宮頸癌是女性惡性腫瘤中最常見的腫瘤之一。目前，宮頸癌的治療手段是手術輔以放射治療（放療）加化學治療（化療），且術后復發率較高。在宮頸癌早期可選用手術治療，同步放、化療適合于腫瘤各期；部分患者術后根據病理結果，如有高危因素者可能需要補充放、化療。但現在尚無可靠的無創性指標來預測該疾病的復發，轉移和預后。循環腫瘤細胞（CTCs）是存在于患者外周血循環的腫瘤細胞，是腫瘤發生轉移的關鍵。因此，宮頸癌外周血CTCs的檢測將有助于臨床工作者制定更加個體化的治療方案，減少復發和轉移，改善患者預后。本文就CTCs的研究進展及在宮頸癌的發展前景作一綜述。
引用本文： 楊光瓊, 楊沛. 循環腫瘤細胞的研究進展及其在宮頸癌的研究前景. 華西醫學, 2014, 29(2): 374-376. doi: 10.7507/1002-0179.20140115 復制
宮頸癌是女性惡性腫瘤，其發病率及死亡率位居第二的，僅次于乳腺癌。隨著醫療技術的發展，宮頸癌在診斷治療方面取得一定進展，但大多數宮頸癌患者在初治兩年內會復發和轉移。據統計各種治療方法總共約有35%會復發[1]，7%～21%的會發生遠處轉移[1]。影響宮頸癌復發和轉移的因素很多，但究其根源，這主要和外周循環腫瘤細胞（CTCs）有關。CTCs是指由于自身脫落或其他原因從原發灶或轉移病灶進入外周血循環、淋巴循環的腫瘤細胞。目前尚無確切的檢測腫瘤早期轉移的手段，有效的早期干預不行，即使是高分辨率的影像學技術也無能為力。因此，有效發現外周血中的CTCs不僅對腫瘤的診斷，復發和預后的判斷有重要意義，而且對指導臨床治療也具有很大的價值。
1 CTCs概述
在一個多世紀以前，奧地利病理學家Ashworth[2]首次報道了在1例因癌癥死亡的患者的外周血中發現了類似腫瘤的細胞，并提出了CTCs的概念，此后人們對CTCs的研究逐步深化，近年來已經成為腫瘤研究熱點之一。大多數進入循環的腫瘤細胞在短期內死亡，只有生命力強、高度轉移潛能的CTCs存活下來，并在一定條件下發展為轉移灶。而外周血的CTCs能否形成遠處轉移灶與自身基因表達譜密切相關，有些CTCs在血液的剪切力以及免疫因子的作用下發生了凋亡；而有些CTCs能克服血液的剪切力及免疫系統的防御作用，最后發生遠處轉移。因此CTCs的轉移能力是由自身因素、周圍微環境及免疫系統等共同決定的。
CTCs狀態對遠處轉移灶的形成非常重要。首先外周血CTCs細胞數目較少，其次分離相對困難，且我們對其外周血中的增值特性了解較少，這都限制了對腫瘤復發轉移機制的探索。隨著分子生物學技術的發展，CTCs的檢測技術有了很大進步。目前CTCs檢測包括富集和檢測兩步：常用的富集技術主要有免疫磁分選，密度、梯度離心和細胞過濾等。檢測技術包括逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、免疫組織化學技術（ICC）、熒光原位雜交技術（FISH）和流式細胞術（FCM）等。由富集及檢測技術相結合的分析技術即細胞檢測系統在2004年經美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市，此方法可檢測出乳腺癌等實體瘤外周血中的CTCs[3]，且研究證實檢測結果與RT-PCR方法具有高度一致性[4]。這為CTCs的進一步研究提供了更廣闊的技術平臺，如通過流式細胞術檢測CTCs表面的特異抗體等。但目前CTCs檢測仍面臨著很多難題，如CTCs的間斷性脫落，基因的不穩定性，這些因素增加了研究腫瘤復發轉移機制的難度。
