引用本文： 任倩, 賈永前, 曾繼莎. 結核感染T細胞斑點試驗在血液病合并結核中的診斷價值. 華西醫學, 2014, 29(4): 607-609. doi: 10.7507/1002-0179.20140183 復制
結核病作為一種全球范圍內廣泛流行的常見傳染病，是長久以來嚴重危害公眾健康的全球性公共衛生問題，根據世界衛生組織統計，全球約20億的人口感染了結核分枝桿菌，每年新增約800萬結核病患者，由于結核病感染導致的死亡人數呈逐年上升趨勢，早期診斷和治療是控制結核病傳染和改善預后的關鍵[1]。我國結核病發病率高居世界第2位，結核病在我國具有患病率高、病死率高、分布廣、地區分布不均衡等特點[2]。2010年全國第5次結核病流行病學抽樣調查報告顯示，我國15歲以上人群活動性肺結核的患病率為459/10萬，結核病疫情相比2000年雖然有所下降，但疾病負擔仍很嚴重[3]。惡性血液病患者，特別是白血病、淋巴瘤、再生障礙性貧血等血液系統腫瘤及造血干細胞移植術后等患者，由于患病后導致的自身免疫力低下、免疫抑制劑及抗腫瘤化學療法（化療）藥物的大量使用，極易發生中性粒細胞缺乏及細胞免疫和體液免疫受損，使得機體免疫力進一步下降，常易合并各種細菌、真菌及結核菌等感染[4]。感染作為惡性血液病患者最嚴重的并發癥之一，早期診斷和及時采取有效的治療方案對于降低患者的病死率以及提高其預后具有重大意義[5]。國外文獻報道，肺結核在惡性血液病的發病率在2.1%～2.6%之間[6]。由于惡性血液病患者合并結核感染后癥狀、體征及影像學特征常不典型，痰涂片及痰培養陽性率極低，加之白細胞和血小板缺乏者活檢取樣困難，增加了早期診斷和治療的難度，導致惡性血液病患者病死率增加，嚴重威脅到患者的健康和生命。
結核病的發生、發展、轉歸不僅與結核分枝桿菌的數量以及毒力等因素相關，也與宿主感染結核分枝桿菌以后的免疫應答密切相關。結核分枝桿菌感染人體后的免疫應答是以細胞免疫為主，作為免疫應答的一部分，T細胞受到結核抗原刺激致敏，形成活化的效應T細胞后從全血中單獨被分離出來，在體外受特異抗原刺激并被計數。結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）是一種簡便的酶聯免疫斑點（ELISPOT）檢測方法，用于檢測結核特異抗原刺激活化的效應T細胞。T-SPOT.TB檢測在T細胞分泌的細胞因子擴散稀釋前能夠立即捕獲細胞周圍所分泌的細胞因子，以此來計數每個活化的結核特異效應T細胞。T-SPOT.TB 檢測作為一種新型的檢驗手段，采用結核分枝桿菌特異抗原為早期分泌靶向抗原（ESAT-6）和培養濾過蛋白（CFP-10），與卡介苗或環境中大多數非結核分枝桿菌不存在抗原交叉，與傳統血清學抗體檢測相比表現出優異的敏感性和特異性。我們利用該檢測進行臨床應用試驗，評價其對于血液病患者結核感染的臨床診斷價值，旨在提高惡性血液病患者合并結核感染的早期診斷率，及時有效地治療結核感染病灶，提高患者的生存率和改善預后。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2012年3月－2013年4月，由四川大學華西醫院血液內科收治的血液病合并結核感染待排的住院患者82例，其中男56例，女26例，年齡（44.59 ± 17.05）歲；＜18歲者3例，＞60歲者17例。所有患者均根據既往病史、臨床癥狀和體征、影像學檢查及抗結核治療有效而確診，包括血液系統腫瘤74例，免疫性血小板減少性紫癜2例，噬血細胞綜合征2例，營養性貧血3例，自身免疫性溶血性貧血1例。