引用本文： 蘇云潔, 李熙鴻, 楊欣, 王靜, 屈藝. 膿毒癥對大鼠海馬區caspase-3表達的影響. 華西醫學, 2014, 29(6): 1011-1014. doi: 10.7507/1002-0179.20140309 復制
膿毒癥腦損傷是全身炎癥反應導致的彌漫性腦功能障礙，是兒童重癥監護病房常見的危急重癥[1]。超過50%的膿毒癥患者伴有不同程度的腦損傷[2]。其發病機制可能與氧化應激和炎癥反應所致的細胞凋亡有關[3, 4]。caspase家族是細胞凋亡相關蛋白質，其中，caspase-3是細胞凋亡過程中主要的終末剪切酶。目前關于caspase-3蛋白在膿毒癥腦損傷發病中的作用并不清楚。因此，本研究探討了膿毒癥腦損傷對大鼠海馬區caspase-3蛋白表達的影響，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
80只30日齡健康Wistar雄性大鼠，體質量（110 ±10）g，清潔級，由四川簡陽達碩動物科技有限公司提供（蜀ICP備09003144號）。隨機分為對照組30只，盲腸結扎穿孔（CLP）組50只。所有大鼠在避強光、避噪音、自由獲取飼料和水的環境中飼養。
1.2 主要試劑和儀器
兔抗大鼠caspase-3多抗、小鼠抗大鼠β-actin單抗（美國CST公司），辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），驢抗兔IgG抗體（美國Jackson公司），蛋白定量試劑盒、ECL化學發光試劑盒（美國Millipore公司），封閉用小牛血清白蛋白、胎牛血清、蛋白酶抑制劑Cocktail（瑞士Roche公司）；放射免疫沉淀法裂解液配方：50 mmol/L Tris-HCl（pH值7.4），150 mmol/L NaCl，10 mg/L NP-40，使用前每10毫升裂解液加入10 mg蛋白酶抑制劑Cocktail、水合氯醛（成都科龍化工試劑廠）；BR4i高速冷凍離心機（美國Thermo公司），Varioskan Flash連續波長多功能酶標儀（美國Thermo公司），凝膠成像系統（美國Bio-RAD公司）、震蕩切片機（美國Leica公司），激光共聚焦顯微成像系統（美國Olympus公司）。
1.3 方法
1.3.1 CLP建立膿毒癥模型[5 ]
CLP組：將10%的水合氯醛按照1.0 mL/300 mg腹腔注射于大鼠，待大鼠被麻醉后，用膠布固定于手術臺上，聚維酮碘溶液消毒腹部皮膚，沿腹中線行約2 cm的縱向切口，打開腹腔，找到盲腸，將盲腸內容物輕輕擠向遠端盲腸，在盲腸根部結扎盲腸，用18GG的穿刺針在盲腸根部從腸系膜側向腸系膜游離側穿刺2次，擠出少量糞便至腹腔，回納盲腸至腹腔，保持切口不被糞便污染，逐層縫合腹壁，術畢，按5 mL/100 g皮下注射林格液抗休克。分別于術后6、12、24 h處死大鼠5只，取腦組織，置于-80℃備用。對照組：同樣麻醉之后打開大鼠腹腔，拉出盲腸，但不給予盲腸結扎穿孔，不造成膿毒癥模型，其余處理同CLP組。
1.3.2 大鼠神經行為學評價
兩組在6、12、24 h各時間點分別另取5只大鼠進行神經行為學檢測：包括耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射。采用張麗娜等[6]膿毒癥腦損傷動物模型的鑒定方法，0分為無反射，1分為反射減弱（10 s以內缺乏反射），2分為正常反射，最高評分為10分。
1.3.3 免疫熒光檢測caspase-3蛋白在大鼠大腦海馬區的表達
兩組在術后24 h各取大鼠3只。大鼠經水合氯醛麻醉后置于手術臺上，剪開肋骨暴露心臟，經左心室依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，直至大鼠四肢僵直后開顱取腦。用多聚甲醛4℃固定24～48 h，用現配的4%瓊脂糖包埋組織，震蕩切片。切片經漂洗后用5%的胎牛血清封閉液室溫封閉1 h，加兔抗大鼠caspase-3多抗（1︰200），4 ℃冰箱過夜，漂洗5次后加驢抗兔IgG抗體（1︰1 000），室溫孵育1 h，漂洗5次后4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核10 min，然后加淬滅劑封片，用倒置熒光顯微鏡觀察。
