引用本文： 姬巧云, 張會東, 羅珊, 毛萌. 不同營養模式對宮內發育遲緩幼鼠胰島素樣生長因子及受體表達的影響. 華西醫學, 2014, 29(2): 277-281. doi: 10.7507/1002-0179.20140085 復制
胰島素樣生長因子（IGF）在胎兒早期生長發育過程中可能起著重要的作用。1957年Salmon等[1]發現生長激素（GH）是通過IGF介導而發揮其硫酸鹽活性。IGF包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ分別由70個氨基酸和167個氨基酸組成，相對分子質量7 647×103。宮內發育遲緩（IUGR）的病因多而復雜，有研究表明IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ系統在其發病中有重要作用[2, 3]。多肽糖蛋白金屬蛋白酶12（ADAM-12）和孕期相關血漿蛋白酶A（PAPP-A）是屬于IGF系統中的兩個因子[4, 5]，在生長發育過程當中非常重要，而且ADAM12和PAPP-A的量與染色體的異常性相關，特別是與糖尿病中胰島素的分泌量具有相關性，因此通過檢測ADAM12和PAPP-A可以了解IUGR發生后追趕生長過程中IUGR與繼發性糖尿病之間的關聯性。IGF主要通過與Toll樣受體（TLR-4）相互作用而在機體發揮作用，但是TLR-4可以通過信號傳導途徑引起炎癥因子的分泌增加，引起脂肪炎癥和胰島素抵抗[6, 7]。因此，有必要考察和研究IGF及其受體在IUGR及其繼發性糖尿病發生發展過程中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無交配史SD健康大鼠30只，雌雄2︰1分籠飼養，日齡70～80 d，體質量220～250 g，由成都血液病研究所動物中心提供。大鼠飼養在安靜、通風、清潔的環境中，保持室溫23～25℃，濕度60%，給予相應的飼料和充足的飲水。雌鼠與雄鼠交配受孕后，母鼠采用全程饑餓法建立IUGR動物模型[8]，母鼠分為未懷孕對照組、懷孕對照組和懷孕實驗組；未懷孕對照組和懷孕對照組給予充足的標準飼料；懷孕實驗組給予標準飼料，為懷孕對照組的一半。懷孕對照組大鼠生下幼鼠后給予充足的正常標準飼料。實驗組母鼠受孕后第1天起給予對照組50%的進食量，直至自然分娩。所生新生仔鼠出生體質量在正常新生仔鼠平均體質量減去2倍標準差以下者為IUGR新生鼠，鼠仔每窩超過10只以上者隨機舍棄部分鼠仔，使每窩鼠仔控制在8～10只。IUGR新生幼鼠隨機分為4組，新生幼鼠母乳喂養，各組分別給予母鼠上述相應飲食飼料喂養3周至斷乳：① IUGR對照組給予常規飲食；② IUGR高糖飲食組（A組）；③ IUGR高蛋白飲食組（B組）；④ IUGR高脂飲食組（C組）。各組幼鼠在3周哺乳期間母鼠分別攝取上述飼料。各組幼鼠斷乳后分別攝取上述飼料至滿月。另以正常母鼠所生正常新生雌鼠為正常對照組（C/N組）。生后母乳喂養至3周斷乳，母鼠及斷乳后幼鼠均給予常規飲食喂養。
1.2 飼料構成
本實驗所需飼料由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。其配方如下：① 標準飼料配方：豆粉10%、大麥粉20%、魚粉10%、玉米粉16%、骨粉5%、酵母1%、脫水菜20%、食鹽2%；② 高蛋白飼料配方：在標準飼料蛋白含量的基礎上增加20%的蛋白，即25.2 kg的標準飼料加入1.65 kg雞蛋；③ 高糖飼料配方：在標準飼料糖含量的基礎上增加20%的糖，即25.2 kg的標準飼料加入6.95 kg白糖；④ 高脂肪飼料配方：在標準飼料脂肪含量的基礎上增加20%的脂肪，即25.2 kg的標準飼料加入0.277 kg的豬油。
