引用本文： 謝曉英, 郭勇, 向兵. 聯合使用免疫抑制劑治療難治性原發免疫性血小板減少癥的療效及其對血小板相關抗體水平影響的研究. 華西醫學, 2014, 29(4): 616-619. doi: 10.7507/1002-0179.20140186 復制
原發免疫性血小板減少癥（ITP）的發病機制至今仍未明確，但自身免疫因素導致血小板破壞增加已成為共識，而破壞途徑涉及多重免疫學異常。目前認為ITP的一種發病機制為：體液免疫異常狀態下，自身抗體介導的血小板被巨噬細胞系統破壞及血小板的生成受抑[1, 2]，這類抗體被稱為血小板相關抗體（PAIG）。臨床上有大約不到10%的ITP患者為難治性ITP，存在著極高的死亡風險和嚴重的治療相關并發癥。目前關于難治性ITP的具體治療措施尚不確定，不同醫療單位及醫學研究機構針對難治性ITP還在做著大量的嘗試[3]。近年來，有國外學者嘗試聯合使用多種免疫抑制劑治療難治性ITP，并取得了較好的療效，為我們治療難治性ITP提供了另一個思路[4]。我們在臨床中聯合使用2～3種免疫抑制劑治療難治性ITP取得較好療效，同時運用流式細胞術檢測患者治療前后的血清PAIG水平變化情況，以探討免疫抑制劑對PAIG的影響和逆轉作用。
1 資料與方法
1.1 一般資料
2009年2月－2013年2月期間我科收治難治性ITP患者22例，其中男6例，女16例，中位年齡42歲。所有患者按入院號順序隨機分為聯合治療組（單數）和單藥治療組（雙數），其中聯合治療組男2例，女9例，中位年齡44歲；單藥治療組男4例，女7例，中位年齡41歲。
所有患者曾接受的治療方法平均有5種，均接受過脾切除及糖皮質激素治療，且無效或者復發。治療前血小板計數（1～30）×109/L，均有不同程度的臟器或黏膜出血。ITP診斷標準及難治性患者的判斷標準均參照2011年新修訂的ITP國內專家共識修訂版[5]的標準。其中難治性ITP的標準：維持血小板計數需使用大劑量糖皮質激素口服，緩慢減用激素用量后血小板計數不能穩定于30×109/L以上者、ITP患者接受脾切除后無效或者復發。排除標準：年齡＜18歲的青少年，及＞60歲的老年人；孕婦；合并腫瘤者。
1.2 主要儀器及試劑
儀器：流式細胞儀（NAVIOS美國Beckman Coulter公司），低溫離心機（Allegra X-12R美國Beckman Coulter公司）。試劑：小鼠抗人CD61-FITC（Biolegend公司），小鼠抗人IgG-PE（美國Biolegend公司），小鼠IgG-PE（美國Biolegend公司）。
1.3 方法
1.3.1 治療方法
聯合治療組：第1階段先予甲潑尼龍1 g/d靜脈滴注，共3 d，免疫球蛋白0.4 g/（kg·d）靜脈滴注，共5 d，以期獲得外周血小板計數快速有效升高（＞30×109/L）；隨后安排口服2～3種不同組合的免疫抑制劑（包括：環孢素A 50 mg，2次/d，口服；達那唑200 mg，2次/d，口服；嗎替麥考酚酯1 g，2次/d，口服）維持治療。單藥治療組：第1階段治療同聯合治療組；第2階段，給予1種免疫抑制劑（單用環孢素A 50 mg，2次/d，口服；單用達那唑200 mg，2次/d，口服；單用嗎替麥考酚酯1 g，2次/d，口服）維持治療。所有患者住院期間若有出血表現均輸注血小板及止血藥物等治療，嚴密觀察出血情況及藥物相關不良反應，定期檢測血常規、電解質、肝腎功能指標。口服免疫抑制劑維持治療3～6個月，每2周至1個月門診隨訪。觀察隨訪期6～24個月。
1.3.2 檢測方法
