乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，盡管目前治療手段逐漸多樣化、個體化，乳腺癌患者的預后仍沒有進一步提高。目前普遍認為造成乳腺癌患者復發轉移最后導致死亡的主要原因是腫瘤當中存在一部分具有高致瘤性、對放射化學療法不敏感的乳腺癌干細胞。隨著對乳腺癌干細胞研究的廣泛開展，出現了多種對乳腺癌干細胞進行分離和富集的方法，以及乳腺癌干細胞在腫瘤治療中的應用，現就乳腺癌干細胞的研究進展情況作一綜述。
引用本文： 王榮, 羊曉勤, 呂青. 乳腺癌干細胞的研究進展. 華西醫學, 2014, 29(5): 988-991. doi: 10.7507/1002-0179.20140301 復制
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在全球范圍內發病率正逐年攀升。據統計，2013年美國婦女乳腺癌新發病例已超過23萬例，占女性惡性腫瘤新發病例總數的29%[1]。從20世紀90年代以來，我國女性乳腺癌的發病率持續穩定上升。據統計，2007年我國乳腺癌的發病率為23.87/10萬，年平均增長百分比為4.476%[2]。隨著對乳腺癌研究的深入開展，經過手術、放射治療（放療）、化學療法（化療）、內分泌治療、生物靶向治療等綜合治療，已使乳腺癌的遠期生存率得到大大的提高，但臨床上仍有1/3的患者經過綜合治療后仍然出現腫瘤復發和遠處轉移而致死亡。怎樣使乳腺癌的死亡率得到進一步遏制成為擺在研究人員和醫師面前的重要課題。腫瘤干細胞（CSC）研究為突破乳腺癌的治療瓶頸帶來了新的思路和方向。
1 CSC學說及來源
干細胞，即能夠進行不對稱分裂的未分化細胞，定義為具有自我更新能力，能夠通過多向分化形成成熟細胞和組織的細胞，它廣泛存在于人體的各個組織，但數量極少[3]。正常干細胞如乳腺上皮干細胞，在分裂的過程中，經過不對稱分裂形成一個與原來的干細胞性狀完全相同的細胞和另一個可向某方向分化的細胞，亦稱之為前祖細胞。Kordon等[4]利用小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）轉染發現MMTV標記乳腺的上皮前祖細胞可以再生成為小鼠的全部乳腺導管，因此前祖細胞經過誘導分化后可以成為各種成熟的細胞系。CSC即既具有正常干細胞自我更新的特點，又具有腫瘤細胞能夠致癌特性的干細胞。關于CSC是起源于正常干細胞，還是來源于基因突變后重新獲得自我更新能力的已分化癌細胞目前有2種觀點：一種觀點認為，成熟細胞經前祖細胞分化而來，存活時間短，在癌變發生之前，通常已經凋亡，而正常干細胞大部分處于靜止的G0期，生命期限比已分化細胞長，正常干細胞具備了積累更多的基因突變的可能性；同時這種觀點認為，CSC與正常干細胞具有相似的信號通路調控機制，如Wnt、Notch、Hedgehog、骨形成蛋白通路（BMP）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、Bmi-1等通路[5, 6]。因此推測CSC來源于正常干細胞。另一種觀點認為，CSC與正常干細胞的主要不同點在于細胞增殖的失控，大多數的抑癌基因，如成視網膜細胞瘤基因（RB）、BRCA1、BRCA2和p53都與細胞周期控制、DNA損傷修復和凋亡調控密切相關[7]，CSC可以通過前祖細胞或者已經分化的細胞經過突變后逆分化轉變而來，只要細胞在分化過程中的某一步驟出現了癌基因或抑癌基因的突變，都有可能導致CSC的發生[7]。