其中化療后患者67例（化療后粒細胞缺乏者61例）。既往明確結核病史者8例，合并細菌、真菌或病毒感染者72例，影像學CT檢查提示可能感染結核者10例。結核感染確診標準：① 痰液和支氣管肺泡灌洗液等標本涂片或分離培養出結核抗酸分枝桿菌；② 組織病理活檢證實結核；③ 典型結核感染臨床癥狀和影像學表現；④ 抗結核治療有效；⑤ 排除其他非結核性疾患；⑥ 結核菌素試驗（PPD）強陽性、血清結核抗體陽性；⑦ 痰結核菌聚合酶鏈式反應（PCR）+探針檢測陽性；具備① ～② 中任1項或③ ～⑦ 中3項者均可確診[7, 8]。最終確診合并結核感染者22例，其中結核性胸膜炎1例，結核性腹膜炎1例，血行播散型肺結核1例，肺結核19例。見表 1。
表1
患者的一般資料
1.2 T-SPOT.TB檢測
采集患者抗凝外周血標本送由北京海斯特臨床檢驗所，采用上海星耀醫學科技發展有限公司提供的T-SPOT.TB試劑盒進行檢測。檢測步驟：使用肝素抗凝的真空采血管采集患者足量的外周靜脈血，分離單個核細胞（PBMC）。在已包被干擾素（IFN）-γ抗體的微孔板的4個孔中分別加入細胞培養液和植物血凝素（PHA）作為陰性對照和陽性對照，以及結核特異度抗原早期分泌靶向抗原ESAT-6和培養濾過蛋白CFP-10作為刺激原。向每個孔加入適量細胞懸液后，于37℃溫箱孵育24 h，洗去抗原致敏的效應T 淋巴細胞，加入堿性磷酸酶標記的小鼠抗人IFN-γ單抗，經酶聯顯色后在細胞因子分泌的地方形成斑點，每1個斑點代表 1個分泌細胞因子的T細胞，通過計數每個反應孔內深藍色清晰的斑點數檢測外周血中結核特異抗原致敏的效應T 淋巴細胞數量。
結果判斷：當陰性對照孔斑點數＜6時，任一實驗孔斑點數減去陰性對照孔斑點數≥6，檢測結果判定為有反應性；當陰性對照孔斑點數≥6時，任一實驗孔斑點數＞陰性對照孔斑點數的2倍，檢測結果亦為有反應性。有反應性表明樣本中存在針對結核分枝桿菌特異的效應T細胞，即為陽性；無反應性表明樣本中可能不存在針對結核桿菌特異的效應T細胞，即為陰性。
1.3 統計學方法
應用SPSS 19.0統計軟件，計數資料采用百分比表示，行McNemar 檢驗，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 T-SPOT.TB檢測與結核抗體檢測結果的比較
納入的82例患者全部完成了T-SPOT.TB檢測及血清學結核抗體檢測。T-SPOT.TB檢測對于血液病患者合并結核感染的陽性檢出率（59.09%）明顯高于結核抗體檢測的陽性檢出率（13.64%），差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
T-SPOT.TB與結核抗體陽性檢測結果對比[例（%）]
2.2 T-SPOT.TB檢測血液病患者合并結核感染方法學評價
22例血液病合并結核感染患者中14例患者T-SPOT.TB檢測陽性，3例患者結核抗體檢測陽性，兩種檢測方法靈敏度分別為59.09%和13.64%，兩者比較差異有統計學意義（P=0.003）。60例排除結核感染的血液病患者中19例患者T-SPOT.TB檢測陽性，2例患者結核抗體檢測陽性，兩種檢測方法特異度分別為68.33%和96.67%，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.001）。T-SPOT.TB檢測在敏感性上顯著優于結核抗體檢測。
