA）試劑盒（上海卡努生物有限公司），兔抗NF-κB（英國abcam公司），兔二步法檢測試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司）。
實驗器材：ThermoFisher Sorvall ST 16R離心機（美國賽默飛世爾科技公司），YP6000N電子天平（上海雙旭電子有限公司，精度1 g），BMJ-A包埋機（常州市中咸電子儀器有限公司），徠卡1900冷凍切片機（德國徠卡公司），Olympus DP71顯微鏡照相系統（日本Olympus公司），KHB ST-360酶標儀（上海科華實驗系統有限公司），恒溫箱（重慶永恒實驗儀器廠），MDF-382E（N）深低溫冰箱（日本三洋公司）。
1.3 實驗方法
1.3.1 動物分組及模型制備
將大鼠隨機分為兩組，A組為對照組，B組為染毒組，每組各48只。A組灌胃注射無菌生理鹽水，為保證與B組灌胃體積等容，以公式0.011 2 mL/g×體質量（g）計算灌胃體積（mL）。將B組以0.4%氧化樂果乳液工作液（40%氧化樂果乳液1 mL加99 mL生理鹽水稀釋而成）以45 mg/kg灌胃染毒建立AOPP模型，以公式0.011 2 mL/g×體質量（g）計算灌胃體積。B組以出現流涎、肌顫、呼吸困難、步態不穩為標準選擇AOPP模型，剔除中毒不明顯以及死亡個體。將實驗過程分為染毒后30 min及3、6、12、24、48 h。
1.3.2 留取標本
在對應時間點分別于各組隨機抽取6只大鼠，用1%的戊巴比妥鈉（1 g戊巴比妥鈉溶于100 mL生理鹽水）按5 mg/100 g麻醉大鼠后，分離腹主動脈，抽取全血，4℃靜置3 h自然凝固，然后高速冷凍離心機3 000 r/min離心5 min，小心提取上層血清放置-80℃冰箱內備用；用頸椎脫臼法處死大鼠，打開胸腔，取出肺組織，用生理鹽水沖去表面血跡后用濾紙擦干并稱質量，肺組織按1 cm×1 cm×1 cm取材后用4%多聚甲醛固定。
1.3.3 檢測指標
肺系數測定公式：肺系數=肺濕質量（g）/體質量（g）×100%。肺組織脫水，包埋，切片后用蘇木精-伊紅（HE）染色并觀察肺泡、肺間質形態學改變。用免疫組織化學法測肺組織NF-κB水平，于200倍光學顯微鏡下拍照，圖片中棕黃色代表NF-κB，主要位于細胞核內，細胞質中也可有少量表達，肺組織中NF-κB越高，棕黃色部分著色越深。用IPP 6.0軟件分析圖片吸光度（舊稱光密度），用吸光度值代表肺組織的NF-κB水平。所有標本采集完畢后，將血清標本凍融，用酶聯免疫吸附試驗法測定血清NF-κB濃度。
1.4 統計學方法
采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差表示，用隨機區組設計的方差分析比較兩組大鼠的血清NF-κB濃度、肺NF-κB水平、肺系數，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 灌胃后兩組大鼠的反應
A組大鼠在整個實驗過程中無異常反應，除處死大鼠外無死亡個體。B組大鼠在氧化樂果灌胃后15 min左右開始出現有機磷殺蟲劑中毒癥狀：流涎，肌肉顫動，呼吸急促，步態不穩，腹瀉，B組共死亡大鼠8只。死亡大鼠視為造模不成功，剔除實驗。
2.2 肺組織光學顯微鏡下的病理改變
A組大鼠各時間點肺組織切片均正常。B組大鼠于染毒后30 min肺組織開始出現肺間質充血，肺泡間隔增寬，局部可見肺泡內紅細胞聚集，并逐漸加重，至12 h，病變達到高峰，24～48 h病變逐漸減輕，但未完全恢復正常。見圖 1、2。
圖1
A組大鼠生理鹽水灌胃后不同時間肺組織光學顯微鏡下病理表現（HE×200） 1a. 灌胃后30 min 1b. 灌胃后3 h 1c. 灌胃后6 h 1d. 灌胃后12 h 1e. 灌胃后24 h 1f. 灌胃后48 h ? ?圖 2 B組大鼠氧化樂果灌胃后不同時間肺組織光學顯微鏡下病理表現（HE×200） 2a. 灌胃后30 min 2b. 灌胃后3 h 2c. 灌胃后6 h 2d. 灌胃后12 h2e. 灌胃后24 h 2f. 灌胃后48 h
2.3 肺系數、血清NF-κB濃度與肺組織NF-κB表達水平的變化
A、B兩組大鼠肺系數、血清NF-κB濃度及肺組織NF-κB水平的比較差異有統計學意義，B組高于A組（P＜0.01）。見表 1，圖 3～5。
表1
大鼠肺系數、血清NF-κB濃度與肺組織NF-κB表達水平的比較（n=36，
圖3
兩組大鼠各時點肺系數條形圖
圖4
兩組大鼠各時點血清NF-κB濃度條形圖
圖5
兩組大鼠各時點肺組織NF-κB表達水平條形圖
3 討論
有機磷殺蟲劑是目前農業生產中使用最廣泛的殺蟲劑，由于其在生產、運輸及使用時的不當可造成有機磷急慢性中毒。AOPP是臨床急診中的常見病例，占急性中毒的49.1%，占中毒死亡人數的83.6% [8]。重癥AOPP患者多合并多器官功能障礙，肺往往是最早受累的器官。有文獻報道AOPP患者急性肺水腫發生率為20%～30% [9]。呼吸衰竭為AOPP患者最重要的死亡原因。亞洲地區重癥監護病房的AOPP患者后期多數死于肺水腫和呼吸衰竭[10]。
AOPP的主要機制是有機磷抑制膽堿酯酶活性，使乙酰膽堿過度堆積，從而引起中樞神經系統及膽堿能神經一系列癥狀體征。近年來研究發現非膽堿能機制在臟器損傷過程中的作用更明顯，且更為復雜。細胞因子在AOPP肺水腫的發生過程中起重要作用[11]。NF-κB是一類轉錄因子，在正常情況下，絕大多數NF-κB以無活性的形式存在于細胞質中，當細胞受到各種因素刺激后，NF-κB與其抑制蛋白IκB分離后而激活，NF-κB轉位進入細胞核內與靶基因NF-κB結合位點相結合，迅速誘導靶基因mRNA的合成及相應蛋白質的合成，從而參與感染、炎癥、免疫反應、生長等過程的調節，參與各種疾病的病理生理過程[12]。
本實驗采用氧化樂果灌胃染毒建立AOPP動物模型，染毒大鼠肺組織HE染色發現肺間質充血水腫，肺泡間隔增寬或斷裂、肺泡內紅細胞聚集，肺系數較對照組明顯增高，表明染毒SD大鼠存在確切的肺損傷。研究結果顯示染毒組大鼠血清NF-κB濃度、肺組織NF-κB表達水平明顯增高，且與對照組比較，差異具有統計學意義（P＜0.01），表明NF-κB在AOPP致肺損傷中起重要作用。
綜上所述，NF-κB是有機磷農藥中毒致肺損傷的重要因子之一，可以作為臨床治療AOPP的新靶點，這為臨床治療AOPP提供了新的思路。