自1997年Bonnet等[8]從造血系統惡性腫瘤白血病細胞中首次分離出了CSC以來，CSC的概念引起越來越多的關注。CSC假說認為：與正常干細胞一樣，腫瘤組織中存在一部分數量極少、具有自我更新和多項分化潛能的細胞，這群細胞成瘤能力強，并且能夠抵御放、化療的作用[9, 10]，這群細胞也是引起腫瘤復發與轉移的主要原因。乳腺癌干細胞作為第一個被發現、同時也是目前研究得相當深入的實體CSC，開啟了人們對CSC探索的熱潮。隨后人們在腦部腫瘤、前列腺癌、黑色素瘤、結腸癌、胰腺癌、多發骨髓瘤、肺腺癌、胃癌都發現了CSC的存在和相應的標志物[11-18]。
2 乳腺癌CSC的分離與富集方法
由于干細胞在腫瘤中的比例非常少[19]，如何有效地篩選和富集干細胞是研究靶向治療成功的第一步。目前用于富集乳腺癌干細胞的方法主要有以下幾種。
2.1 表面標志物分選法
表面標志分選技術主要基于細胞表面標志物相應抗體相結合的原理，通過流式細胞儀或免疫磁珠分選出細胞。流式細胞術分選器是由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發生偏轉，帶有不同的表面標志的細胞落入收集器中而被分選；免疫磁珠分選法（MACS）是把細胞用超級順磁性的微型磁珠特異性地標志，把這些細胞通過一個強而穩定磁場中的分選柱，被磁性標志的細胞滯留在柱里而未被標志的細胞則流出。當分選柱移出磁場后，滯留柱內的磁性標志細胞就可以被洗脫出來，這樣就完全可以獲得標志和未標志的兩個細胞組分。
2003年Al-Hajj等[20]將CD 24和CD 44兩種標志物不同表達的細胞進行比較，發現200個表面分子標志為CD44+CD24-/lowESA+的細胞接種至NOD/SCID小鼠就能形成移植瘤，并且具有自我更新和多向分化的能力，子代細胞中CD44+CD24-/lowESA+標志的細胞仍然具有相同的致瘤能力，而其余標志均不具有這種特性，第一次證明了CD44+CD24-/low分子標志的細胞具有CSC的高致瘤性，從而確定乳腺癌干細胞的表面標記，這也是目前最常用的乳腺癌干細胞標志物。隨著乳腺癌干細胞研究的深入，有研究報道，帶有乙醛脫氫酶（ALDH）陽性的標志物CD44+/CD24-/lowALDH+較CD44+/CD24-/lowALDH-在NOD/SCID小鼠上的成瘤性更高，更具有特異性；也有研究報道CD 133標志的乳腺癌干細胞群與CD44+/CD24-/low形成的干細胞群并不一致。這些研究表明乳腺腫瘤干細胞可能分不同的亞群，不同的乳腺癌分型是否存在著不同的干細胞標志物，仍需要進一步研究。
2.2 流式細胞儀分選側群細胞（SP）
側群分選利用的是干細胞Hoechst 33342拒染的特性。Hoechst 33342是一種核酸結合染料，在紫光激發下可發出藍光和紅光兩種熒光，干細胞膜表面的ABCG2蛋白是三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員-2，又名乳腺癌耐藥蛋白（Bcrp1），可以將染料Hoechst 33342泵出細胞外而呈現淡染，同時另一組采用適當劑量的維拉帕米來阻斷SP細胞泵出染料，通過流式細胞儀分析兩張圖片，可見SP細胞數量很少又分布在左下角。Patrawala等[21]在神經膠質瘤、前列腺癌和乳腺癌的細胞系中都發現SP細胞的存在，與非SP細胞相比，乳腺癌SP細胞含有干細胞樣腫瘤細胞，具有更強的致瘤性。
2.3 無血清懸浮培養
無血清懸浮培養是根據干細胞可以在含成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、谷氨酰胺等不添加血清的培養液中以懸浮形式生長形成球體的特性，對乳腺癌干細胞進行培養形成乳腺球，單個癌干細胞形成的乳腺球能夠分化多種不同的細胞系。通過Ponti等[22]的方法對乳腺癌組織標本進行分離、消化、過濾、培養可以得到原代的乳腺球，具有多向分化的能力和高致瘤性，能夠在體外連續傳代，以此種方法對某些乳腺癌細胞系如MCF-7進行培養，形成的乳腺球與原來的細胞系相比，VEGF基因表達明顯增加，提示無血清懸浮培養有聚集干細胞的作用[23]。
