引用本文： 李浩, 徐敏. 地塞米松治療坐骨神經非凍結性冷損傷的實驗研究. 華西醫學, 2014, 29(2): 219-222. doi: 10.7507/1002-0179.20140068 復制
自希波克拉底時代起，非凍結性冷損傷影響周圍神經的報道就多見于歷次戰爭中，例如兩次世界大戰及朝鮮戰爭中的“戰壕足”現象。即使在當今的和平年代，非凍結性冷損傷在我國某些人群的發病率也可高達8.7%[1]。2008年雪災時，非凍結性冷損傷在寧波地區發生率為12.78%，占傷害類型的67.28%，給人民健康帶來了不利影響[2]。目前非凍結性冷損傷的發生機制仍未明確，治療方法也存在誤區。治療方法不當可導致冷損傷的傷殘率高達92.8%[3]。本實驗在前期研究的基礎上[4-6]，探討地塞米松治療神經非凍結性冷損傷時的療效，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
無特定病原體級健康雄性Wistar大鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司），體質量350～400 g。制冷裝置選擇德國優萊博公司生產的制冷和加熱循環器（F12-ED），測溫裝置選擇優利德專業型數字測溫表（UT325A）。
1.2 方法
1.2.1 坐骨神經冷損傷模型
實驗模型的制作（圖 1）參考Jia等[4]的方法：用2%戊巴比妥鈉以0.25 mL/100 g 體質量的劑量腹腔麻醉大鼠。麻醉后大鼠俯臥位固定，在其大腿根部常規備皮、消毒，于菱形窩處皮膚上作一個3 cm長切口，充分暴露坐骨神經后，將其置于已預冷的銅槽中，神經表面滴石蠟油，使神經溫度維持在3～5℃。根據實驗需要選擇受冷時間，受冷結束后直接將神經從銅槽中移出。同樣暴露對側坐骨神經，不給予低溫處理，作為對照。術中大鼠身下用電熱毯維持肛門溫度在35℃以上。術中每20分鐘記錄1次循環水及神經的溫度。
圖1
實驗裝置的設計[4] 銅質中空管道與制冷裝置連接，形成相對的入水和出水端，其轉折處形成與坐骨神經直徑相當的袖管外型。將神經置于其上，使之不受任何壓力。在袖管底部和神經之上可放置測溫裝置，用于測定制冷溫度和神經實際溫度，兩點間溫差不超過0.2℃
1.2.2 動物分組
將12只大鼠隨機分組：① 低溫組6只，實驗側坐骨神經予以3～5℃持續低溫2 h；② 干預組6只，實驗側坐骨神經予以3～5℃持續低溫2 h，完畢后立即腹腔注射地塞米松（0.5 mg/kg）。每組于冷損傷后24 h采集坐骨神經標本。同時每只大鼠暴露對側坐骨神經，不給予低溫處理，作為對照。
1.2.3 標本取材、處理
到達取材時間后，麻醉大鼠迅速取下雙側坐骨神經，按以下步驟操作：① 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛中4℃固定2 h；② 0.1 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH值7.4）浸泡3次，10 min/次；③ 四氧化鋨固定，乙醇脫水，環氧樹脂Epon812包埋；④ 制備1 μm半薄切片，用甲苯胺藍染色后光學顯微鏡下觀察；⑤ 制備5 nm超薄切片，醋酸鈾-枸椽酸鉛染色后用荷蘭Philips EM208s型透射電子顯微鏡觀察。
2 結果
2.1 大鼠坐骨神經光學顯微鏡下的形態比較