了解不同治療狀態ITP患者抗血小板自身抗體的具體情況：分別于治療前后采集上述患者外周血2 mL于乙二胺四乙酸抗凝管，置室溫20℃。取上述標本150 μL于含有1.85 mL磷酸鹽緩沖液的離心管中，200 g離心3次后重懸細胞。取3支流式細胞專用塑料試管，分別標記為ISO（對照管）、A（聯合治療）、B（單藥治療）。在ISO管中加入小鼠IgG-PE，及小鼠抗人CD61-FITC各10 μL；A、B管中分別加入小鼠抗人IgG-PE及小鼠抗人CD61-FITC各10 μL。上述各管中分別加入制備的細胞懸液50 μL，混勻后置室溫，避光并反應30 min。運用流式細胞儀檢測每份標本，設閾值為FL1（FITC），根據FITC與側向角散射設定血小板門，測定5 000～10 000個血小板，分析陽性血小板的百分率。
1.3.3 療效評定
參考全國血液學學術會議擬定的《血液病診斷及療效標準（第3版）》[6]。顯效：血小板恢復正常，無出血癥狀，持續3個月以上；維持2年以上無復發為基本治愈。良效：血小板升至50×109/L 或較原水平上升30×109/L以上，無或基本無出血癥狀，持續2個月以上。進步：血小板有所上升，出血癥狀改善，持續2周以上。無效：血小板計數及出血癥狀無改善或惡化。
1.4 統計學方法
采用SPSS 11.5統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較用t檢驗；等級資料以例數和百分比表示，組間比較用秩和檢驗。P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 兩組臨床治療反應
經治療后聯合治療組患者中顯效6例（54.5%），良效2例（18.2%），進步1例（9.2%），無效2例（18.2%），總有效率為81.8%。單藥治療組11例患者中顯效0例，良效2例（18.2%），進步1例（18.2%），無效7例（63.6%），總有效率為36.4%。兩組治療反應比較差異有統計學意義（Z=-2.796，P=0.005）。
2.2 兩組治療前后陽性血小板百分率的比較
聯合治療組陽性血小板治療前為（33.55 ± 9.68）%，治療后為（14.15 ± 13.03）%，較治療前明顯降低，差異有統計學意義（t=2.55，P＜0.05）；單藥治療組陽性血小板治療前為（31.49 ± 11.07）%，治療后為（25.19 ± 11.17）%，較治療后有所降低，差異有統計學意義（t=2.37，P＜0.05）；聯合治療組與單藥治療組治療后陽性血小板比較，聯合治療組治療后較單藥治療組治療后陽性血小板百分率下降明顯，兩組比較差異有統計學意義（t=2.58，P＜0.05）。 見圖 1。
圖1
流式細胞術檢測PAIG分析圖像采集 B2象限即為PAIgG陽性血小板的百分率 1a.空白對照，PAIgG陽性血小板的百分率為0 1b.治療前，PAIgG陽性血小板的百分率為（33.55 ± 9.68）% 1c.免疫抑制劑聯合治療后，PAIgG陽性血小板的百分率下降為6.84 % 1d.免疫抑制劑單藥治療后，PAIgG陽性血小板的百分率下降為14.71%
3 討論
ITP的發病機制十分復雜，自身免疫因素為其中最重要的一種致病機制，這類自身免疫異常將導致單純血小板減少癥。ITP患者的免疫異常通常均涉及B淋巴細胞體液免疫異常和T淋巴細胞免疫異常[1, 2]。已有研究顯示：由于患者體液免疫異常，針對血小板特定抗原（血小板表面糖蛋白，如GPⅡ/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ糖蛋白復合體）所產生的抗體在誘導血小板破壞增加和血小板生成損傷方面發揮了主導作用[7]。機體這種針對血小板表面抗原或特定的免疫表型分子失耐受狀態加速了網狀內皮系統（單核巨噬系統）對血小板的破壞，最終表現出外周血血小板計數減少[7, 8]。