2.4 ALDA活性測定分選
此方法是根據ALDH的活性來鑒別干細胞和祖細胞。干細胞和祖細胞的ALDH活性很高，將不帶電荷的ALDH-底物BAAA通過擴散進入活細胞，BAAA被細胞內的ALDH轉化為帶負電荷的反應產物滯留在細胞內，ALDH高表達的細胞呈現明亮的熒光，通過流式細胞儀進行鑒定和分離。Fillmore等[24]檢測了多種乳腺癌細胞株的醛脫氫酶活性來測定其中的干細胞群，證實了乳腺癌細胞株中ALDEFLUOR+細胞群表達干細胞特性和高致瘤性。Ginestier等[25]研究發現正常乳腺上皮和乳腺癌細胞的ALDEFLUOR+細胞群都具有干細胞的特性，通過對577例患者進行生存分析后發現除Ki-67、腫瘤大小、病理學分級以外，ALDH1的表達也是患者的獨立預后因子。
隨著對乳腺癌的深入研究，乳腺癌干細胞的分離、檢測方法層出不窮。盡管乳腺癌干細胞的表面標志被發現已達數十年，乳腺癌微球體的原代培養和細胞株培養也廣泛地應用多年，但哪一種才是最準確與最高效的方法目前并沒有定論，這些方法各有優點和缺陷。一般來說，① 表面抗體標志檢測費用高、工作量大，不同表型乳腺癌表達的標志物可能不同，為鑒定干細胞增加了難度。② 原代培養微球體操作復雜，難度較大，且對提取的組織標本具有較高的要求，原代第1代微球體由于摻雜的成分較多[26]，并不具有較高的致瘤性，需經過傳代純化后才適用于研究，這也提高了操作的難度。③ 與之相比，細胞株經過純化處理，增殖性強，成球率高，培養方法簡單，經實驗測定致瘤性也較高，但各種細胞株含干細胞的比例差異較大[24]，有的細胞系經過測定干細胞比例可以達到90%以上，與干細胞假說的理論相悖，可能與細胞系經過長期的體外培養，表面標志物發生改變有關。④ SP側群分選染色流程要求比較嚴格，組織分解、細胞計數、染料濃度等對實驗結果影響很大，且因為Hoechst等染料本身對細胞有毒性，可能造成主群細胞自我更新能力低、致瘤性低的假象，陽性細胞分選后不能在體外繼續生長或者體內成瘤[27]。⑤ ALDH活性測定分選是一種分離和富集乳腺癌干細胞的新方法，目前研究相對較少，這種方法仍有一定的局限性。如Ucar等[28]研究發現在肺癌H-522細胞中，ALDHbr和ALDHlow的細胞都能在NOD/SCID小鼠中成瘤，提示兩組細胞群中都可能存在干細胞，因此這種方法的可靠性還有待進一步的研究。
3 乳腺癌干細胞在腫瘤治療中的應用
3.1 腫瘤干細胞與腫瘤的耐藥
腫瘤耐藥細胞即臨床上經過多次化療仍未能殺滅的腫瘤細胞，多藥耐藥一直是化學藥物治療的主要障礙。腫瘤多藥耐藥的機制復雜，最常見的原因是一部分能量依賴性轉動蛋白將抗腫瘤藥物從細胞中泵出增多；其他機制包括：對藥物引導的細胞凋亡不敏感、藥物吸收減少、藥物活性作用減弱等，也起到了重要的作用[29]；另外由于CSC多處于相對靜止期或休眠狀態[30]，較少進行分裂增殖，各種化療藥物多作用于細胞增殖期（如抗代謝類藥物氟尿嘧啶，以及作用于細胞周期的S期的阿糖胞苷、羥基脲，作用于M期的長春新堿及射線等），較難對其產生作用，可能也是形成對化療不敏感的原因之一。
