引用本文： 宋大萍, 呂玉宇, 趙涌. 宮頸永生化細胞和癌細胞的亞細胞蛋白質組學初步研究. 華西醫學, 2014, 29(1): 51-53. doi: 10.7507/1002-0179.20140014 復制
差異蛋白質組學是應用雙向電泳將蛋白分離純化，然后結合質譜技術、生物信息學方法對蛋白質進行鑒定。細胞內的蛋白質種類繁多，性質多樣，常規蛋白質組學方法不能分離和檢測細胞中的全部蛋白質[1]。亞細胞蛋白質組學研究則著重在細胞特定成分的蛋白組，而非整個細胞蛋白質，這更有利于對腫瘤特異性蛋白的研究[2]。宮頸癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤，近年來宮頸癌發病率有明顯增高及年輕化的趨勢[3]，研究表明人類乳頭狀瘤病毒16、18推進了宮頸癌和宮頸上皮類瘤CIN病變的發生[4]。但二者之間的關鍵性差異蛋白質及癌變機制至今仍不清楚。本實驗旨在研究宮頸永生化細胞（H8細胞株）和癌細胞（Caski細胞株）亞細胞結構的差異蛋白，為癌變機制的探討以及特異性腫瘤靶向藥物治療研究提供依據。
1 材料與方法
1.1 材料
主要試劑：亞細胞結構蛋白質提取試劑盒（ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit）購于德國默克生物制劑公司；胰酶購于Promega；三羥甲基氨基乙烷、硝酸銀、四甲基乙二胺、碘乙酰胺、過硫酸銨等購自上海生工。雙向電泳儀、線性固相pH膠條等購于美國安瑪西亞公司。SWISS-PROT數據庫、Amersham ImageMaster VDS-CL型凝膠成像系統及ImageMaster 2D圖像分析軟件（瑞典Amersham Pharmacia公司）；MALDI-TOF質譜儀（美國ABI公司）。
H8細胞源于中國醫學科學院協和醫科大學基礎研究所，Caski細胞從重慶醫科大學分子生物教研室獲得。
1.2 方法
1.2.1 樣品制備
將H8細胞和Caski細胞培養后加入亞細胞結構蛋白質提取試劑，分別提取出細胞質蛋白質、細胞膜蛋白質和核蛋白質，進行蛋白質定量。
1.2.2 雙向凝膠電泳法（2-DE）分離和圖像分析
參照文獻[5]的方法和安瑪西亞電聚焦系統操作指南進行。膠條為18 cm，pH值3～10，分別通過笫一向等電聚焦電泳和第二向垂直電泳直至溴酚藍遷移至凝膠底邊停止電泳，進行銀染。然后掃描獲取圖像，運用軟件進行分析，找出差異表達的蛋白點。
1.2.3 質譜分析及蛋白質數據庫檢索
將篩選出的差異蛋白質斑點進行酶切、萃取、濃縮抽干后進行質譜分析。利用Mascot軟件搜索NCBI、Swiss-Port數據庫尋找匹配的相關蛋白質。
2 結果
2.1 雙向電泳圖譜
經雙向電泳及銀染后獲得H8和Caski細胞的亞細胞蛋白質雙向電泳圖譜（圖 1～6）。
圖1
H8細胞細胞質蛋白質圖 ? ?圖 2 Caski細胞細胞質蛋白質圖 ? ? 圖 3 H8細胞細胞膜蛋白質圖 ? ? 圖 4 Caski細胞細胞膜蛋白質圖 ? ? 圖 5 H8細胞細胞核蛋白質圖 ? ? 圖 6 Caski細胞細胞核蛋白質圖
2.2 差異蛋白質及其MALDT-TOF-MS-PMF分析
通過分析篩選差異較大的蛋白點進行肽質量指紋圖譜鑒定現初步鑒定出：6個細胞質差異蛋白質，分別為：鈣結合蛋白（S100P）、人核因子kB抑制物激酶β（IKKb）、細胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK6）、TAF2（transcription initiation factor TFIID subunit 2）、腫瘤壞死因子受體相關因子5（TRAF5）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（STK3），其中S100P、IKKb、CDK6、TAF2、TRAF5這5種蛋白質在Caski細胞的細胞質中高表達，STK3蛋白質在Caski細胞的細胞質中表達缺失。
3個細胞膜差異蛋白質，分別為：LRC8D、外胚葉發育不全蛋白受體（EDAR）、Metaxin-1，均在宮頸永生化細胞的細胞膜中表達上調。
9個細胞核差異蛋白質，分別為：TGFβ1誘導的抗凋亡因子（TIAF1）、睪丸激素受體相關蛋白（TRA16）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶4C抗體（PP4C）、CDK6、ANR16（ankyrin repeat domain-containing protein 16）、ZN211、1組蛋白乙酰化酶（MYST）、整合因子復合體亞基6（INT6）、核纖層蛋白 A/C（LMNA），其中TIAF1、TRA16、PP4C、CDK6、ANR16、ZN211這6種蛋白質在Caski細胞核中高表達，MYST1、INT6、LMNA這3種蛋白質在Caski細胞核中低表達。
3 討論