1.3 肝組織和肺組織的免疫組織化學染色
各組新生幼鼠滿1、2、3、4月齡時分別隨機處死6只，處死后立即取組織進行染色。載玻片采用Poly-L-Lysine法進行處理。幼鼠的肝、肺采用4%的中性多聚甲醛固定液4℃固定，用石蠟包埋切片，每個石蠟標本連續4 μm厚連續切片3張備用。免疫組織化學采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法進行染色，一抗采用購自美國Invitrogen公司的兔抗鼠的多克隆抗體，稀釋度為1︰200，二抗采用購自美國Invitrogen公司的羊抗兔的多克隆抗體，稀釋度為1︰50。石蠟切片二甲苯脫蠟，枸櫞酸鹽修復抗原，加入一抗后4℃過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗3次，加入二抗，30 min后PBS洗3次，加入辣根過氧化物酶（HRP），30 min后PBS洗4次，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，冷水終止，蘇木精襯染，脫水后封固處理 。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知的陽性對照片作為陽性對照。
結果判定和分析：① 染色結果的觀察：陽性結果表現為相應部位出現黃色-棕褐色顆粒物質；② 顯微圖像采集系統內觀察組織抗原的表達情況，每張切片隨機選取6個不同視野進行觀察，采用Image-pro plus 5.0軟件進行圖像分析。
1.4 胰腺組織的染色
組織切片后采用蘇木精-伊紅（HE）染色。幼鼠的肝、肺采用4%的中性多聚甲醛固定液4℃固定，用石蠟包埋切片，每個石蠟標本連續4 μm厚連續切片3 張備用。石蠟切片二甲苯脫蠟，蘇木精染色2 min，鹽酸乙醇分化20 s，自來水洗終止，伊紅染色30 s，自來水洗，乙醇脫水，用蓋玻片封好后顯微鏡觀察幼鼠胰腺組織的細胞形態。
1.5 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件包對數據進行處理和統計學分析，資料采用秩和檢驗，以P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 ADAM12的檢測結果
幼鼠ADAM12的測定結果各個月之間均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1、圖 1。
圖1
肝ADAM12的免疫組織化學染色像（SP×400） 1a.陰性結果 1b.陽性結果（+） 1c.陽性結果（++） 1d.陽性結果（+++） ? ?圖 2 肝PAPP-A的免疫組織化學染色像（SP×400） 2a.陰性結果 2b.陽性結果（+） 2c. 陽性結果（++） 2d.陽性結果（+++） ? ? 圖 3肺TLR-4的免疫組織化學染色像（SP×400） 3a.陰性結果 3b.陽性結果（+） 3c. 陽性結果（++） 3d.陽性結果（+++） ? ? 圖 4胰腺組織的HE染色像（HE×400） 陰陽性的結果判定是出血和炎性細胞的浸潤 4a. 胰腺組織陰性對照 4b.胰腺組織陽性結果
表1
各組幼鼠不同時間的ADAM12陽性結果（n=6，例）
2.2 PAPP-A的測定結果
幼鼠PAPP-A的測定結果在各組幼鼠的第1個月有統計學意義（P＜0.05），但是在第2、3、4個月無統計學意義（P＞0.05）。見表 2、圖 2。
表2
各組幼鼠不同時間的PAPP-A陽性結果（n=6，例）