CTCs具有重要的臨床價值，乳腺癌、胃腸癌、前列腺癌和食管癌等多種腫瘤患者外周血中的CTCs都與疾病進展及不良預后有關。研究較多的是在乳腺癌，如Cristofanilli[5] 在做乳腺癌的臨床實驗中，檢測177例轉移性乳腺癌患者7.5 mL外周血中CTCs的數量，發現治療前外周血中CTCs≥5較CTCs＜5的患者預后差，經過統計分析顯示CTCs可作為預后的獨立因素，在治療期間檢測CTCs的動態變化能反映疾病的進展情況。實時定量RT-PCR檢測食管癌患者CEAmRNA發現剛手術后的患者外周血中CTCs最多，提示外周血中CTCs可能與腫瘤的轉移有關。但單憑CTCs并不能預測腫瘤轉移，因為這些CTCs中的大部分不久就會進入自殺程序，只有極少數的細胞具有轉移的潛能。
2 CTCs在宮頸癌的臨床應用
2.1 宮頸癌CTCs的標志物
外周血CTCs的檢測的特異性取決于血清標志物的選擇。不同的腫瘤類型有不同的腫瘤標志物，如乳腺癌[上皮細胞黏附分子（EPCAM），細胞角質素8、18和19等，表皮生長因子受體（EGFR），MUC-1，HER-2]，前列腺癌[EPCAM，前列腺特異抗原（PSA）]，以及結直腸癌[癌胚抗原（CEA），細胞角質素20，EGFR）]。它們均可作為標志物用于CTCs檢測，如在患者外周血中檢測到這些特異的標志物，則提示腫瘤的存在。
研究表明，99.0%以上的宮頸癌患者可檢測到人乳頭瘤病毒（HPV），HPV DNA的E6/E7基因整合到宿主基因并穩定表達與宮頸癌的發生，發展關系密切。Liu等[6]在治療前對60例宮頸癌患者進行HPV DNA 檢測，陽性率為20.0%（12/60）。Pao等[7]應用巢式RT-PCR技術檢測15例Ⅳ期宮頸癌患者外周血的HPV16，結果顯示HPV16的陽性表達率為86.7% （13/15），且13例陽性患者外周血的HPV16的檢出率為92.3%（12/13），而HPV陰性者和正常對照組均未檢測出HPV16的表達。據以上文獻可知，患者外周血HPV的檢出率為20.0%～92.3%，也提示宮頸癌患者外周血HPV16 mRNA的存在可作為檢測CTCs的一個敏感指標。但由于并非所有的宮頸癌均有HPV16、18感染，如鼻咽癌、乳腺癌等也與HPV感染有關，所以將HPV DNA作為CTCs的檢測有一定局限性。
同時，已有研究以鱗狀上皮細胞抗原（SCCA）作為腫瘤標志物檢測宮頸癌患者外周血的CTCs。如Duk等[8]采用酶聯免疫檢測，研究結果顯示患者血清SCCA的陽性表達率為55.7%，且多因素分析SCCA可作為宮頸癌的獨立預后指標。同時Stenman等[9]采用RT-PCR技術，檢測了15例宮頸癌患者外周血中的SCCAs，其陽性率為40.0%，跟蹤隨訪了2年后其中6例SCCA陽性者中3例復發，而9例陰性者有2例復發。綜上所述SCCA將有助于宮頸癌的分期和預后判斷。
最近還有研究用宮頸癌的相關腫瘤標志物來檢測CTCs，如趙新玲等[10]采用RT-PCR法檢測宮頸癌患者外周血中MAGEA3、hSTC1mRNA的表達，將腫瘤患者實驗結果和臨床病理結合分析發現，MAGEA3、hSTC1mRNA在早期宮頸癌和對照組的陽性表達率分別為46.7%和0.4%和0.0%，差異有顯著性（P＜0.05），說明用宮頸癌患者外周血MAGEA3和hSTC1mRNA的表達來判斷早期宮頸癌患者外周血中存在循環腫瘤細胞是可行的。陳魯等[11]也應用RT-PCR檢測了291例0～ⅡA期宮頸癌外周血的CK19mRNA的表達，陽性表達率為19.9%，結合臨床病理資料分析，宮頸癌外周血CK19 mRNA陽性與臨床分期、淋巴結轉移、淋巴血管間隙受侵和深肌層浸潤存在明顯的相關性（P＜0.05），所以可認為CK19 mRNA 也可作為檢測宮頸癌外周血循環腫瘤細胞的指標之一。