通過運用糖皮質激素抑制B淋巴細胞免疫活性，減少抗血小板自身抗體的產生；使用脾動脈栓塞術或脾臟切除手術以減少網狀內皮細胞對抗原抗體致敏血小板的吞噬及破壞，大部分患者血小板均可以得到有效的回升[9]；但仍有30%患者在接受脾切除后仍然表現為頑固性血小板減少狀態或是短暫有效回升后再次急劇下降，或過度依賴于長期大劑量的糖皮質激素方可維持安全血小板計數狀態，而長期大量糖皮質激素使用可產生嚴重的并發癥（重癥感染、結核復燃、廣泛嚴重的骨質疏松、股骨頭缺血性壞死等），這部分ITP患者即為臨床上的難治性ITP，其病死率約10%～30%，大多來自于顱內出血或者治療相關不良反應[10, 11]。傳統免疫抑制劑治療難治性ITP在過去的臨床實踐中似乎療效并不明顯。國外學者聯合使用免疫抑制劑治療難治性ITP取得了較好的療效，作用機制重點在于多藥聯合的免疫抑制協調效應，從不同通路、途徑抑制T淋巴細胞及B淋巴細胞免疫功能，減少其對效應細胞、組織的免疫攻擊[4]。本研究中，我們使用2～3種不同組合的免疫抑制劑治療22例難治性ITP，治療后血小板恢復達到顯效和良效患者占72.7%，總體反應率81.8%（9/11），患者對治療耐受好，血小板上升后繼續維持治療可以長期穩定于安全范圍內，較單用免疫抑制劑治療效果好。
近年的研究認為ITP的發病機制除B淋巴細胞增殖產生抗體外，尚存在T淋巴細胞亞群失衡的參與[3, 7, 8]。選用免疫抑制劑治療ITP從免疫學和臨床應用方面都得到充分證實，且可能還有其他方法所不能表現出的臨床治療優勢：如達那唑治療過程中，雖血小板還未上升，女性患者月經增多、陰道大量出血的現象得到很大程度緩解；但長期單獨運用免疫抑制藥物治療也存在明顯的局限性：長期維持的療效僅不到30%的患者有效；往往需要較高劑量藥物才能維持療效，而長期較高劑量狀態下的毒副作用表現十分明顯：免疫抑制治療狀態下發生感染的機會明顯增加；環孢素A長期應用引起腎臟毒性、毛發，齒齦過度增生；達那唑長期使用后表現為女性男性化改變（聲音變粗、出現胡須和喉結的過度顯露）；長春堿藥物的周圍神經損害等[4]。當選擇聯合多種免疫抑制劑治療難治性ITP，在盡可能減少藥物重疊毒性（減少每種藥物的治療用量；保證維持治療時可以繼續兩藥聯合使用，但均在更低劑量狀態下運用）的同時，以期從不同途徑達到協同抑制PAIG的產生[1, 4]。我們運用流式細胞術檢測了患者治療前后抗PAIG陽性的血小板百分率的變化，結果提示，經免疫抑制劑治療后，患者PAIG水平明顯降低，多藥聯合治療后PAIG陽性百分率降為6.84%；而單藥免疫抑制治療后，PAIG陽性百分率下降為14.71%，免疫抑制劑聯合組治療后PAIG水平明顯低于單藥治療組，檢測結果提示聯合使用免疫抑制劑能有效抑制患者自身抗體的產生，在治療難治性ITP時，對穩定血小板計數及減少復發有更好的效果。
難治性ITP的治療尚無明確的標準方案。盡可能減少治療相關不良反應并遵循個體化治療原則的方案才是最好的選擇。免疫抑制藥物多藥聯合治療方案在復發難治ITP部分患者中表現出較好的臨床療效，可以作為臨床治療復發難治ITP患者的一種選擇。近幾年將利妥昔單抗（鼠抗人CD20單克隆抗體）以及促血小板生成素受體激動劑用于ITP的二線治療，為復發難治ITP的治療提供了更多的選擇[12-15]：利妥昔單抗治療難治性ITP患者1年維持有效率為30%左右，3～5年有效率為20%；促血小板生成素受體激動劑Eltrombopag或Romiplostim治療后60%～80%的患者血小板會有上升，在有效患者中采用維持治療后，又有70%～90%的患者獲得持續療效[3, 13]。對復發難治ITP患者而言，治療方案選擇需結合其病情、身體狀態、共患疾病情況及家庭經濟承受能力綜合決定[16, 17]。對于難治性ITP的研究，重點仍在于進一步探索ITP 發病機制，給臨床治療提供更可靠的線索。