2.3 TLR-4的測定結果
幼鼠TIR-4的測定結果各個月之間無統計學意義（P＞0.05）。見表 3、圖 3。
表3
各組幼鼠不同時間的TLR-4陽性結果（n=6，例）
2.4 胰腺組織染色的結果
幼鼠胰腺組織結果在幼鼠的第1個月有統計學意義（P＜0.05），但是在第2、3、4個月無統計學意義（P＞0.05）。見表 4、圖 4。
表4
各組幼鼠不同時間的胰腺組織染色陽性結果（n=6，例）
3 討論
IUGR是妊娠的重要結局，也是造成圍產兒死亡的重要原因之一，其死亡率為正常新生兒的4～6 倍[9]，同時IUGR約有10%～20%生后未能追趕生長，成年期后仍持續保持小個體矮身材。1998年Lucas[10]基于早期營養對生長的重要作用，提出了“營養程序化”的概念，即在發育的關鍵或敏感時期的營養狀況，將對機體或功能產生長期或終生的影響。目前研究表明生后早期的生長主要受“營養物質-胰島素-胰島素樣生長因子”代謝軸的調控[11-13]，該時期IGF的啟動因素是營養物質，而且經由胰島素而非生長激素介導分泌的。IGF是體內一種既有胰島素樣合成代謝作用又有促生長作用的多肽，包括IGFⅠ和IGFⅡ，可由多種組織產生和分泌，肝臟是主要的合成場所，它們主要通過與IGF 受體相互作用而發揮其促生長和胰島素樣代謝效應[11]，其中IGFⅠ在早期生長中起主要作用。IGFⅠ可以通過刺激細胞分化增殖，抑制蛋白質分解，增強機體對葡萄糖、氨基酸攝取，從而促進生長。生后早期營養是IGFⅠ的重要調節因子，血清中IGFⅠ水平可反映當時的營養狀態和營養不良的程度。Ozkan等[14]報道呈現生長追趕的IUGR患兒IGFⅠ水平顯著高于不出現生長追趕的IUGR患兒，提示IGFⅠ與IUGR患兒的早期生長追趕關系密切。
ADAM12和PAPP-A是屬于IGF系統中的兩個因子[2, 3]，在生長發育過程中非常重要，而且ADAM12和PAPP-A的量與染色體的異常性相關，特別是與糖尿病中胰島素的分泌量具有相關性。本研究發現ADAM12在實驗組和對照組之間沒有明顯的統計學意義，但是在第1個月和第4個月這兩個時間點P值很接近0.05，可能是樣本量偏少的緣故，值得進一步擴大樣本進行研究。同時本研究也發現PAPP-A在第1個月的時間點有統計學意義，其他時間點沒有統計學意義；在第1個月的時間點的結果，高脂飲食組的數據要比其他組的高。ADAM12和PAPP-A的結果提示ADAM12和PAPP-A的表達量或許與幼鼠的追趕生長密切相關，這時由于受到動物脂質代謝的影響，高脂飲食組的PAPP-A還偏高；同時表明“營養物質-胰島素-胰島素樣生長因子”代謝軸在動物的追趕生長過程中確實起著重要作用。
IGF在體內的受體為TLR-4，該受體與炎癥因子的產生密切相關[15, 16]，也可能與急性壞死性胰腺炎相關[6]。有研究表明TLR-4與脂肪炎癥和胰島素抵抗有密切關系[4, 17, 18]，同時TLR-4也與糖尿病及其并發癥的發生、發展有密切關系[19, 20]，因此可通過對該受體的檢測了解IUGR與發生繼發糖尿病之間有無一定的關聯。本研究中TLR-4的檢測結果在統計學上無明顯的意義，但是我們可以看到對照組中TLR-4的陽性程度基本上處于穩定狀態，高蛋白飲食組的陽性程度在逐步降低，而高糖飲食組和高脂飲食組的陽性程度在逐步增加，而且高糖組增加的幅度在增大。胰腺組織在糖尿病發生過程中有細胞變性或者功能下降的表現，本研究結果顯示胰腺組織的結果在第1個月時間點具有統計學意義，其他3個時間點無統計學意義；但是對照組基本上都處于陰性，高蛋白飲食組先有陽性，但最后消失，而高糖飲食組和高脂飲食組早期呈陰性結果，但隨著時間的推移，陽性結果在增加，說明胰腺發生炎癥的可能性比較大。但是由于樣本量、觀察時間的關系，實驗結果并不太明顯，這需要進一步的實驗加以驗證。