3 討論
結核病作為全球最嚴重的公共衛生問題之一，死亡率高居成年人傳染性疾病第1位[9]。盡管在大力開展結核病防治工作后結核病疫情有了明顯下降，但我國結核病的疾病負擔在全球22個結核病高負擔國家中仍高居第2位，結核病報告發病人數始終位居法定報告甲、乙類傳染病前列。根據2010年全國第5次結核病流行病學抽樣調查報告估算，全國15歲及以上人口中活動性肺結核患者數量高達499萬，長期有效的結核病防治工作使近年來我國活動性肺結核的患病率有所下降，但由于人口總數的持續增長，估算后的15歲及以上活動性肺結核患者比2000年反而增加[3]。
惡性血液病患者，如白血病、淋巴瘤等血液系統腫瘤及造血干細胞移植術后患者，由于患病后免疫力低下，免疫抑制劑及抗腫瘤化療藥物的大量使用后導致普遍的粒細胞缺乏狀態、細胞免疫及體液免疫受損等影響，使免疫力進一步下降，極易合并感染性疾病，而細菌、真菌和結核分枝桿菌是其中最常見的病原體[10]。惡性血液病中以血液系統腫瘤患者最為常見，而腫瘤患者和非腫瘤患者合并結核感染后的臨床表現并不完全相同，因此血液系統腫瘤患者合并結核感染后的癥狀和體征十分不典型[11]。免疫力低下者常易合并細菌或深部真菌感染而大量使用抗生素[12]，這使得惡性血液病患者合并結核感染后的臨床癥狀和體征更加不典型，主要表現為不規則發熱，其胸部X線片及胸部CT等影像學檢查多為斑片狀、云霧狀或條索狀陰影，極少有患者會出現典型空洞等結核特征性影像學表現，難以同細菌性肺炎及白血病細胞浸潤肺部等相鑒別。對于惡性血液病患者在抗腫瘤治療有效后出現的不明原因發熱，經抗細菌、真菌等治療均無效時，應高度警惕合并結核感染的可能。細菌學作為確診結核感染的金標準，結核分枝桿菌常規培養需2個月左右，BACTEC法快速培養可將檢測時間縮短至5～7 d，但以上兩種檢測方法陽性檢出率均取決于臨床所采集標本中的結核分枝桿菌數量，培養陽性率低，不利于早期診斷。且患者化療后骨髓抑制及粒細胞缺乏導致的粒細胞和血小板降低致使活檢取樣困難，使其更加難以與細菌、真菌感染等相鑒別[13]。惡性血液病患者多合并嚴重貧血，故紅細胞沉降率對于結核感染診斷意義并不大[14]。血清結核抗體檢測診斷快速且費用較低，可快速輔助診斷結核感染，特異性較高但其敏感度過低，易漏診后貽誤患者病情造成嚴重后果。合并結核感染的惡性血液病患者由于免疫力低下、合并嚴重感染等原因，PPD皮試常呈弱陽性或陰性，且PPD皮試無法鑒別區分結核分枝桿菌感染狀態和卡介苗接種后的反應，因此PPD皮試和血清學結核抗體檢測在結核診斷中僅供參考[15]。惡性血液病患者使用免疫抑制劑及化療藥物后多處于免疫抑制狀態，而免疫抑制狀態者雖然T-SPOT.TB檢測假陽性率較高，但并不影響T-SPOT.TB檢測的敏感性[16]。
本次研究的結果表明，T-SPOT.TB檢測對于惡性血液病合并結核感染的靈敏度為59.09%（13/22），明顯高于結核抗體檢測的13.64%（3/22）。而其特異度68.33%（41/60）則要明顯低于結核抗體檢測的96.67%（58/60）。由于感染是惡性血液病患者最常見和最嚴重的并發癥之一，早期明確診斷與選擇合理的治療方案顯得十分關鍵，延遲診斷或漏診對患者的病情及預后的影響更為嚴重，因此相對來說應盡量選擇敏感度較高的檢測手段。與傳統的細菌學金標準檢測方法、血清學結核抗體檢測和PPD相比，T-SPOT.TB檢測操作較為復雜且成本較昂貴，但其檢測時間僅需24 h左右，且敏感度相對較高、漏診率較低，對于臨床表現不典型、確診困難、免疫力低下、病情兇險的惡性血液病患者來說，同時行T-SPOT.TB檢測更有利于早期診斷及治療，提高患者預后及生存率、減少醫患糾紛。