原發免疫性血小板減少癥（ITP）的發病機制至今仍未明確，但自身免疫因素導致血小板破壞增加已成為共識，而破壞途徑涉及多重免疫學異常。目前認為ITP的一種發病機制為：體液免疫異常狀態下，自身抗體介導的血小板被巨噬細胞系統破壞及血小板的生成受抑[1, 2]，這類抗體被稱為血小板相關抗體（PAIG）。臨床上有大約不到10%的ITP患者為難治性ITP，存在著極高的死亡風險和嚴重的治療相關并發癥。目前關于難治性ITP的具體治療措施尚不確定，不同醫療單位及醫學研究機構針對難治性ITP還在做著大量的嘗試[3]。近年來，有國外學者嘗試聯合使用多種免疫抑制劑治療難治性ITP，并取得了較好的療效，為我們治療難治性ITP提供了另一個思路[4]。我們在臨床中聯合使用2～3種免疫抑制劑治療難治性ITP取得較好療效，同時運用流式細胞術檢測患者治療前后的血清PAIG水平變化情況，以探討免疫抑制劑對PAIG的影響和逆轉作用。
1 資料與方法
1.1 一般資料
2009年2月－2013年2月期間我科收治難治性ITP患者22例，其中男6例，女16例，中位年齡42歲。所有患者按入院號順序隨機分為聯合治療組（單數）和單藥治療組（雙數），其中聯合治療組男2例，女9例，中位年齡44歲；單藥治療組男4例，女7例，中位年齡41歲。
所有患者曾接受的治療方法平均有5種，均接受過脾切除及糖皮質激素治療，且無效或者復發。治療前血小板計數（1～30）×109/L，均有不同程度的臟器或黏膜出血。ITP診斷標準及難治性患者的判斷標準均參照2011年新修訂的ITP國內專家共識修訂版[5]的標準。其中難治性ITP的標準：維持血小板計數需使用大劑量糖皮質激素口服，緩慢減用激素用量后血小板計數不能穩定于30×109/L以上者、ITP患者接受脾切除后無效或者復發。排除標準：年齡＜18歲的青少年，及＞60歲的老年人；孕婦；合并腫瘤者。
1.2 主要儀器及試劑
儀器：流式細胞儀（NAVIOS美國Beckman Coulter公司），低溫離心機（Allegra X-12R美國Beckman Coulter公司）。試劑：小鼠抗人CD61-FITC（Biolegend公司），小鼠抗人IgG-PE（美國Biolegend公司），小鼠IgG-PE（美國Biolegend公司）。
1.3 方法
1.3.1 治療方法
聯合治療組：第1階段先予甲潑尼龍1 g/d靜脈滴注，共3 d，免疫球蛋白0.4 g/（kg·d）靜脈滴注，共5 d，以期獲得外周血小板計數快速有效升高（＞30×109/L）；隨后安排口服2～3種不同組合的免疫抑制劑（包括：環孢素A 50 mg，2次/d，口服；達那唑200 mg，2次/d，口服；嗎替麥考酚酯1 g，2次/d，口服）維持治療。單藥治療組：第1階段治療同聯合治療組；第2階段，給予1種免疫抑制劑（單用環孢素A 50 mg，2次/d，口服；單用達那唑200 mg，2次/d，口服；單用嗎替麥考酚酯1 g，2次/d，口服）維持治療。所有患者住院期間若有出血表現均輸注血小板及止血藥物等治療，嚴密觀察出血情況及藥物相關不良反應，定期檢測血常規、電解質、肝腎功能指標。口服免疫抑制劑維持治療3～6個月，每2周至1個月門診隨訪。觀察隨訪期6～24個月。
1.3.2 檢測方法