綜上所述，不同的營養模式對IUGR幼鼠IGF的表達在追趕生長過程中具有一定的影響，但是在追趕生長結束后基本上無影響；但是不同的營養模式對IUGR幼鼠IGF受體表達的影響在追趕生長結束后可能更大一些。
胰島素樣生長因子（IGF）在胎兒早期生長發育過程中可能起著重要的作用。1957年Salmon等[1]發現生長激素（GH）是通過IGF介導而發揮其硫酸鹽活性。IGF包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ分別由70個氨基酸和167個氨基酸組成，相對分子質量7 647×103。宮內發育遲緩（IUGR）的病因多而復雜，有研究表明IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ系統在其發病中有重要作用[2, 3]。多肽糖蛋白金屬蛋白酶12（ADAM-12）和孕期相關血漿蛋白酶A（PAPP-A）是屬于IGF系統中的兩個因子[4, 5]，在生長發育過程當中非常重要，而且ADAM12和PAPP-A的量與染色體的異常性相關，特別是與糖尿病中胰島素的分泌量具有相關性，因此通過檢測ADAM12和PAPP-A可以了解IUGR發生后追趕生長過程中IUGR與繼發性糖尿病之間的關聯性。IGF主要通過與Toll樣受體（TLR-4）相互作用而在機體發揮作用，但是TLR-4可以通過信號傳導途徑引起炎癥因子的分泌增加，引起脂肪炎癥和胰島素抵抗[6, 7]。因此，有必要考察和研究IGF及其受體在IUGR及其繼發性糖尿病發生發展過程中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
無交配史SD健康大鼠30只，雌雄2︰1分籠飼養，日齡70～80 d，體質量220～250 g，由成都血液病研究所動物中心提供。大鼠飼養在安靜、通風、清潔的環境中，保持室溫23～25℃，濕度60%，給予相應的飼料和充足的飲水。雌鼠與雄鼠交配受孕后，母鼠采用全程饑餓法建立IUGR動物模型[8]，母鼠分為未懷孕對照組、懷孕對照組和懷孕實驗組；未懷孕對照組和懷孕對照組給予充足的標準飼料；懷孕實驗組給予標準飼料，為懷孕對照組的一半。懷孕對照組大鼠生下幼鼠后給予充足的正常標準飼料。實驗組母鼠受孕后第1天起給予對照組50%的進食量，直至自然分娩。所生新生仔鼠出生體質量在正常新生仔鼠平均體質量減去2倍標準差以下者為IUGR新生鼠，鼠仔每窩超過10只以上者隨機舍棄部分鼠仔，使每窩鼠仔控制在8～10只。IUGR新生幼鼠隨機分為4組，新生幼鼠母乳喂養，各組分別給予母鼠上述相應飲食飼料喂養3周至斷乳：① IUGR對照組給予常規飲食；② IUGR高糖飲食組（A組）；③ IUGR高蛋白飲食組（B組）；④ IUGR高脂飲食組（C組）。各組幼鼠在3周哺乳期間母鼠分別攝取上述飼料。各組幼鼠斷乳后分別攝取上述飼料至滿月。另以正常母鼠所生正常新生雌鼠為正常對照組（C/N組）。生后母乳喂養至3周斷乳，母鼠及斷乳后幼鼠均給予常規飲食喂養。
1.2 飼料構成
本實驗所需飼料由四川大學華西醫學中心實驗動物中心提供。其配方如下：① 標準飼料配方：豆粉10%、大麥粉20%、魚粉10%、玉米粉16%、骨粉5%、酵母1%、脫水菜20%、食鹽2%；② 高蛋白飼料配方：在標準飼料蛋白含量的基礎上增加20%的蛋白，即25.2 kg的標準飼料加入1.65 kg雞蛋；③ 高糖飼料配方：在標準飼料糖含量的基礎上增加20%的糖，即25.2 kg的標準飼料加入6.95 kg白糖；④ 高脂肪飼料配方：在標準飼料脂肪含量的基礎上增加20%的脂肪，即25.2 kg的標準飼料加入0.277 kg的豬油。