2.2 宮頸癌CTCs標志物的探索方向
2.2.1 上皮特異性細胞粘附分子（EpCAM）
EpCAM常被用作CTCs的檢測標志，因為它以多聚體的形式廣泛表達于上皮組織表面。有研究顯示在人的131種腫瘤中有98種腫瘤表達EpCAM，EpCAM在多種惡性腫瘤中均呈高表達，如結直腸癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等[12]。嚴穎等[13]用RT-PCR的方法以EpCAM為標志，檢測轉移性乳癌外周血的CTCs，結果顯示轉移性乳癌患者的EpCAM mRNA陽性率在化療前及第1周期化療后分別為37.8%和42.6%，且轉移生存分析顯示第1周期化療后EpCAM陽性的患者與EpCAM陰性的患者相比，中位病情進展時間明顯縮短，分別為7.1月和11.1月（P= 0.013）。盡管目前無研究表明EpCAM在宮頸癌組織中高表達，但正常宮頸上皮有EpCAM的表達，且外周血細胞不表達EpCAM，所以它有可能作為檢測宮頸癌CTCs的分子標志物之一，來預測宮頸癌的復發和轉移。
2.2.2 分子抑制因子（Id-1）
近期研究發現，Id-1在實體瘤如乳癌，前列腺癌，宮頸癌腫瘤中表達比對照組高，且上調程度與患者預后密切相關[14, 15]。已有研究采用免疫組化和RT-PCR對上百例的宮頸癌，癌前病變和正常宮頸組織進行檢測，結果顯示Id-1的蛋白水平和mRNA水平在子宮頸癌組織中高表達，且Id-1的表達水平與腫瘤分化，淋巴轉移，間質浸潤等惡性行為密切相關。體外的實驗也表明，HPV陽性的宮頸癌細胞株Siha和Caski的Id-1表達水平也高于正常宮頸上皮永生化的細胞株。從理論上可以考慮將Id-1作為宮頸癌CTCs檢測的腫瘤標志物之一。但是不是其他細胞也有表達，這都有待于進一步的實驗室研究和大規模的臨床實驗研究。
2.2.3 游離DNA
游離DNA又稱循環DNA，是一種無細胞狀態的胞外DNA，存在于血清或血漿，腦脊液及滑膜液等體液中。Leon等[16]首先報道腫瘤患者外周血游離DNA水平高于正常人，同時研究發現Ⅰ期宮頸癌患者的血漿DNA水平明顯高于正常組，說明血漿DNA水平的升高在宮頸癌的早期就已發生，提示血漿DNA水平有助于宮頸癌的篩查和早期診斷。但診斷的敏感性不高，如果與其他多種血漿腫瘤標志物聯合檢測，可進一步提高檢測的敏感性。腫瘤患者游離DNA水平的檢測可作為腫瘤治療后預測復發的潛在指標。但由于游離DNA的微量存在，使得目前DNA的提取比較困難，再加上試劑昂貴，所以迫切需要建立實用性較強的檢測方法。
3 存在問題和展望
目前，對宮頸癌的復發和轉移的診斷技術仍停留在傳統的病理組織水平，而外周血CTCs的存在，作為無創性的指標檢測將為宮頸癌患者制定個體化術后輔助治療方案，以減少復發和轉移，提高腫瘤患者的生存率和生活質量。實時定量PCR是目前檢測血液中腫瘤細胞最為敏感、最為特異的方法。但該技術用于外周血CTCs的檢測時要慎重，一方面可能存在假陽性和假陰性，比如污染因素和引物設計不合理可能導致假陽性，以及CTCs的不間斷脫落和腫瘤細胞的穩定性可能會產生假陰性。另一方面免疫系統對少數外周血CTCs有清除作用，所以未必都能檢測得到。