了解不同治療狀態ITP患者抗血小板自身抗體的具體情況：分別于治療前后采集上述患者外周血2 mL于乙二胺四乙酸抗凝管，置室溫20℃。取上述標本150 μL于含有1.85 mL磷酸鹽緩沖液的離心管中，200 g離心3次后重懸細胞。取3支流式細胞專用塑料試管，分別標記為ISO（對照管）、A（聯合治療）、B（單藥治療）。在ISO管中加入小鼠IgG-PE，及小鼠抗人CD61-FITC各10 μL；A、B管中分別加入小鼠抗人IgG-PE及小鼠抗人CD61-FITC各10 μL。上述各管中分別加入制備的細胞懸液50 μL，混勻后置室溫，避光并反應30 min。運用流式細胞儀檢測每份標本，設閾值為FL1（FITC），根據FITC與側向角散射設定血小板門，測定5 000～10 000個血小板，分析陽性血小板的百分率。
1.3.3 療效評定
參考全國血液學學術會議擬定的《血液病診斷及療效標準（第3版）》[6]。顯效：血小板恢復正常，無出血癥狀，持續3個月以上；維持2年以上無復發為基本治愈。良效：血小板升至50×109/L 或較原水平上升30×109/L以上，無或基本無出血癥狀，持續2個月以上。進步：血小板有所上升，出血癥狀改善，持續2周以上。無效：血小板計數及出血癥狀無改善或惡化。
1.4 統計學方法
采用SPSS 11.5統計軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較用t檢驗；等級資料以例數和百分比表示，組間比較用秩和檢驗。P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 兩組臨床治療反應
經治療后聯合治療組患者中顯效6例（54.5%），良效2例（18.2%），進步1例（9.2%），無效2例（18.2%），總有效率為81.8%。單藥治療組11例患者中顯效0例，良效2例（18.2%），進步1例（18.2%），無效7例（63.6%），總有效率為36.4%。兩組治療反應比較差異有統計學意義（Z=-2.796，P=0.005）。
2.2 兩組治療前后陽性血小板百分率的比較
聯合治療組陽性血小板治療前為（33.55 ± 9.68）%，治療后為（14.15 ± 13.03）%，較治療前明顯降低，差異有統計學意義（t=2.55，P＜0.05）；單藥治療組陽性血小板治療前為（31.49 ± 11.07）%，治療后為（25.19 ± 11.17）%，較治療后有所降低，差異有統計學意義（t=2.37，P＜0.05）；聯合治療組與單藥治療組治療后陽性血小板比較，聯合治療組治療后較單藥治療組治療后陽性血小板百分率下降明顯，兩組比較差異有統計學意義（t=2.58，P＜0.05）。 見圖 1。
圖1
流式細胞術檢測PAIG分析圖像采集 B2象限即為PAIgG陽性血小板的百分率 1a.空白對照，PAIgG陽性血小板的百分率為0 1b.治療前，PAIgG陽性血小板的百分率為（33.55 ± 9.68）% 1c.免疫抑制劑聯合治療后，PAIgG陽性血小板的百分率下降為6.84 % 1d.免疫抑制劑單藥治療后，PAIgG陽性血小板的百分率下降為14.71%
3 討論
ITP的發病機制十分復雜，自身免疫因素為其中最重要的一種致病機制，這類自身免疫異常將導致單純血小板減少癥。ITP患者的免疫異常通常均涉及B淋巴細胞體液免疫異常和T淋巴細胞免疫異常[1, 2]。已有研究顯示：由于患者體液免疫異常，針對血小板特定抗原（血小板表面糖蛋白，如GPⅡ/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ糖蛋白復合體）所產生的抗體在誘導血小板破壞增加和血小板生成損傷方面發揮了主導作用[7]。機體這種針對血小板表面抗原或特定的免疫表型分子失耐受狀態加速了網狀內皮系統（單核巨噬系統）對血小板的破壞，最終表現出外周血血小板計數減少[7, 8]。