對照側坐骨神經僅少量有髓纖維出現空或暗軸索，伴隨正常的神經內膜毛細血管（圖 2a）。低溫組冷損傷后24 h，許多有髓纖維出現以巨大、空或萎縮、暗為形式的軸索退變。由于內皮細胞腫脹，神經內膜毛細血管管腔狹窄（圖 2b）。干預組經過地塞米松治療后，有髓纖維仍可見以巨大、空或萎縮、暗為形式的軸索退變，但神經內膜毛細血管管腔未見狹窄，血管內皮細胞無明顯腫脹（圖 2c）。
圖2
坐骨神經非凍結性冷損傷光學顯微鏡像（甲苯胺藍染色×400） 2a. 對照側坐骨神經 2b. 低溫組冷損傷后1 d，神經軸索出現以“暗、空”為主要表現的退變，并出現血管管腔狹窄和內皮細胞腫脹（黑箭） 2c. 干預組地塞米松干預后1 d，可見退變的軸索，但神經內膜血管內皮細胞未見明顯腫脹，管腔未見狹窄（黑箭） ? ?圖 3 坐骨神經非凍結性冷損傷電子顯微鏡像 3a. 對照側神經內膜血管內皮細胞大致正常（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色× 13 000） 3b. 對照側有髓纖維與無髓纖維基本正常（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×8 000） 3c. 低溫后1 d時低溫組神經內膜血管管腔狹窄（黑箭），內皮細胞增生（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×1 000） 3d. 低溫處理后1 d時低溫組神經軸膜下水腫、軸索受壓（黑箭），其中線粒體固縮（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×8 000） 3e. 地塞米松干預后，干預組神經內膜血管管腔正常，內皮細胞未見增生，正常紅細胞通過管腔（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×25 000） 3f. 地塞米松干預后，干預組神經有髓纖維髓鞘板層松散，軸索退變、受壓無髓纖維大致正常（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×6 300）
2.2 大鼠坐骨神經電子顯微鏡下的形態比較
對照側24 h時僅少量有髓纖維輕微板層松散，無髓纖維與神經內膜血管基本正常（圖 3a、3b）。低溫組24 h時，坐骨神經的有髓纖維已經出現嚴重病變（圖 3c、3d），表現為：髓鞘板層結構松散，乃至于結構完全消失；軸索輕則微絲溶解，重則結構消失，表現為“空軸索”；無髓纖維基本正常；神經內膜血管管腔狹窄，血管內皮細胞增生，但緊密連接未見破壞，血管內未見血小板激活與紅細胞淤滯。經過地塞米松干預后，干預組坐骨神經的有髓纖維病變未見緩解；無髓纖維正常；神經內膜血管管腔正常；血管內皮細胞未見增生，緊密連接未見破壞（圖 3e、3f）。
3 討論
在中樞神經系統內，血腦屏障使腦組織和血液隔絕，并對血液和腦組織之間的多種物質交換進行調控。當機體受到寒冷損傷時，由于氧化損傷導致的血腦屏障滲透性增加，血管內液滲出，引起繼發性腦水腫[7]。
在周圍神經系統內，神經組織的內環境也由相似的屏障進行維持，該屏障即稱為血-神經屏障。它由神經內膜微血管內皮細胞和神經束膜所組成。在大部分常見的周圍神經疾病中，如糖尿病周圍神經病、周圍神經壓榨傷，人們都發現了血-神經屏障的破壞[8, 9]。