1.3.4 蛋白質印跡法檢測caspase-3的表達
① caspase-3蛋白質的提取：將-80℃的標本取出置于冰上，用鑷子搗碎，每個組織加入新配的裂解液1 mL，用移液器吹打并冰上放置30 min后，4 ℃離心，上清液即為蛋白質，取10 μL測蛋白濃度，其余加入sample buffer后放于-80℃凍存備用。② 蛋白質濃度的測定：用雙辛丁酸法測定蛋白質濃度[7]。③ 蛋白質印跡法：清洗玻璃板，加已經配制的12%分離膠、5%濃縮膠和蛋白（計算40 μg蛋白所需要的上樣量），先用恒壓70 V電泳至樣品到達分離膠與濃縮膠交界處，換為恒壓110 V電泳至溴酚蘭跑到分離膠下緣，停止電泳。280 mA轉膜1 h，脫脂奶粉配制的5%封閉液封閉1 h，加兔抗大鼠caspase-3（1︰500）、小鼠抗大鼠β-actin（1︰3 000），4℃冰箱過夜，然后，Tris-Hcl的等滲鹽緩沖液漂洗3次，加過氧化物酶標記的羊抗鼠、兔IgG（1︰3 000），室溫孵育1 h，漂洗后，用增強化學發光法（ECL）化學顯色法凝膠成像儀曝光，用Gel-pro凝膠成像分析軟件測定條帶的整合吸光度值（IDV）。計算caspase-3/β-actin的IDV比值，即為caspase-3相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。所有數據均進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。計量資料采用均數±標準差表示，兩組間均數比較采用t檢驗，均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠神經行為學評分
大鼠在CLP后出現蜷縮少動、豎毛、寒戰等表現。CLP組大鼠各時間點神經行為學評分均明顯低于對照組（P＜0.05），從6 h開始隨著時間變化，CLP組大鼠的評分逐漸降低，大鼠的整體情況越來越差，見表 1。
表1
對照組和CLP組大鼠神經行為學評分表（n=5，2.2 大鼠大腦海馬區caspase-3蛋白的表達
免疫熒光檢測結果：caspase-3蛋白在對照組僅微量表達，在CLP后24 h的膿毒癥大鼠大腦海馬區則明顯表達增加，見圖 1。蛋白質印跡法檢測結果：與對照組比較，CLP組在處理6 h后，caspase-3蛋白的表達即開始升高，24 h表達較高，均明顯高于對照組（P＜0.05），見圖 2。
圖1
術后24 h免疫熒光檢測膿毒癥大鼠海馬區caspase-3蛋白的表達變化（DAPI染色×40） 藍色為DAPI，綠色為caspase-3蛋白（白箭） 1a. 對照組大鼠 1b. CLP組大鼠
圖2
蛋白質印跡法檢測膿毒癥大鼠大腦海馬區caspase-3蛋白的表達 2a. 蛋白質印跡法檢測caspase-3蛋白的表達變化 2b. caspase-3蛋白相對表達量，與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01
3 討論
膿毒癥激活全身炎癥反應，大量的炎癥因子和細胞因子釋放入血，如白細胞介素2、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，導致失衡的全身炎癥反應[8]，嚴重者極易發生多器官功能障礙甚至衰竭[9]，其中，膿毒癥腦損傷是重癥監護病房（ICU）目前最常見的危急重癥，是由全身炎癥反應引起的彌漫性腦功能障礙。臨床表現多樣且沒有特異性，在ICU的病死率高達49%[10]，而且膿毒癥會導致長期的認知損害以及空間學習和記憶能力的下降，這主要與膿毒癥導致的海馬區的損傷有關[11]，因此引起危急重癥專家的關注。