1.3 肝組織和肺組織的免疫組織化學染色
各組新生幼鼠滿1、2、3、4月齡時分別隨機處死6只，處死后立即取組織進行染色。載玻片采用Poly-L-Lysine法進行處理。幼鼠的肝、肺采用4%的中性多聚甲醛固定液4℃固定，用石蠟包埋切片，每個石蠟標本連續4 μm厚連續切片3張備用。免疫組織化學采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶（SP）法進行染色，一抗采用購自美國Invitrogen公司的兔抗鼠的多克隆抗體，稀釋度為1︰200，二抗采用購自美國Invitrogen公司的羊抗兔的多克隆抗體，稀釋度為1︰50。石蠟切片二甲苯脫蠟，枸櫞酸鹽修復抗原，加入一抗后4℃過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗3次，加入二抗，30 min后PBS洗3次，加入辣根過氧化物酶（HRP），30 min后PBS洗4次，二氨基聯苯胺（DAB）顯色，冷水終止，蘇木精襯染，脫水后封固處理 。以PBS代替一抗作為陰性對照，以已知的陽性對照片作為陽性對照。
結果判定和分析：① 染色結果的觀察：陽性結果表現為相應部位出現黃色-棕褐色顆粒物質；② 顯微圖像采集系統內觀察組織抗原的表達情況，每張切片隨機選取6個不同視野進行觀察，采用Image-pro plus 5.0軟件進行圖像分析。
1.4 胰腺組織的染色
組織切片后采用蘇木精-伊紅（HE）染色。幼鼠的肝、肺采用4%的中性多聚甲醛固定液4℃固定，用石蠟包埋切片，每個石蠟標本連續4 μm厚連續切片3 張備用。石蠟切片二甲苯脫蠟，蘇木精染色2 min，鹽酸乙醇分化20 s，自來水洗終止，伊紅染色30 s，自來水洗，乙醇脫水，用蓋玻片封好后顯微鏡觀察幼鼠胰腺組織的細胞形態。
1.5 統計學方法
采用SPSS 13.0統計軟件包對數據進行處理和統計學分析，資料采用秩和檢驗，以P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 ADAM12的檢測結果
幼鼠ADAM12的測定結果各個月之間均無統計學意義（P＞0.05）。見表 1、圖 1。
圖1
肝ADAM12的免疫組織化學染色像（SP×400） 1a.陰性結果 1b.陽性結果（+） 1c.陽性結果（++） 1d.陽性結果（+++） ? ?圖 2 肝PAPP-A的免疫組織化學染色像（SP×400） 2a.陰性結果 2b.陽性結果（+） 2c. 陽性結果（++） 2d.陽性結果（+++） ? ? 圖 3肺TLR-4的免疫組織化學染色像（SP×400） 3a.陰性結果 3b.陽性結果（+） 3c. 陽性結果（++） 3d.陽性結果（+++） ? ? 圖 4胰腺組織的HE染色像（HE×400） 陰陽性的結果判定是出血和炎性細胞的浸潤 4a. 胰腺組織陰性對照 4b.胰腺組織陽性結果
表1
各組幼鼠不同時間的ADAM12陽性結果（n=6，例）
2.2 PAPP-A的測定結果
幼鼠PAPP-A的測定結果在各組幼鼠的第1個月有統計學意義（P＜0.05），但是在第2、3、4個月無統計學意義（P＞0.05）。見表 2、圖 2。
表2
各組幼鼠不同時間的PAPP-A陽性結果（n=6，例）
2.3 TLR-4的測定結果
幼鼠TIR-4的測定結果各個月之間無統計學意義（P＞0.05）。見表 3、圖 3。
表3
各組幼鼠不同時間的TLR-4陽性結果（n=6，例）
2.4 胰腺組織染色的結果
幼鼠胰腺組織結果在幼鼠的第1個月有統計學意義（P＜0.05），但是在第2、3、4個月無統計學意義（P＞0.05）。見表 4、圖 4。