Jia等[4]發現在非凍結性冷損傷時，坐骨神經微循環變化具有以下特點：① 低溫時坐骨神經內的小動脈、毛細血管前動脈、毛細血管和小靜脈血流逐漸減慢、中斷；低溫3 h微循環血流僅為正常值的25%；③ 復溫后，坐骨神經內大部分小動脈、小靜脈管徑輕微增加，出現微小的灌流；復溫5 d后微循環血流恢復到正常值的50%。提示坐骨神經非凍結性冷損傷中存在缺血-再灌注現象，必然會導致氧化損傷。而耿志偉等[10, 11]的研究也顯示在復溫階段，坐骨神經內氧自由基含量會顯著增多。氧自由基對周圍神經的損傷主要是破壞微血管內皮細胞，從而破壞血-神經屏障，導致神經內膜水腫[12]。神經內膜存在過多液體將會造成其內部壓力的迅速上升[13]，從而降低神經內膜血管直徑，引起血流阻力升高，加重神經內膜低氧。Olsson[14]曾指出這種類型的血-神經屏障損害也可能與神經內膜中的肥大細胞脫顆粒釋放的血管活性胺有關。血管活性胺可以破壞毛細血管的屏障作用，使其通透性增加。
糖皮質激素具有強大的抗炎和免疫抑制作用，常用來減輕水腫和損傷后的炎癥反應。它在治療神經損傷方面的主要機制是通過與磷脂的牢固結合，防止膜磷脂遭受自由基的攻擊和抑制損傷部位的脂質過氧化反應[15]。地塞米松屬于糖皮質激素類，具有抗炎、抗休克作用，能夠解除小動脈痙攣，改善微循環[16]。本研究發現給予地塞米松治療坐骨神經非凍結性冷損傷后，神經內膜毛細血管病變得到明顯改善，表明地塞米松具有保護血-神經屏障功能的作用。這種保護作用可能既與其抑制氧自由基的損傷作用有關，也與其能夠抑制肥大細胞脫顆粒存在一定關系。但值得關注的是，神經內膜的有髓纖維病變并未緩解，提示地塞米松對坐骨神經非凍結性冷損傷的治療作用可能僅限于血管系統。
目前周圍神經非凍結性冷損傷被看作一種“缺血疊加綜合征”，其損傷機制除缺血-再灌注損傷以外，還涉及了許多方面[6, 17]：如鈉離子通道的異常、主動轉運中溫度敏感性酶的失活、巨噬細胞對神經纖維的吞噬等，但具體途徑仍不清楚。地塞米松僅能夠對缺血-再灌注損傷途徑產生治療作用，而不能干預其他損傷途徑，因此尚不能完全緩解神經纖維的病變。因此，還應繼續開展對其損傷機制的深入研究。在臨床上對多個損傷途徑同時進行干預可能會取得更好的治療效果。
自希波克拉底時代起，非凍結性冷損傷影響周圍神經的報道就多見于歷次戰爭中，例如兩次世界大戰及朝鮮戰爭中的“戰壕足”現象。即使在當今的和平年代，非凍結性冷損傷在我國某些人群的發病率也可高達8.7%[1]。2008年雪災時，非凍結性冷損傷在寧波地區發生率為12.78%，占傷害類型的67.28%，給人民健康帶來了不利影響[2]。目前非凍結性冷損傷的發生機制仍未明確，治療方法也存在誤區。治療方法不當可導致冷損傷的傷殘率高達92.8%[3]。本實驗在前期研究的基礎上[4-6]，探討地塞米松治療神經非凍結性冷損傷時的療效，現報告如下。
1 材料與方法
1.1 材料
無特定病原體級健康雄性Wistar大鼠（北京維通利華實驗動物技術有限公司），體質量350～400 g。制冷裝置選擇德國優萊博公司生產的制冷和加熱循環器（F12-ED），測溫裝置選擇優利德專業型數字測溫表（UT325A）。
1.2 方法
1.2.1 坐骨神經冷損傷模型
實驗模型的制作（圖 1）參考Jia等[4]的方法：用2%戊巴比妥鈉以0.25 mL/100 g 體質量的劑量腹腔麻醉大鼠。麻醉后大鼠俯臥位固定，在其大腿根部常規備皮、消毒，于菱形窩處皮膚上作一個3 cm長切口，充分暴露坐骨神經后，將其置于已預冷的銅槽中，神經表面滴石蠟油，使神經溫度維持在3～5℃。根據實驗需要選擇受冷時間，受冷結束后直接將神經從銅槽中移出。同樣暴露對側坐骨神經，不給予低溫處理，作為對照。術中大鼠身下用電熱毯維持肛門溫度在35℃以上。術中每20分鐘記錄1次循環水及神經的溫度。