ATP結合盒式結構超家族是一類跨膜轉運蛋白基因家族，在體內分布廣泛，可轉運多肽類、糖類、內源性脂質、核苷酸、代謝性藥物、酶等[31]。目前與耐藥有關的ABC轉運蛋白主要有ABCB1編碼的P2糖蛋白（P2gp/ABCB1）、多藥耐藥相關蛋白（MRP/ABCC1）和半轉運體ABCG2編碼的乳腺癌耐藥蛋白（BCRP/ABCG2）等，能夠將化療藥物由細胞內向細胞外轉移，使細胞對化療藥物耐受[32]。多藥耐藥還發現與腫瘤細胞較強的DNA修復能力有關，細胞通過核苷酸切除修復（NER）[33]和錯配修復能力（MMR）[34]來維持基因染色體的穩定性。Dean等[35]認為，CSC表達高水平的ABC轉運蛋白如ABCB1、P2gp、ABCG2等，具有參與DNA修復和抵抗凋亡發生的能力，是CSC發生臨床耐藥現象的主要機制。富含CSC的SP細胞能夠將染料Hoechst 33342泵出細胞外，即與ABC轉運蛋白的藥物轉運能力有關[36]。
3.2 針對乳腺癌干細胞的腫瘤治療研究
乳腺癌干細胞雖然在組織中只存在一小部分，但是其自我更新能力、成瘤能力和耐藥特性等，目前認為是乳腺癌術后復發與轉移的主要原因[9, 10]，只有殺滅乳腺癌干細胞才能最終治愈乳腺癌，因此以CSC為治療靶點成為腫瘤治療的新思路。如前所述，腫瘤干細胞和正常干細胞一樣，能夠表達ABC藥物轉運蛋白，ABC轉運子基因編碼的P2gp是腫瘤干細胞中的多藥耐藥基因，如果阻斷ABC轉動蛋白通路，則能夠增加化療藥物對CSC的抑制及殺傷作用；此外，CSC與正常干細胞一樣具有Wnt、Notch、Hedgehog、BMP、PI3K-Akt、Bmi-1等信號通路調控機制[5, 6]，如對相關通路進行阻斷或抑制可能會達到治療腫瘤的效果。值得注意的是，Hirsch等[37]在體外實驗中經流式細胞術分選證實，將低劑量（0.1～0.3 mmol/L）的二甲雙胍加入4種乳腺癌細胞株形成的干細胞中，均對干細胞具有選擇性的抑制作用；體內實驗證實，按100 μg/mL 二甲雙胍和4 mg/kg化療藥多柔比星分別注入乳腺癌裸鼠模型腫瘤周圍，可明顯阻止腫瘤生長，抑制腫瘤復發，且二者聯合用藥比單一使用多柔比星效果顯著[38]；同時二甲雙胍與多柔比星聯用這一方法對前列腺癌和肺癌移植瘤的治療同樣有效，這一機制目前尚不明確，還需進一步深入研究。
4 結語
隨著科學研究的不斷深入，乳腺癌干細胞已成為乳腺癌治療研究的焦點和關鍵之一。目前乳腺癌干細胞的生物學行為已經逐漸明朗，但仍然缺乏準確的表面標志和有效的富集方式。隨著某些特異性藥物和傳導通路的進一步研究，針對CSC的靶向治療聯合傳統治療可能將為我們提供新的治療模式，為成功治愈乳腺癌邁進重要的一步。由于CSC與正常干細胞具有某種相似性，如何能在不損傷正常干細胞的同時殺滅CSC，也為我們帶來新的挑戰。
乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，在全球范圍內發病率正逐年攀升。據統計，2013年美國婦女乳腺癌新發病例已超過23萬例，占女性惡性腫瘤新發病例總數的29%[1]。從20世紀90年代以來，我國女性乳腺癌的發病率持續穩定上升。據統計，2007年我國乳腺癌的發病率為23.87/10萬，年平均增長百分比為4.476%[2]。隨著對乳腺癌研究的深入開展，經過手術、放射治療（放療）、化學療法（化療）、內分泌治療、生物靶向治療等綜合治療，已使乳腺癌的遠期生存率得到大大的提高，但臨床上仍有1/3的患者經過綜合治療后仍然出現腫瘤復發和遠處轉移而致死亡。怎樣使乳腺癌的死亡率得到進一步遏制成為擺在研究人員和醫師面前的重要課題。腫瘤干細胞（CSC）研究為突破乳腺癌的治療瓶頸帶來了新的思路和方向。
1 CSC學說及來源