標志物的選擇是外周血中腫瘤細胞檢出的關鍵。但在宮頸癌的研究中尚未發現真正特異的腫瘤分子標志物，且敏感性和特異性相對較高的標志物也存在不同的說法甚至相反的報道，臨床意義還有待進一步探索。但必須相信隨著對宮頸癌CTCs研究的逐步深入，采用盡可能少且特異的指標聯合檢測宮頸癌的CTCs將對指導臨床有重要的意義。比如根據外周血中HPV DNA，SCCAg mRNA，Id mRNA及EPCAM mRNA等的表達作為宮頸癌的聯合檢測指標，這將對篩選術前存在CTCs的患者，以及對這部分患者的術后輔助性治療，提高宮頸癌的療效，降低術后復發率有重要的意義。然而這一想法需要有大量的樣本得到臨床證實。因此，宮頸癌CTCs檢測的臨床價值有待于開展大規模前瞻性隨機的研究。
宮頸癌是女性惡性腫瘤，其發病率及死亡率位居第二的，僅次于乳腺癌。隨著醫療技術的發展，宮頸癌在診斷治療方面取得一定進展，但大多數宮頸癌患者在初治兩年內會復發和轉移。據統計各種治療方法總共約有35%會復發[1]，7%～21%的會發生遠處轉移[1]。影響宮頸癌復發和轉移的因素很多，但究其根源，這主要和外周循環腫瘤細胞（CTCs）有關。CTCs是指由于自身脫落或其他原因從原發灶或轉移病灶進入外周血循環、淋巴循環的腫瘤細胞。目前尚無確切的檢測腫瘤早期轉移的手段，有效的早期干預不行，即使是高分辨率的影像學技術也無能為力。因此，有效發現外周血中的CTCs不僅對腫瘤的診斷，復發和預后的判斷有重要意義，而且對指導臨床治療也具有很大的價值。
1 CTCs概述
在一個多世紀以前，奧地利病理學家Ashworth[2]首次報道了在1例因癌癥死亡的患者的外周血中發現了類似腫瘤的細胞，并提出了CTCs的概念，此后人們對CTCs的研究逐步深化，近年來已經成為腫瘤研究熱點之一。大多數進入循環的腫瘤細胞在短期內死亡，只有生命力強、高度轉移潛能的CTCs存活下來，并在一定條件下發展為轉移灶。而外周血的CTCs能否形成遠處轉移灶與自身基因表達譜密切相關，有些CTCs在血液的剪切力以及免疫因子的作用下發生了凋亡；而有些CTCs能克服血液的剪切力及免疫系統的防御作用，最后發生遠處轉移。因此CTCs的轉移能力是由自身因素、周圍微環境及免疫系統等共同決定的。
CTCs狀態對遠處轉移灶的形成非常重要。首先外周血CTCs細胞數目較少，其次分離相對困難，且我們對其外周血中的增值特性了解較少，這都限制了對腫瘤復發轉移機制的探索。隨著分子生物學技術的發展，CTCs的檢測技術有了很大進步。目前CTCs檢測包括富集和檢測兩步：常用的富集技術主要有免疫磁分選，密度、梯度離心和細胞過濾等。檢測技術包括逆轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）、免疫組織化學技術（ICC）、熒光原位雜交技術（FISH）和流式細胞術（FCM）等。由富集及檢測技術相結合的分析技術即細胞檢測系統在2004年經美國食品藥品監督管理局（FDA）批準上市，此方法可檢測出乳腺癌等實體瘤外周血中的CTCs[3]，且研究證實檢測結果與RT-PCR方法具有高度一致性[4]。這為CTCs的進一步研究提供了更廣闊的技術平臺，如通過流式細胞術檢測CTCs表面的特異抗體等。但目前CTCs檢測仍面臨著很多難題，如CTCs的間斷性脫落，基因的不穩定性，這些因素增加了研究腫瘤復發轉移機制的難度。
CTCs具有重要的臨床價值，乳腺癌、胃腸癌、前列腺癌和食管癌等多種腫瘤患者外周血中的CTCs都與疾病進展及不良預后有關。研究較多的是在乳腺癌，如Cristofanilli[5] 在做乳腺癌的臨床實驗中，檢測177例轉移性乳腺癌患者7.5 mL外周血中CTCs的數量，發現治療前外周血中CTCs≥5較CTCs＜5的患者預后差，經過統計分析顯示CTCs可作為預后的獨立因素，在治療期間檢測CTCs的動態變化能反映疾病的進展情況。實時定量RT-PCR檢測食管癌患者CEAmRNA發現剛手術后的患者外周血中CTCs最多，提示外周血中CTCs可能與腫瘤的轉移有關。但單憑CTCs并不能預測腫瘤轉移，因為這些CTCs中的大部分不久就會進入自殺程序，只有極少數的細胞具有轉移的潛能。