結核病作為一種全球范圍內廣泛流行的常見傳染病，是長久以來嚴重危害公眾健康的全球性公共衛生問題，根據世界衛生組織統計，全球約20億的人口感染了結核分枝桿菌，每年新增約800萬結核病患者，由于結核病感染導致的死亡人數呈逐年上升趨勢，早期診斷和治療是控制結核病傳染和改善預后的關鍵[1]。我國結核病發病率高居世界第2位，結核病在我國具有患病率高、病死率高、分布廣、地區分布不均衡等特點[2]。2010年全國第5次結核病流行病學抽樣調查報告顯示，我國15歲以上人群活動性肺結核的患病率為459/10萬，結核病疫情相比2000年雖然有所下降，但疾病負擔仍很嚴重[3]。惡性血液病患者，特別是白血病、淋巴瘤、再生障礙性貧血等血液系統腫瘤及造血干細胞移植術后等患者，由于患病后導致的自身免疫力低下、免疫抑制劑及抗腫瘤化學療法（化療）藥物的大量使用，極易發生中性粒細胞缺乏及細胞免疫和體液免疫受損，使得機體免疫力進一步下降，常易合并各種細菌、真菌及結核菌等感染[4]。感染作為惡性血液病患者最嚴重的并發癥之一，早期診斷和及時采取有效的治療方案對于降低患者的病死率以及提高其預后具有重大意義[5]。國外文獻報道，肺結核在惡性血液病的發病率在2.1%～2.6%之間[6]。由于惡性血液病患者合并結核感染后癥狀、體征及影像學特征常不典型，痰涂片及痰培養陽性率極低，加之白細胞和血小板缺乏者活檢取樣困難，增加了早期診斷和治療的難度，導致惡性血液病患者病死率增加，嚴重威脅到患者的健康和生命。
結核病的發生、發展、轉歸不僅與結核分枝桿菌的數量以及毒力等因素相關，也與宿主感染結核分枝桿菌以后的免疫應答密切相關。結核分枝桿菌感染人體后的免疫應答是以細胞免疫為主，作為免疫應答的一部分，T細胞受到結核抗原刺激致敏，形成活化的效應T細胞后從全血中單獨被分離出來，在體外受特異抗原刺激并被計數。結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB）是一種簡便的酶聯免疫斑點（ELISPOT）檢測方法，用于檢測結核特異抗原刺激活化的效應T細胞。T-SPOT.TB檢測在T細胞分泌的細胞因子擴散稀釋前能夠立即捕獲細胞周圍所分泌的細胞因子，以此來計數每個活化的結核特異效應T細胞。T-SPOT.TB 檢測作為一種新型的檢驗手段，采用結核分枝桿菌特異抗原為早期分泌靶向抗原（ESAT-6）和培養濾過蛋白（CFP-10），與卡介苗或環境中大多數非結核分枝桿菌不存在抗原交叉，與傳統血清學抗體檢測相比表現出優異的敏感性和特異性。我們利用該檢測進行臨床應用試驗，評價其對于血液病患者結核感染的臨床診斷價值，旨在提高惡性血液病患者合并結核感染的早期診斷率，及時有效地治療結核感染病灶，提高患者的生存率和改善預后。
1 資料與方法
1.1 一般資料