干細胞，即能夠進行不對稱分裂的未分化細胞，定義為具有自我更新能力，能夠通過多向分化形成成熟細胞和組織的細胞，它廣泛存在于人體的各個組織，但數量極少[3]。正常干細胞如乳腺上皮干細胞，在分裂的過程中，經過不對稱分裂形成一個與原來的干細胞性狀完全相同的細胞和另一個可向某方向分化的細胞，亦稱之為前祖細胞。Kordon等[4]利用小鼠乳腺腫瘤病毒（MMTV）轉染發現MMTV標記乳腺的上皮前祖細胞可以再生成為小鼠的全部乳腺導管，因此前祖細胞經過誘導分化后可以成為各種成熟的細胞系。CSC即既具有正常干細胞自我更新的特點，又具有腫瘤細胞能夠致癌特性的干細胞。關于CSC是起源于正常干細胞，還是來源于基因突變后重新獲得自我更新能力的已分化癌細胞目前有2種觀點：一種觀點認為，成熟細胞經前祖細胞分化而來，存活時間短，在癌變發生之前，通常已經凋亡，而正常干細胞大部分處于靜止的G0期，生命期限比已分化細胞長，正常干細胞具備了積累更多的基因突變的可能性；同時這種觀點認為，CSC與正常干細胞具有相似的信號通路調控機制，如Wnt、Notch、Hedgehog、骨形成蛋白通路（BMP）、磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）、Bmi-1等通路[5, 6]。因此推測CSC來源于正常干細胞。另一種觀點認為，CSC與正常干細胞的主要不同點在于細胞增殖的失控，大多數的抑癌基因，如成視網膜細胞瘤基因（RB）、BRCA1、BRCA2和p53都與細胞周期控制、DNA損傷修復和凋亡調控密切相關[7]，CSC可以通過前祖細胞或者已經分化的細胞經過突變后逆分化轉變而來，只要細胞在分化過程中的某一步驟出現了癌基因或抑癌基因的突變，都有可能導致CSC的發生[7]。
自1997年Bonnet等[8]從造血系統惡性腫瘤白血病細胞中首次分離出了CSC以來，CSC的概念引起越來越多的關注。CSC假說認為：與正常干細胞一樣，腫瘤組織中存在一部分數量極少、具有自我更新和多項分化潛能的細胞，這群細胞成瘤能力強，并且能夠抵御放、化療的作用[9, 10]，這群細胞也是引起腫瘤復發與轉移的主要原因。乳腺癌干細胞作為第一個被發現、同時也是目前研究得相當深入的實體CSC，開啟了人們對CSC探索的熱潮。隨后人們在腦部腫瘤、前列腺癌、黑色素瘤、結腸癌、胰腺癌、多發骨髓瘤、肺腺癌、胃癌都發現了CSC的存在和相應的標志物[11-18]。
2 乳腺癌CSC的分離與富集方法
由于干細胞在腫瘤中的比例非常少[19]，如何有效地篩選和富集干細胞是研究靶向治療成功的第一步。目前用于富集乳腺癌干細胞的方法主要有以下幾種。
2.1 表面標志物分選法
表面標志分選技術主要基于細胞表面標志物相應抗體相結合的原理，通過流式細胞儀或免疫磁珠分選出細胞。流式細胞術分選器是由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發生偏轉，帶有不同的表面標志的細胞落入收集器中而被分選；免疫磁珠分選法（MACS）是把細胞用超級順磁性的微型磁珠特異性地標志，把這些細胞通過一個強而穩定磁場中的分選柱，被磁性標志的細胞滯留在柱里而未被標志的細胞則流出。當分選柱移出磁場后，滯留柱內的磁性標志細胞就可以被洗脫出來，這樣就完全可以獲得標志和未標志的兩個細胞組分。
2003年Al-Hajj等[20]將CD 24和CD 44兩種標志物不同表達的細胞進行比較，發現200個表面分子標志為CD44+CD24-/lowESA+的細胞接種至NOD/SCID小鼠就能形成移植瘤，并且具有自我更新和多向分化的能力，子代細胞中CD44+CD24-/lowESA+標志的細胞仍然具有相同的致瘤能力，而其余標志均不具有這種特性，第一次證明了CD44+CD24-/low分子標志的細胞具有CSC的高致瘤性，從而確定乳腺癌干細胞的表面標記，這也是目前最常用的乳腺癌干細胞標志物。隨著乳腺癌干細胞研究的深入，有研究報道，帶有乙醛脫氫酶（ALDH）陽性的標志物CD44+/CD24-/lowALDH+較CD44+/CD24-/lowALDH-在NOD/SCID小鼠上的成瘤性更高，更具有特異性；也有研究報道CD 133標志的乳腺癌干細胞群與CD44+/CD24-/low形成的干細胞群并不一致。這些研究表明乳腺腫瘤干細胞可能分不同的亞群，不同的乳腺癌分型是否存在著不同的干細胞標志物，仍需要進一步研究。