2 CTCs在宮頸癌的臨床應用
2.1 宮頸癌CTCs的標志物
外周血CTCs的檢測的特異性取決于血清標志物的選擇。不同的腫瘤類型有不同的腫瘤標志物，如乳腺癌[上皮細胞黏附分子（EPCAM），細胞角質素8、18和19等，表皮生長因子受體（EGFR），MUC-1，HER-2]，前列腺癌[EPCAM，前列腺特異抗原（PSA）]，以及結直腸癌[癌胚抗原（CEA），細胞角質素20，EGFR）]。它們均可作為標志物用于CTCs檢測，如在患者外周血中檢測到這些特異的標志物，則提示腫瘤的存在。
研究表明，99.0%以上的宮頸癌患者可檢測到人乳頭瘤病毒（HPV），HPV DNA的E6/E7基因整合到宿主基因并穩定表達與宮頸癌的發生，發展關系密切。Liu等[6]在治療前對60例宮頸癌患者進行HPV DNA 檢測，陽性率為20.0%（12/60）。Pao等[7]應用巢式RT-PCR技術檢測15例Ⅳ期宮頸癌患者外周血的HPV16，結果顯示HPV16的陽性表達率為86.7% （13/15），且13例陽性患者外周血的HPV16的檢出率為92.3%（12/13），而HPV陰性者和正常對照組均未檢測出HPV16的表達。據以上文獻可知，患者外周血HPV的檢出率為20.0%～92.3%，也提示宮頸癌患者外周血HPV16 mRNA的存在可作為檢測CTCs的一個敏感指標。但由于并非所有的宮頸癌均有HPV16、18感染，如鼻咽癌、乳腺癌等也與HPV感染有關，所以將HPV DNA作為CTCs的檢測有一定局限性。
同時，已有研究以鱗狀上皮細胞抗原（SCCA）作為腫瘤標志物檢測宮頸癌患者外周血的CTCs。如Duk等[8]采用酶聯免疫檢測，研究結果顯示患者血清SCCA的陽性表達率為55.7%，且多因素分析SCCA可作為宮頸癌的獨立預后指標。同時Stenman等[9]采用RT-PCR技術，檢測了15例宮頸癌患者外周血中的SCCAs，其陽性率為40.0%，跟蹤隨訪了2年后其中6例SCCA陽性者中3例復發，而9例陰性者有2例復發。綜上所述SCCA將有助于宮頸癌的分期和預后判斷。
最近還有研究用宮頸癌的相關腫瘤標志物來檢測CTCs，如趙新玲等[10]采用RT-PCR法檢測宮頸癌患者外周血中MAGEA3、hSTC1mRNA的表達，將腫瘤患者實驗結果和臨床病理結合分析發現，MAGEA3、hSTC1mRNA在早期宮頸癌和對照組的陽性表達率分別為46.7%和0.4%和0.0%，差異有顯著性（P＜0.05），說明用宮頸癌患者外周血MAGEA3和hSTC1mRNA的表達來判斷早期宮頸癌患者外周血中存在循環腫瘤細胞是可行的。陳魯等[11]也應用RT-PCR檢測了291例0～ⅡA期宮頸癌外周血的CK19mRNA的表達，陽性表達率為19.9%，結合臨床病理資料分析，宮頸癌外周血CK19 mRNA陽性與臨床分期、淋巴結轉移、淋巴血管間隙受侵和深肌層浸潤存在明顯的相關性（P＜0.05），所以可認為CK19 mRNA 也可作為檢測宮頸癌外周血循環腫瘤細胞的指標之一。
2.2 宮頸癌CTCs標志物的探索方向
2.2.1 上皮特異性細胞粘附分子（EpCAM）