圖1
實驗裝置的設計[4] 銅質中空管道與制冷裝置連接，形成相對的入水和出水端，其轉折處形成與坐骨神經直徑相當的袖管外型。將神經置于其上，使之不受任何壓力。在袖管底部和神經之上可放置測溫裝置，用于測定制冷溫度和神經實際溫度，兩點間溫差不超過0.2℃
1.2.2 動物分組
將12只大鼠隨機分組：① 低溫組6只，實驗側坐骨神經予以3～5℃持續低溫2 h；② 干預組6只，實驗側坐骨神經予以3～5℃持續低溫2 h，完畢后立即腹腔注射地塞米松（0.5 mg/kg）。每組于冷損傷后24 h采集坐骨神經標本。同時每只大鼠暴露對側坐骨神經，不給予低溫處理，作為對照。
1.2.3 標本取材、處理
到達取材時間后，麻醉大鼠迅速取下雙側坐骨神經，按以下步驟操作：① 2%多聚甲醛-2.5%戊二醛中4℃固定2 h；② 0.1 mmol/L 磷酸鹽緩沖液（pH值7.4）浸泡3次，10 min/次；③ 四氧化鋨固定，乙醇脫水，環氧樹脂Epon812包埋；④ 制備1 μm半薄切片，用甲苯胺藍染色后光學顯微鏡下觀察；⑤ 制備5 nm超薄切片，醋酸鈾-枸椽酸鉛染色后用荷蘭Philips EM208s型透射電子顯微鏡觀察。
2 結果
2.1 大鼠坐骨神經光學顯微鏡下的形態比較
對照側坐骨神經僅少量有髓纖維出現空或暗軸索，伴隨正常的神經內膜毛細血管（圖 2a）。低溫組冷損傷后24 h，許多有髓纖維出現以巨大、空或萎縮、暗為形式的軸索退變。由于內皮細胞腫脹，神經內膜毛細血管管腔狹窄（圖 2b）。干預組經過地塞米松治療后，有髓纖維仍可見以巨大、空或萎縮、暗為形式的軸索退變，但神經內膜毛細血管管腔未見狹窄，血管內皮細胞無明顯腫脹（圖 2c）。
圖2
坐骨神經非凍結性冷損傷光學顯微鏡像（甲苯胺藍染色×400） 2a. 對照側坐骨神經 2b. 低溫組冷損傷后1 d，神經軸索出現以“暗、空”為主要表現的退變，并出現血管管腔狹窄和內皮細胞腫脹（黑箭） 2c. 干預組地塞米松干預后1 d，可見退變的軸索，但神經內膜血管內皮細胞未見明顯腫脹，管腔未見狹窄（黑箭） ? ?圖 3 坐骨神經非凍結性冷損傷電子顯微鏡像 3a. 對照側神經內膜血管內皮細胞大致正常（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色× 13 000） 3b. 對照側有髓纖維與無髓纖維基本正常（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×8 000） 3c. 低溫后1 d時低溫組神經內膜血管管腔狹窄（黑箭），內皮細胞增生（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×1 000） 3d. 低溫處理后1 d時低溫組神經軸膜下水腫、軸索受壓（黑箭），其中線粒體固縮（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×8 000） 3e. 地塞米松干預后，干預組神經內膜血管管腔正常，內皮細胞未見增生，正常紅細胞通過管腔（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×25 000） 3f. 地塞米松干預后，干預組神經有髓纖維髓鞘板層松散，軸索退變、受壓無髓纖維大致正常（醋酸鈾-枸椽酸鉛染色×6 300）