2.2 流式細胞儀分選側群細胞（SP）
側群分選利用的是干細胞Hoechst 33342拒染的特性。Hoechst 33342是一種核酸結合染料，在紫光激發下可發出藍光和紅光兩種熒光，干細胞膜表面的ABCG2蛋白是三磷酸腺苷結合轉運蛋白G超家族成員-2，又名乳腺癌耐藥蛋白（Bcrp1），可以將染料Hoechst 33342泵出細胞外而呈現淡染，同時另一組采用適當劑量的維拉帕米來阻斷SP細胞泵出染料，通過流式細胞儀分析兩張圖片，可見SP細胞數量很少又分布在左下角。Patrawala等[21]在神經膠質瘤、前列腺癌和乳腺癌的細胞系中都發現SP細胞的存在，與非SP細胞相比，乳腺癌SP細胞含有干細胞樣腫瘤細胞，具有更強的致瘤性。
2.3 無血清懸浮培養
無血清懸浮培養是根據干細胞可以在含成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、谷氨酰胺等不添加血清的培養液中以懸浮形式生長形成球體的特性，對乳腺癌干細胞進行培養形成乳腺球，單個癌干細胞形成的乳腺球能夠分化多種不同的細胞系。通過Ponti等[22]的方法對乳腺癌組織標本進行分離、消化、過濾、培養可以得到原代的乳腺球，具有多向分化的能力和高致瘤性，能夠在體外連續傳代，以此種方法對某些乳腺癌細胞系如MCF-7進行培養，形成的乳腺球與原來的細胞系相比，VEGF基因表達明顯增加，提示無血清懸浮培養有聚集干細胞的作用[23]。
2.4 ALDA活性測定分選
此方法是根據ALDH的活性來鑒別干細胞和祖細胞。干細胞和祖細胞的ALDH活性很高，將不帶電荷的ALDH-底物BAAA通過擴散進入活細胞，BAAA被細胞內的ALDH轉化為帶負電荷的反應產物滯留在細胞內，ALDH高表達的細胞呈現明亮的熒光，通過流式細胞儀進行鑒定和分離。Fillmore等[24]檢測了多種乳腺癌細胞株的醛脫氫酶活性來測定其中的干細胞群，證實了乳腺癌細胞株中ALDEFLUOR+細胞群表達干細胞特性和高致瘤性。Ginestier等[25]研究發現正常乳腺上皮和乳腺癌細胞的ALDEFLUOR+細胞群都具有干細胞的特性，通過對577例患者進行生存分析后發現除Ki-67、腫瘤大小、病理學分級以外，ALDH1的表達也是患者的獨立預后因子。
隨著對乳腺癌的深入研究，乳腺癌干細胞的分離、檢測方法層出不窮。盡管乳腺癌干細胞的表面標志被發現已達數十年，乳腺癌微球體的原代培養和細胞株培養也廣泛地應用多年，但哪一種才是最準確與最高效的方法目前并沒有定論，這些方法各有優點和缺陷。一般來說，① 表面抗體標志檢測費用高、工作量大，不同表型乳腺癌表達的標志物可能不同，為鑒定干細胞增加了難度。② 原代培養微球體操作復雜，難度較大，且對提取的組織標本具有較高的要求，原代第1代微球體由于摻雜的成分較多[26]，并不具有較高的致瘤性，需經過傳代純化后才適用于研究，這也提高了操作的難度。③ 與之相比，細胞株經過純化處理，增殖性強，成球率高，培養方法簡單，經實驗測定致瘤性也較高，但各種細胞株含干細胞的比例差異較大[24]，有的細胞系經過測定干細胞比例可以達到90%以上，與干細胞假說的理論相悖，可能與細胞系經過長期的體外培養，表面標志物發生改變有關。④ SP側群分選染色流程要求比較嚴格，組織分解、細胞計數、染料濃度等對實驗結果影響很大，且因為Hoechst等染料本身對細胞有毒性，可能造成主群細胞自我更新能力低、致瘤性低的假象，陽性細胞分選后不能在體外繼續生長或者體內成瘤[27]。⑤ ALDH活性測定分選是一種分離和富集乳腺癌干細胞的新方法，目前研究相對較少，這種方法仍有一定的局限性。如Ucar等[28]研究發現在肺癌H-522細胞中，ALDHbr和ALDHlow的細胞都能在NOD/SCID小鼠中成瘤，提示兩組細胞群中都可能存在干細胞，因此這種方法的可靠性還有待進一步的研究。