收集2012年3月－2013年4月，由四川大學華西醫院血液內科收治的血液病合并結核感染待排的住院患者82例，其中男56例，女26例，年齡（44.59 ± 17.05）歲；＜18歲者3例，＞60歲者17例。所有患者均根據既往病史、臨床癥狀和體征、影像學檢查及抗結核治療有效而確診，包括血液系統腫瘤74例，免疫性血小板減少性紫癜2例，噬血細胞綜合征2例，營養性貧血3例，自身免疫性溶血性貧血1例。其中化療后患者67例（化療后粒細胞缺乏者61例）。既往明確結核病史者8例，合并細菌、真菌或病毒感染者72例，影像學CT檢查提示可能感染結核者10例。結核感染確診標準：① 痰液和支氣管肺泡灌洗液等標本涂片或分離培養出結核抗酸分枝桿菌；② 組織病理活檢證實結核；③ 典型結核感染臨床癥狀和影像學表現；④ 抗結核治療有效；⑤ 排除其他非結核性疾患；⑥ 結核菌素試驗（PPD）強陽性、血清結核抗體陽性；⑦ 痰結核菌聚合酶鏈式反應（PCR）+探針檢測陽性；具備① ～② 中任1項或③ ～⑦ 中3項者均可確診[7, 8]。最終確診合并結核感染者22例，其中結核性胸膜炎1例，結核性腹膜炎1例，血行播散型肺結核1例，肺結核19例。見表 1。
表1
患者的一般資料
1.2 T-SPOT.TB檢測
采集患者抗凝外周血標本送由北京海斯特臨床檢驗所，采用上海星耀醫學科技發展有限公司提供的T-SPOT.TB試劑盒進行檢測。檢測步驟：使用肝素抗凝的真空采血管采集患者足量的外周靜脈血，分離單個核細胞（PBMC）。在已包被干擾素（IFN）-γ抗體的微孔板的4個孔中分別加入細胞培養液和植物血凝素（PHA）作為陰性對照和陽性對照，以及結核特異度抗原早期分泌靶向抗原ESAT-6和培養濾過蛋白CFP-10作為刺激原。向每個孔加入適量細胞懸液后，于37℃溫箱孵育24 h，洗去抗原致敏的效應T 淋巴細胞，加入堿性磷酸酶標記的小鼠抗人IFN-γ單抗，經酶聯顯色后在細胞因子分泌的地方形成斑點，每1個斑點代表 1個分泌細胞因子的T細胞，通過計數每個反應孔內深藍色清晰的斑點數檢測外周血中結核特異抗原致敏的效應T 淋巴細胞數量。
結果判斷：當陰性對照孔斑點數＜6時，任一實驗孔斑點數減去陰性對照孔斑點數≥6，檢測結果判定為有反應性；當陰性對照孔斑點數≥6時，任一實驗孔斑點數＞陰性對照孔斑點數的2倍，檢測結果亦為有反應性。有反應性表明樣本中存在針對結核分枝桿菌特異的效應T細胞，即為陽性；無反應性表明樣本中可能不存在針對結核桿菌特異的效應T細胞，即為陰性。
1.3 統計學方法
應用SPSS 19.0統計軟件，計數資料采用百分比表示，行McNemar 檢驗，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 T-SPOT.TB檢測與結核抗體檢測結果的比較
納入的82例患者全部完成了T-SPOT.TB檢測及血清學結核抗體檢測。T-SPOT.TB檢測對于血液病患者合并結核感染的陽性檢出率（59.09%）明顯高于結核抗體檢測的陽性檢出率（13.64%），差異有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。
表2
T-SPOT.TB與結核抗體陽性檢測結果對比[例（%）]
2.2 T-SPOT.TB檢測血液病患者合并結核感染方法學評價
22例血液病合并結核感染患者中14例患者T-SPOT.TB檢測陽性，3例患者結核抗體檢測陽性，兩種檢測方法靈敏度分別為59.09%和13.64%，兩者比較差異有統計學意義（P=0.003）。60例排除結核感染的血液病患者中19例患者T-SPOT.TB檢測陽性，2例患者結核抗體檢測陽性，兩種檢測方法特異度分別為68.33%和96.67%，兩者比較差異有統計學意義（P＜0.001）。T-SPOT.TB檢測在敏感性上顯著優于結核抗體檢測。
3 討論