目前的研究認為：膿毒癥腦損傷與補體系統的激活、神經遞質的紊亂及腦血流障礙有關，氧化應激、全身炎癥反應及線粒體功能障礙在其發病中也發揮了極重要的作用[10]。氧化應激及全身炎癥反應可通過影響神經元細胞凋亡導致腦損傷，影響海馬區功能障礙，引起以上臨床癥狀，但其具體機制目前仍不清楚。
caspase蛋白酶家族在細胞凋亡過程中起到了重要的調控作用，其引發的級聯反應是細胞凋亡過程的中心環節，通過切割特異性的底物，導致細胞凋亡。經典的caspase細胞凋亡有2條途徑，即細胞外途徑和細胞內途徑，也有人將其稱為細胞表面死亡受體（如TNF-α等）途徑和線粒體引發途徑。caspase-3蛋白是該家族中的關鍵蛋白酶，參與哺乳動物多種細胞的死亡程序，一旦被激活，就會催化裂解下游一系列的細胞內關鍵蛋白酶，導致細胞的結構及功能受損[12]。
近年來的研究表明，膿毒癥時，肝臟內皮細胞損傷，出現凋亡現象，肝竇內皮細胞中caspase-3蛋白表達增強[13]。在膿毒癥導致的肺臟和脾臟損傷中也有類似的發現[14]。此外，利用小干擾RNA技術使caspase-3蛋白的基因沉默可以減少膿毒癥休克時血管內皮的損傷[15]。但是，caspase-3蛋白在膿毒癥腦損傷中的研究卻鮮見報道。
Comim等[16]最近發現，在膿毒癥大鼠的海馬齒狀回存在神經元的凋亡現象，而且caspase-3蛋白在CLP后表達增加。我們在實驗也中觀察到，對照組大鼠海馬區神經元僅微量表達凋亡蛋白酶caspase-3，而CLP組在CLP后6 h caspase-3蛋白的表達即開始升高，24 h表達較高；與對照組相比，大鼠在CLP后出現蜷縮少動、豎毛、寒戰等表現，神經行為學評分從CLP 6 h后開始一直降低，表明膿毒癥腦損傷使海馬區神經元凋亡蛋白酶caspase-3的表達上調。這可能與線粒體功能紊亂導致的氧化應激以及全身炎癥反應時TNF-α的表達增加有關[17-20]。
總之，本研究表明，凋亡蛋白酶caspase-3在膿毒癥大鼠海馬區的表達上調，并在24 h內隨時間表達不斷增加。但caspase-3蛋白在膿毒癥大鼠海馬區中的作用及隨時間變化的機制尚需進一步的研究。
膿毒癥腦損傷是全身炎癥反應導致的彌漫性腦功能障礙，是兒童重癥監護病房常見的危急重癥[1]。超過50%的膿毒癥患者伴有不同程度的腦損傷[2]。其發病機制可能與氧化應激和炎癥反應所致的細胞凋亡有關[3, 4]。caspase家族是細胞凋亡相關蛋白質，其中，caspase-3是細胞凋亡過程中主要的終末剪切酶。目前關于caspase-3蛋白在膿毒癥腦損傷發病中的作用并不清楚。因此，本研究探討了膿毒癥腦損傷對大鼠海馬區caspase-3蛋白表達的影響，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 實驗對象
80只30日齡健康Wistar雄性大鼠，體質量（110 ±10）g，清潔級，由四川簡陽達碩動物科技有限公司提供（蜀ICP備09003144號）。隨機分為對照組30只，盲腸結扎穿孔（CLP）組50只。所有大鼠在避強光、避噪音、自由獲取飼料和水的環境中飼養。
1.2 主要試劑和儀器
兔抗大鼠caspase-3多抗、小鼠抗大鼠β-actin單抗（美國CST公司），辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的抗鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司），驢抗兔IgG抗體（美國Jackson公司），蛋白定量試劑盒、ECL化學發光試劑盒（美國Millipore公司），封閉用小牛血清白蛋白、胎牛血清、蛋白酶抑制劑Cocktail（瑞士Roche公司）；放射免疫沉淀法裂解液配方：50 mmol/L Tris-HCl（pH值7.4），150 mmol/L NaCl，10 mg/L NP-40，使用前每10毫升裂解液加入10 mg蛋白酶抑制劑Cocktail、水合氯醛（成都科龍化工試劑廠）；BR4i高速冷凍離心機（美國Thermo公司），Varioskan Flash連續波長多功能酶標儀（美國Thermo公司），凝膠成像系統（美國Bio-RAD公司）、震蕩切片機（美國Leica公司），激光共聚焦顯微成像系統（美國Olympus公司）。