通過運用糖皮質激素抑制B淋巴細胞免疫活性，減少抗血小板自身抗體的產生；使用脾動脈栓塞術或脾臟切除手術以減少網狀內皮細胞對抗原抗體致敏血小板的吞噬及破壞，大部分患者血小板均可以得到有效的回升[9]；但仍有30%患者在接受脾切除后仍然表現為頑固性血小板減少狀態或是短暫有效回升后再次急劇下降，或過度依賴于長期大劑量的糖皮質激素方可維持安全血小板計數狀態，而長期大量糖皮質激素使用可產生嚴重的并發癥（重癥感染、結核復燃、廣泛嚴重的骨質疏松、股骨頭缺血性壞死等），這部分ITP患者即為臨床上的難治性ITP，其病死率約10%～30%，大多來自于顱內出血或者治療相關不良反應[10, 11]。傳統免疫抑制劑治療難治性ITP在過去的臨床實踐中似乎療效并不明顯。國外學者聯合使用免疫抑制劑治療難治性ITP取得了較好的療效，作用機制重點在于多藥聯合的免疫抑制協調效應，從不同通路、途徑抑制T淋巴細胞及B淋巴細胞免疫功能，減少其對效應細胞、組織的免疫攻擊[4]。本研究中，我們使用2～3種不同組合的免疫抑制劑治療22例難治性ITP，治療后血小板恢復達到顯效和良效患者占72.7%，總體反應率81.8%（9/11），患者對治療耐受好，血小板上升后繼續維持治療可以長期穩定于安全范圍內，較單用免疫抑制劑治療效果好。
近年的研究認為ITP的發病機制除B淋巴細胞增殖產生抗體外，尚存在T淋巴細胞亞群失衡的參與[3, 7, 8]。選用免疫抑制劑治療ITP從免疫學和臨床應用方面都得到充分證實，且可能還有其他方法所不能表現出的臨床治療優勢：如達那唑治療過程中，雖血小板還未上升，女性患者月經增多、陰道大量出血的現象得到很大程度緩解；但長期單獨運用免疫抑制藥物治療也存在明顯的局限性：長期維持的療效僅不到30%的患者有效；往往需要較高劑量藥物才能維持療效，而長期較高劑量狀態下的毒副作用表現十分明顯：免疫抑制治療狀態下發生感染的機會明顯增加；環孢素A長期應用引起腎臟毒性、毛發，齒齦過度增生；達那唑長期使用后表現為女性男性化改變（聲音變粗、出現胡須和喉結的過度顯露）；長春堿藥物的周圍神經損害等[4]。當選擇聯合多種免疫抑制劑治療難治性ITP，在盡可能減少藥物重疊毒性（減少每種藥物的治療用量；保證維持治療時可以繼續兩藥聯合使用，但均在更低劑量狀態下運用）的同時，以期從不同途徑達到協同抑制PAIG的產生[1, 4]。我們運用流式細胞術檢測了患者治療前后抗PAIG陽性的血小板百分率的變化，結果提示，經免疫抑制劑治療后，患者PAIG水平明顯降低，多藥聯合治療后PAIG陽性百分率降為6.84%；而單藥免疫抑制治療后，PAIG陽性百分率下降為14.71%，免疫抑制劑聯合組治療后PAIG水平明顯低于單藥治療組，檢測結果提示聯合使用免疫抑制劑能有效抑制患者自身抗體的產生，在治療難治性ITP時，對穩定血小板計數及減少復發有更好的效果。
難治性ITP的治療尚無明確的標準方案。盡可能減少治療相關不良反應并遵循個體化治療原則的方案才是最好的選擇。免疫抑制藥物多藥聯合治療方案在復發難治ITP部分患者中表現出較好的臨床療效，可以作為臨床治療復發難治ITP患者的一種選擇。近幾年將利妥昔單抗（鼠抗人CD20單克隆抗體）以及促血小板生成素受體激動劑用于ITP的二線治療，為復發難治ITP的治療提供了更多的選擇[12-15]：利妥昔單抗治療難治性ITP患者1年維持有效率為30%左右，3～5年有效率為20%；促血小板生成素受體激動劑Eltrombopag或Romiplostim治療后60%～80%的患者血小板會有上升，在有效患者中采用維持治療后，又有70%～90%的患者獲得持續療效[3, 13]。對復發難治ITP患者而言，治療方案選擇需結合其病情、身體狀態、共患疾病情況及家庭經濟承受能力綜合決定[16, 17]。對于難治性ITP的研究，重點仍在于進一步探索ITP 發病機制，給臨床治療提供更可靠的線索。