表4
各組幼鼠不同時間的胰腺組織染色陽性結果（n=6，例）
3 討論
IUGR是妊娠的重要結局，也是造成圍產兒死亡的重要原因之一，其死亡率為正常新生兒的4～6 倍[9]，同時IUGR約有10%～20%生后未能追趕生長，成年期后仍持續保持小個體矮身材。1998年Lucas[10]基于早期營養對生長的重要作用，提出了“營養程序化”的概念，即在發育的關鍵或敏感時期的營養狀況，將對機體或功能產生長期或終生的影響。目前研究表明生后早期的生長主要受“營養物質-胰島素-胰島素樣生長因子”代謝軸的調控[11-13]，該時期IGF的啟動因素是營養物質，而且經由胰島素而非生長激素介導分泌的。IGF是體內一種既有胰島素樣合成代謝作用又有促生長作用的多肽，包括IGFⅠ和IGFⅡ，可由多種組織產生和分泌，肝臟是主要的合成場所，它們主要通過與IGF 受體相互作用而發揮其促生長和胰島素樣代謝效應[11]，其中IGFⅠ在早期生長中起主要作用。IGFⅠ可以通過刺激細胞分化增殖，抑制蛋白質分解，增強機體對葡萄糖、氨基酸攝取，從而促進生長。生后早期營養是IGFⅠ的重要調節因子，血清中IGFⅠ水平可反映當時的營養狀態和營養不良的程度。Ozkan等[14]報道呈現生長追趕的IUGR患兒IGFⅠ水平顯著高于不出現生長追趕的IUGR患兒，提示IGFⅠ與IUGR患兒的早期生長追趕關系密切。
ADAM12和PAPP-A是屬于IGF系統中的兩個因子[2, 3]，在生長發育過程中非常重要，而且ADAM12和PAPP-A的量與染色體的異常性相關，特別是與糖尿病中胰島素的分泌量具有相關性。本研究發現ADAM12在實驗組和對照組之間沒有明顯的統計學意義，但是在第1個月和第4個月這兩個時間點P值很接近0.05，可能是樣本量偏少的緣故，值得進一步擴大樣本進行研究。同時本研究也發現PAPP-A在第1個月的時間點有統計學意義，其他時間點沒有統計學意義；在第1個月的時間點的結果，高脂飲食組的數據要比其他組的高。ADAM12和PAPP-A的結果提示ADAM12和PAPP-A的表達量或許與幼鼠的追趕生長密切相關，這時由于受到動物脂質代謝的影響，高脂飲食組的PAPP-A還偏高；同時表明“營養物質-胰島素-胰島素樣生長因子”代謝軸在動物的追趕生長過程中確實起著重要作用。
IGF在體內的受體為TLR-4，該受體與炎癥因子的產生密切相關[15, 16]，也可能與急性壞死性胰腺炎相關[6]。有研究表明TLR-4與脂肪炎癥和胰島素抵抗有密切關系[4, 17, 18]，同時TLR-4也與糖尿病及其并發癥的發生、發展有密切關系[19, 20]，因此可通過對該受體的檢測了解IUGR與發生繼發糖尿病之間有無一定的關聯。本研究中TLR-4的檢測結果在統計學上無明顯的意義，但是我們可以看到對照組中TLR-4的陽性程度基本上處于穩定狀態，高蛋白飲食組的陽性程度在逐步降低，而高糖飲食組和高脂飲食組的陽性程度在逐步增加，而且高糖組增加的幅度在增大。胰腺組織在糖尿病發生過程中有細胞變性或者功能下降的表現，本研究結果顯示胰腺組織的結果在第1個月時間點具有統計學意義，其他3個時間點無統計學意義；但是對照組基本上都處于陰性，高蛋白飲食組先有陽性，但最后消失，而高糖飲食組和高脂飲食組早期呈陰性結果，但隨著時間的推移，陽性結果在增加，說明胰腺發生炎癥的可能性比較大。但是由于樣本量、觀察時間的關系，實驗結果并不太明顯，這需要進一步的實驗加以驗證。
綜上所述，不同的營養模式對IUGR幼鼠IGF的表達在追趕生長過程中具有一定的影響，但是在追趕生長結束后基本上無影響；但是不同的營養模式對IUGR幼鼠IGF受體表達的影響在追趕生長結束后可能更大一些。