1.3 方法
1.3.1 CLP建立膿毒癥模型[5 ]
CLP組：將10%的水合氯醛按照1.0 mL/300 mg腹腔注射于大鼠，待大鼠被麻醉后，用膠布固定于手術臺上，聚維酮碘溶液消毒腹部皮膚，沿腹中線行約2 cm的縱向切口，打開腹腔，找到盲腸，將盲腸內容物輕輕擠向遠端盲腸，在盲腸根部結扎盲腸，用18GG的穿刺針在盲腸根部從腸系膜側向腸系膜游離側穿刺2次，擠出少量糞便至腹腔，回納盲腸至腹腔，保持切口不被糞便污染，逐層縫合腹壁，術畢，按5 mL/100 g皮下注射林格液抗休克。分別于術后6、12、24 h處死大鼠5只，取腦組織，置于-80℃備用。對照組：同樣麻醉之后打開大鼠腹腔，拉出盲腸，但不給予盲腸結扎穿孔，不造成膿毒癥模型，其余處理同CLP組。
1.3.2 大鼠神經行為學評價
兩組在6、12、24 h各時間點分別另取5只大鼠進行神經行為學檢測：包括耳廓反射、角膜反射、翻正反射、甩尾反射和逃避反射。采用張麗娜等[6]膿毒癥腦損傷動物模型的鑒定方法，0分為無反射，1分為反射減弱（10 s以內缺乏反射），2分為正常反射，最高評分為10分。
1.3.3 免疫熒光檢測caspase-3蛋白在大鼠大腦海馬區的表達
兩組在術后24 h各取大鼠3只。大鼠經水合氯醛麻醉后置于手術臺上，剪開肋骨暴露心臟，經左心室依次灌注生理鹽水和4%多聚甲醛，直至大鼠四肢僵直后開顱取腦。用多聚甲醛4℃固定24～48 h，用現配的4%瓊脂糖包埋組織，震蕩切片。切片經漂洗后用5%的胎牛血清封閉液室溫封閉1 h，加兔抗大鼠caspase-3多抗（1︰200），4 ℃冰箱過夜，漂洗5次后加驢抗兔IgG抗體（1︰1 000），室溫孵育1 h，漂洗5次后4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核10 min，然后加淬滅劑封片，用倒置熒光顯微鏡觀察。
1.3.4 蛋白質印跡法檢測caspase-3的表達
① caspase-3蛋白質的提取：將-80℃的標本取出置于冰上，用鑷子搗碎，每個組織加入新配的裂解液1 mL，用移液器吹打并冰上放置30 min后，4 ℃離心，上清液即為蛋白質，取10 μL測蛋白濃度，其余加入sample buffer后放于-80℃凍存備用。② 蛋白質濃度的測定：用雙辛丁酸法測定蛋白質濃度[7]。③ 蛋白質印跡法：清洗玻璃板，加已經配制的12%分離膠、5%濃縮膠和蛋白（計算40 μg蛋白所需要的上樣量），先用恒壓70 V電泳至樣品到達分離膠與濃縮膠交界處，換為恒壓110 V電泳至溴酚蘭跑到分離膠下緣，停止電泳。280 mA轉膜1 h，脫脂奶粉配制的5%封閉液封閉1 h，加兔抗大鼠caspase-3（1︰500）、小鼠抗大鼠β-actin（1︰3 000），4℃冰箱過夜，然后，Tris-Hcl的等滲鹽緩沖液漂洗3次，加過氧化物酶標記的羊抗鼠、兔IgG（1︰3 000），室溫孵育1 h，漂洗后，用增強化學發光法（ECL）化學顯色法凝膠成像儀曝光，用Gel-pro凝膠成像分析軟件測定條帶的整合吸光度值（IDV）。計算caspase-3/β-actin的IDV比值，即為caspase-3相對表達量。
1.4 統計學方法
采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。所有數據均進行正態性檢驗和方差齊性檢驗。計量資料采用均數±標準差表示，兩組間均數比較采用t檢驗，均為雙側檢驗，檢驗水準α=0.05。
2 結果
2.1 大鼠神經行為學評分