EpCAM常被用作CTCs的檢測標志，因為它以多聚體的形式廣泛表達于上皮組織表面。有研究顯示在人的131種腫瘤中有98種腫瘤表達EpCAM，EpCAM在多種惡性腫瘤中均呈高表達，如結直腸癌、前列腺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等[12]。嚴穎等[13]用RT-PCR的方法以EpCAM為標志，檢測轉移性乳癌外周血的CTCs，結果顯示轉移性乳癌患者的EpCAM mRNA陽性率在化療前及第1周期化療后分別為37.8%和42.6%，且轉移生存分析顯示第1周期化療后EpCAM陽性的患者與EpCAM陰性的患者相比，中位病情進展時間明顯縮短，分別為7.1月和11.1月（P= 0.013）。盡管目前無研究表明EpCAM在宮頸癌組織中高表達，但正常宮頸上皮有EpCAM的表達，且外周血細胞不表達EpCAM，所以它有可能作為檢測宮頸癌CTCs的分子標志物之一，來預測宮頸癌的復發和轉移。
2.2.2 分子抑制因子（Id-1）
近期研究發現，Id-1在實體瘤如乳癌，前列腺癌，宮頸癌腫瘤中表達比對照組高，且上調程度與患者預后密切相關[14, 15]。已有研究采用免疫組化和RT-PCR對上百例的宮頸癌，癌前病變和正常宮頸組織進行檢測，結果顯示Id-1的蛋白水平和mRNA水平在子宮頸癌組織中高表達，且Id-1的表達水平與腫瘤分化，淋巴轉移，間質浸潤等惡性行為密切相關。體外的實驗也表明，HPV陽性的宮頸癌細胞株Siha和Caski的Id-1表達水平也高于正常宮頸上皮永生化的細胞株。從理論上可以考慮將Id-1作為宮頸癌CTCs檢測的腫瘤標志物之一。但是不是其他細胞也有表達，這都有待于進一步的實驗室研究和大規模的臨床實驗研究。
2.2.3 游離DNA
游離DNA又稱循環DNA，是一種無細胞狀態的胞外DNA，存在于血清或血漿，腦脊液及滑膜液等體液中。Leon等[16]首先報道腫瘤患者外周血游離DNA水平高于正常人，同時研究發現Ⅰ期宮頸癌患者的血漿DNA水平明顯高于正常組，說明血漿DNA水平的升高在宮頸癌的早期就已發生，提示血漿DNA水平有助于宮頸癌的篩查和早期診斷。但診斷的敏感性不高，如果與其他多種血漿腫瘤標志物聯合檢測，可進一步提高檢測的敏感性。腫瘤患者游離DNA水平的檢測可作為腫瘤治療后預測復發的潛在指標。但由于游離DNA的微量存在，使得目前DNA的提取比較困難，再加上試劑昂貴，所以迫切需要建立實用性較強的檢測方法。
3 存在問題和展望
目前，對宮頸癌的復發和轉移的診斷技術仍停留在傳統的病理組織水平，而外周血CTCs的存在，作為無創性的指標檢測將為宮頸癌患者制定個體化術后輔助治療方案，以減少復發和轉移，提高腫瘤患者的生存率和生活質量。實時定量PCR是目前檢測血液中腫瘤細胞最為敏感、最為特異的方法。但該技術用于外周血CTCs的檢測時要慎重，一方面可能存在假陽性和假陰性，比如污染因素和引物設計不合理可能導致假陽性，以及CTCs的不間斷脫落和腫瘤細胞的穩定性可能會產生假陰性。另一方面免疫系統對少數外周血CTCs有清除作用，所以未必都能檢測得到。
標志物的選擇是外周血中腫瘤細胞檢出的關鍵。但在宮頸癌的研究中尚未發現真正特異的腫瘤分子標志物，且敏感性和特異性相對較高的標志物也存在不同的說法甚至相反的報道，臨床意義還有待進一步探索。但必須相信隨著對宮頸癌CTCs研究的逐步深入，采用盡可能少且特異的指標聯合檢測宮頸癌的CTCs將對指導臨床有重要的意義。比如根據外周血中HPV DNA，SCCAg mRNA，Id mRNA及EPCAM mRNA等的表達作為宮頸癌的聯合檢測指標，這將對篩選術前存在CTCs的患者，以及對這部分患者的術后輔助性治療，提高宮頸癌的療效，降低術后復發率有重要的意義。然而這一想法需要有大量的樣本得到臨床證實。因此，宮頸癌CTCs檢測的臨床價值有待于開展大規模前瞻性隨機的研究。