結核病作為全球最嚴重的公共衛生問題之一，死亡率高居成年人傳染性疾病第1位[9]。盡管在大力開展結核病防治工作后結核病疫情有了明顯下降，但我國結核病的疾病負擔在全球22個結核病高負擔國家中仍高居第2位，結核病報告發病人數始終位居法定報告甲、乙類傳染病前列。根據2010年全國第5次結核病流行病學抽樣調查報告估算，全國15歲及以上人口中活動性肺結核患者數量高達499萬，長期有效的結核病防治工作使近年來我國活動性肺結核的患病率有所下降，但由于人口總數的持續增長，估算后的15歲及以上活動性肺結核患者比2000年反而增加[3]。
惡性血液病患者，如白血病、淋巴瘤等血液系統腫瘤及造血干細胞移植術后患者，由于患病后免疫力低下，免疫抑制劑及抗腫瘤化療藥物的大量使用后導致普遍的粒細胞缺乏狀態、細胞免疫及體液免疫受損等影響，使免疫力進一步下降，極易合并感染性疾病，而細菌、真菌和結核分枝桿菌是其中最常見的病原體[10]。惡性血液病中以血液系統腫瘤患者最為常見，而腫瘤患者和非腫瘤患者合并結核感染后的臨床表現并不完全相同，因此血液系統腫瘤患者合并結核感染后的癥狀和體征十分不典型[11]。免疫力低下者常易合并細菌或深部真菌感染而大量使用抗生素[12]，這使得惡性血液病患者合并結核感染后的臨床癥狀和體征更加不典型，主要表現為不規則發熱，其胸部X線片及胸部CT等影像學檢查多為斑片狀、云霧狀或條索狀陰影，極少有患者會出現典型空洞等結核特征性影像學表現，難以同細菌性肺炎及白血病細胞浸潤肺部等相鑒別。對于惡性血液病患者在抗腫瘤治療有效后出現的不明原因發熱，經抗細菌、真菌等治療均無效時，應高度警惕合并結核感染的可能。細菌學作為確診結核感染的金標準，結核分枝桿菌常規培養需2個月左右，BACTEC法快速培養可將檢測時間縮短至5～7 d，但以上兩種檢測方法陽性檢出率均取決于臨床所采集標本中的結核分枝桿菌數量，培養陽性率低，不利于早期診斷。且患者化療后骨髓抑制及粒細胞缺乏導致的粒細胞和血小板降低致使活檢取樣困難，使其更加難以與細菌、真菌感染等相鑒別[13]。惡性血液病患者多合并嚴重貧血，故紅細胞沉降率對于結核感染診斷意義并不大[14]。血清結核抗體檢測診斷快速且費用較低，可快速輔助診斷結核感染，特異性較高但其敏感度過低，易漏診后貽誤患者病情造成嚴重后果。合并結核感染的惡性血液病患者由于免疫力低下、合并嚴重感染等原因，PPD皮試常呈弱陽性或陰性，且PPD皮試無法鑒別區分結核分枝桿菌感染狀態和卡介苗接種后的反應，因此PPD皮試和血清學結核抗體檢測在結核診斷中僅供參考[15]。惡性血液病患者使用免疫抑制劑及化療藥物后多處于免疫抑制狀態，而免疫抑制狀態者雖然T-SPOT.TB檢測假陽性率較高，但并不影響T-SPOT.TB檢測的敏感性[16]。
本次研究的結果表明，T-SPOT.TB檢測對于惡性血液病合并結核感染的靈敏度為59.09%（13/22），明顯高于結核抗體檢測的13.64%（3/22）。而其特異度68.33%（41/60）則要明顯低于結核抗體檢測的96.67%（58/60）。由于感染是惡性血液病患者最常見和最嚴重的并發癥之一，早期明確診斷與選擇合理的治療方案顯得十分關鍵，延遲診斷或漏診對患者的病情及預后的影響更為嚴重，因此相對來說應盡量選擇敏感度較高的檢測手段。與傳統的細菌學金標準檢測方法、血清學結核抗體檢測和PPD相比，T-SPOT.TB檢測操作較為復雜且成本較昂貴，但其檢測時間僅需24 h左右，且敏感度相對較高、漏診率較低，對于臨床表現不典型、確診困難、免疫力低下、病情兇險的惡性血液病患者來說，同時行T-SPOT.TB檢測更有利于早期診斷及治療，提高患者預后及生存率、減少醫患糾紛。