大鼠在CLP后出現蜷縮少動、豎毛、寒戰等表現。CLP組大鼠各時間點神經行為學評分均明顯低于對照組（P＜0.05），從6 h開始隨著時間變化，CLP組大鼠的評分逐漸降低，大鼠的整體情況越來越差，見表 1。
表1
對照組和CLP組大鼠神經行為學評分表（n=5，2.2 大鼠大腦海馬區caspase-3蛋白的表達
免疫熒光檢測結果：caspase-3蛋白在對照組僅微量表達，在CLP后24 h的膿毒癥大鼠大腦海馬區則明顯表達增加，見圖 1。蛋白質印跡法檢測結果：與對照組比較，CLP組在處理6 h后，caspase-3蛋白的表達即開始升高，24 h表達較高，均明顯高于對照組（P＜0.05），見圖 2。
圖1
術后24 h免疫熒光檢測膿毒癥大鼠海馬區caspase-3蛋白的表達變化（DAPI染色×40） 藍色為DAPI，綠色為caspase-3蛋白（白箭） 1a. 對照組大鼠 1b. CLP組大鼠
圖2
蛋白質印跡法檢測膿毒癥大鼠大腦海馬區caspase-3蛋白的表達 2a. 蛋白質印跡法檢測caspase-3蛋白的表達變化 2b. caspase-3蛋白相對表達量，與對照組比較，*P＜0.05，#P＜0.01
3 討論
膿毒癥激活全身炎癥反應，大量的炎癥因子和細胞因子釋放入血，如白細胞介素2、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，導致失衡的全身炎癥反應[8]，嚴重者極易發生多器官功能障礙甚至衰竭[9]，其中，膿毒癥腦損傷是重癥監護病房（ICU）目前最常見的危急重癥，是由全身炎癥反應引起的彌漫性腦功能障礙。臨床表現多樣且沒有特異性，在ICU的病死率高達49%[10]，而且膿毒癥會導致長期的認知損害以及空間學習和記憶能力的下降，這主要與膿毒癥導致的海馬區的損傷有關[11]，因此引起危急重癥專家的關注。
目前的研究認為：膿毒癥腦損傷與補體系統的激活、神經遞質的紊亂及腦血流障礙有關，氧化應激、全身炎癥反應及線粒體功能障礙在其發病中也發揮了極重要的作用[10]。氧化應激及全身炎癥反應可通過影響神經元細胞凋亡導致腦損傷，影響海馬區功能障礙，引起以上臨床癥狀，但其具體機制目前仍不清楚。
caspase蛋白酶家族在細胞凋亡過程中起到了重要的調控作用，其引發的級聯反應是細胞凋亡過程的中心環節，通過切割特異性的底物，導致細胞凋亡。經典的caspase細胞凋亡有2條途徑，即細胞外途徑和細胞內途徑，也有人將其稱為細胞表面死亡受體（如TNF-α等）途徑和線粒體引發途徑。caspase-3蛋白是該家族中的關鍵蛋白酶，參與哺乳動物多種細胞的死亡程序，一旦被激活，就會催化裂解下游一系列的細胞內關鍵蛋白酶，導致細胞的結構及功能受損[12]。
近年來的研究表明，膿毒癥時，肝臟內皮細胞損傷，出現凋亡現象，肝竇內皮細胞中caspase-3蛋白表達增強[13]。在膿毒癥導致的肺臟和脾臟損傷中也有類似的發現[14]。此外，利用小干擾RNA技術使caspase-3蛋白的基因沉默可以減少膿毒癥休克時血管內皮的損傷[15]。但是，caspase-3蛋白在膿毒癥腦損傷中的研究卻鮮見報道。
Comim等[16]最近發現，在膿毒癥大鼠的海馬齒狀回存在神經元的凋亡現象，而且caspase-3蛋白在CLP后表達增加。我們在實驗也中觀察到，對照組大鼠海馬區神經元僅微量表達凋亡蛋白酶caspase-3，而CLP組在CLP后6 h caspase-3蛋白的表達即開始升高，24 h表達較高；與對照組相比，大鼠在CLP后出現蜷縮少動、豎毛、寒戰等表現，神經行為學評分從CLP 6 h后開始一直降低，表明膿毒癥腦損傷使海馬區神經元凋亡蛋白酶caspase-3的表達上調。這可能與線粒體功能紊亂導致的氧化應激以及全身炎癥反應時TNF-α的表達增加有關[17-20]。
總之，本研究表明，凋亡蛋白酶caspase-3在膿毒癥大鼠海馬區的表達上調，并在24 h內隨時間表達不斷增加。但caspase-3蛋白在膿毒癥大鼠海馬區中的作用及隨時間變化的機制尚需進一步的研究。