2.2 大鼠坐骨神經電子顯微鏡下的形態比較
對照側24 h時僅少量有髓纖維輕微板層松散，無髓纖維與神經內膜血管基本正常（圖 3a、3b）。低溫組24 h時，坐骨神經的有髓纖維已經出現嚴重病變（圖 3c、3d），表現為：髓鞘板層結構松散，乃至于結構完全消失；軸索輕則微絲溶解，重則結構消失，表現為“空軸索”；無髓纖維基本正常；神經內膜血管管腔狹窄，血管內皮細胞增生，但緊密連接未見破壞，血管內未見血小板激活與紅細胞淤滯。經過地塞米松干預后，干預組坐骨神經的有髓纖維病變未見緩解；無髓纖維正常；神經內膜血管管腔正常；血管內皮細胞未見增生，緊密連接未見破壞（圖 3e、3f）。
3 討論
在中樞神經系統內，血腦屏障使腦組織和血液隔絕，并對血液和腦組織之間的多種物質交換進行調控。當機體受到寒冷損傷時，由于氧化損傷導致的血腦屏障滲透性增加，血管內液滲出，引起繼發性腦水腫[7]。
在周圍神經系統內，神經組織的內環境也由相似的屏障進行維持，該屏障即稱為血-神經屏障。它由神經內膜微血管內皮細胞和神經束膜所組成。在大部分常見的周圍神經疾病中，如糖尿病周圍神經病、周圍神經壓榨傷，人們都發現了血-神經屏障的破壞[8, 9]。
Jia等[4]發現在非凍結性冷損傷時，坐骨神經微循環變化具有以下特點：① 低溫時坐骨神經內的小動脈、毛細血管前動脈、毛細血管和小靜脈血流逐漸減慢、中斷；低溫3 h微循環血流僅為正常值的25%；③ 復溫后，坐骨神經內大部分小動脈、小靜脈管徑輕微增加，出現微小的灌流；復溫5 d后微循環血流恢復到正常值的50%。提示坐骨神經非凍結性冷損傷中存在缺血-再灌注現象，必然會導致氧化損傷。而耿志偉等[10, 11]的研究也顯示在復溫階段，坐骨神經內氧自由基含量會顯著增多。氧自由基對周圍神經的損傷主要是破壞微血管內皮細胞，從而破壞血-神經屏障，導致神經內膜水腫[12]。神經內膜存在過多液體將會造成其內部壓力的迅速上升[13]，從而降低神經內膜血管直徑，引起血流阻力升高，加重神經內膜低氧。Olsson[14]曾指出這種類型的血-神經屏障損害也可能與神經內膜中的肥大細胞脫顆粒釋放的血管活性胺有關。血管活性胺可以破壞毛細血管的屏障作用，使其通透性增加。
糖皮質激素具有強大的抗炎和免疫抑制作用，常用來減輕水腫和損傷后的炎癥反應。它在治療神經損傷方面的主要機制是通過與磷脂的牢固結合，防止膜磷脂遭受自由基的攻擊和抑制損傷部位的脂質過氧化反應[15]。地塞米松屬于糖皮質激素類，具有抗炎、抗休克作用，能夠解除小動脈痙攣，改善微循環[16]。本研究發現給予地塞米松治療坐骨神經非凍結性冷損傷后，神經內膜毛細血管病變得到明顯改善，表明地塞米松具有保護血-神經屏障功能的作用。這種保護作用可能既與其抑制氧自由基的損傷作用有關，也與其能夠抑制肥大細胞脫顆粒存在一定關系。但值得關注的是，神經內膜的有髓纖維病變并未緩解，提示地塞米松對坐骨神經非凍結性冷損傷的治療作用可能僅限于血管系統。
目前周圍神經非凍結性冷損傷被看作一種“缺血疊加綜合征”，其損傷機制除缺血-再灌注損傷以外，還涉及了許多方面[6, 17]：如鈉離子通道的異常、主動轉運中溫度敏感性酶的失活、巨噬細胞對神經纖維的吞噬等，但具體途徑仍不清楚。地塞米松僅能夠對缺血-再灌注損傷途徑產生治療作用，而不能干預其他損傷途徑，因此尚不能完全緩解神經纖維的病變。因此，還應繼續開展對其損傷機制的深入研究。在臨床上對多個損傷途徑同時進行干預可能會取得更好的治療效果。