3 乳腺癌干細胞在腫瘤治療中的應用
3.1 腫瘤干細胞與腫瘤的耐藥
腫瘤耐藥細胞即臨床上經過多次化療仍未能殺滅的腫瘤細胞，多藥耐藥一直是化學藥物治療的主要障礙。腫瘤多藥耐藥的機制復雜，最常見的原因是一部分能量依賴性轉動蛋白將抗腫瘤藥物從細胞中泵出增多；其他機制包括：對藥物引導的細胞凋亡不敏感、藥物吸收減少、藥物活性作用減弱等，也起到了重要的作用[29]；另外由于CSC多處于相對靜止期或休眠狀態[30]，較少進行分裂增殖，各種化療藥物多作用于細胞增殖期（如抗代謝類藥物氟尿嘧啶，以及作用于細胞周期的S期的阿糖胞苷、羥基脲，作用于M期的長春新堿及射線等），較難對其產生作用，可能也是形成對化療不敏感的原因之一。
ATP結合盒式結構超家族是一類跨膜轉運蛋白基因家族，在體內分布廣泛，可轉運多肽類、糖類、內源性脂質、核苷酸、代謝性藥物、酶等[31]。目前與耐藥有關的ABC轉運蛋白主要有ABCB1編碼的P2糖蛋白（P2gp/ABCB1）、多藥耐藥相關蛋白（MRP/ABCC1）和半轉運體ABCG2編碼的乳腺癌耐藥蛋白（BCRP/ABCG2）等，能夠將化療藥物由細胞內向細胞外轉移，使細胞對化療藥物耐受[32]。多藥耐藥還發現與腫瘤細胞較強的DNA修復能力有關，細胞通過核苷酸切除修復（NER）[33]和錯配修復能力（MMR）[34]來維持基因染色體的穩定性。Dean等[35]認為，CSC表達高水平的ABC轉運蛋白如ABCB1、P2gp、ABCG2等，具有參與DNA修復和抵抗凋亡發生的能力，是CSC發生臨床耐藥現象的主要機制。富含CSC的SP細胞能夠將染料Hoechst 33342泵出細胞外，即與ABC轉運蛋白的藥物轉運能力有關[36]。
3.2 針對乳腺癌干細胞的腫瘤治療研究
乳腺癌干細胞雖然在組織中只存在一小部分，但是其自我更新能力、成瘤能力和耐藥特性等，目前認為是乳腺癌術后復發與轉移的主要原因[9, 10]，只有殺滅乳腺癌干細胞才能最終治愈乳腺癌，因此以CSC為治療靶點成為腫瘤治療的新思路。如前所述，腫瘤干細胞和正常干細胞一樣，能夠表達ABC藥物轉運蛋白，ABC轉運子基因編碼的P2gp是腫瘤干細胞中的多藥耐藥基因，如果阻斷ABC轉動蛋白通路，則能夠增加化療藥物對CSC的抑制及殺傷作用；此外，CSC與正常干細胞一樣具有Wnt、Notch、Hedgehog、BMP、PI3K-Akt、Bmi-1等信號通路調控機制[5, 6]，如對相關通路進行阻斷或抑制可能會達到治療腫瘤的效果。值得注意的是，Hirsch等[37]在體外實驗中經流式細胞術分選證實，將低劑量（0.1～0.3 mmol/L）的二甲雙胍加入4種乳腺癌細胞株形成的干細胞中，均對干細胞具有選擇性的抑制作用；體內實驗證實，按100 μg/mL 二甲雙胍和4 mg/kg化療藥多柔比星分別注入乳腺癌裸鼠模型腫瘤周圍，可明顯阻止腫瘤生長，抑制腫瘤復發，且二者聯合用藥比單一使用多柔比星效果顯著[38]；同時二甲雙胍與多柔比星聯用這一方法對前列腺癌和肺癌移植瘤的治療同樣有效，這一機制目前尚不明確，還需進一步深入研究。
4 結語
隨著科學研究的不斷深入，乳腺癌干細胞已成為乳腺癌治療研究的焦點和關鍵之一。目前乳腺癌干細胞的生物學行為已經逐漸明朗，但仍然缺乏準確的表面標志和有效的富集方式。隨著某些特異性藥物和傳導通路的進一步研究，針對CSC的靶向治療聯合傳統治療可能將為我們提供新的治療模式，為成功治愈乳腺癌邁進重要的一步。由于CSC與正常干細胞具有某種相似性，如何能在不損傷正常干細胞的同時殺滅CSC，也為我們帶來新的挑戰。