運用蛋白質組學方法對亞細胞結構組分進行研究是目前的研究熱點[6]，幾乎所有的亞細胞組分的蛋白質表達譜都有報道，但在宮頸癌和正常宮頸上皮研究近幾年僅有少量文獻報道。Trejo-Becerril等[7]使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法對正常宮頸細胞及宮頸癌細胞的膜蛋白進行檢測發現，29例正常的宮頸細胞中有一種高度表達的蛋白質；而48例腫瘤細胞中則有3種，預示患者有一個完全的臨床反應的蛋白質，并有一種高分子量蛋白表達下調或丟失。林英姿等[8]比較10例宮頸癌組織及癌旁正常組織的雙向凝膠電泳圖譜，初步鑒定了8個與腫瘤基因、細胞周期調控、信號轉導等有關的蛋白質。蔡思娜等[9]采用表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜儀和弱陽離子結合芯片（CM10）檢測24例宮頸鱗狀細胞癌及25例年齡相匹配的健康女性的血清蛋白質，經分析篩選出6個有分類意義的差異蛋白質。羅俊華等[10]以43例宮頸浸潤癌患者、32例宮頸良性病患者及71例健康女性作為訓練組，其血清與金屬親和吸附芯片（IMAC-Cu）結合檢測差異蛋白質，發現了3種蛋白質含量與宮頸癌密切相關，可能成為宮頸癌診斷的生物標志物。曾亮等[11]建立了早期宮頸癌組和中-晚期宮頸癌組的二維凝膠電泳圖譜，通過進行質譜分析和生物信息學查詢，鑒定了在中-晚期組下調的蛋白4個，中-晚期組上調的蛋白8個，通過蛋白質印跡法和免疫組織化學檢測顯示鈣結合蛋白A9（S100A9）在中-晚期組中的表達高于早期組，細胞角蛋白19（CK19）在早期組中的表達高于中-晚期組。但他們都是通過提取細胞總蛋白對宮頸癌進行研究，由于全細胞蛋白多且復雜，分析困難，更難以準確地從亞細胞結構上把握癌前和癌的相關蛋白。而本實驗從亞細胞結構上對宮頸癌前病變和宮頸癌細胞進行研究，尋找出差異蛋白質，從而定位更為準確，功能研究更具體。
本實驗用2-DE方法分析人類乳頭狀瘤病毒-16陽性的H8細胞（癌前病變模型）和Caski細胞（癌細胞）亞細胞成分蛋白（細胞質、細胞膜和細胞核蛋白）差異表達，得到了清晰易辨的電泳圖譜。然后再通過質譜分析，鑒定出6種細胞質差異蛋白質、3種細胞膜差異蛋白質和9種細胞核差異蛋白質，其中S100P、IKKb、CDK6、TAF2、TRAF5、TIAF1、TRA16、PP4C、CDK6、ANR16、ZN211蛋白質在Caski細胞中高表達可能與促進細胞增殖、分化，抑制細胞凋亡，加快細胞周期造成細胞周期調節失控和細胞異常增殖有關，從而導致腫瘤的發生。而STK3、EDAR、Metaixn-1、LRC8D可能與細胞凋亡密切相關，從而抑制腫瘤形成。MYST1、INT6、LMNA與減弱了細胞對各種致癌因子的防御能力有關。
綜上所述，宮頸癌前病變發展為宮頸癌是一個復雜過程，從宮頸癌的亞細胞蛋白組學研究可看出兩者之間蛋白不僅有量的差別，也有質的區別；宮頸鱗狀上皮永生化細胞和癌細胞亞細胞結構蛋白差異表達為闡明宮頸癌發生、腫瘤標記物尋找的機制提供了實驗依據；也為建立宮頸癌蛋白組數據庫提供豐富資源。
差異蛋白質組學是應用雙向電泳將蛋白分離純化，然后結合質譜技術、生物信息學方法對蛋白質進行鑒定。細胞內的蛋白質種類繁多，性質多樣，常規蛋白質組學方法不能分離和檢測細胞中的全部蛋白質[1]。亞細胞蛋白質組學研究則著重在細胞特定成分的蛋白組，而非整個細胞蛋白質，這更有利于對腫瘤特異性蛋白的研究[2]。宮頸癌是常見的女性生殖系統惡性腫瘤，近年來宮頸癌發病率有明顯增高及年輕化的趨勢[3]，研究表明人類乳頭狀瘤病毒16、18推進了宮頸癌和宮頸上皮類瘤CIN病變的發生[4]。但二者之間的關鍵性差異蛋白質及癌變機制至今仍不清楚。本實驗旨在研究宮頸永生化細胞（H8細胞株）和癌細胞（Caski細胞株）亞細胞結構的差異蛋白，為癌變機制的探討以及特異性腫瘤靶向藥物治療研究提供依據。
1 材料與方法
1.1 材料
主要試劑：亞細胞結構蛋白質提取試劑盒（ProteoExtract Subcellular Proteome Extraction Kit）購于德國默克生物制劑公司；胰酶購于Promega；三羥甲基氨基乙烷、硝酸銀、四甲基乙二胺、碘乙酰胺、過硫酸銨等購自上海生工。雙向電泳儀、線性固相pH膠條等購于美國安瑪西亞公司。SWISS-PROT數據庫、Amersham ImageMaster VDS-CL型凝膠成像系統及ImageMaster 2D圖像分析軟件（瑞典Amersham Pharmacia公司）；MALDI-TOF質譜儀（美國ABI公司）。
H8細胞源于中國醫學科學院協和醫科大學基礎研究所，Caski細胞從重慶醫科大學分子生物教研室獲得。
1.2 方法
1.2.1 樣品制備
將H8細胞和Caski細胞培養后加入亞細胞結構蛋白質提取試劑，分別提取出細胞質蛋白質、細胞膜蛋白質和核蛋白質，進行蛋白質定量。
1.2.2 雙向凝膠電泳法（2-DE）分離和圖像分析
參照文獻[5]的方法和安瑪西亞電聚焦系統操作指南進行。膠條為18 cm，pH值3～10，分別通過笫一向等電聚焦電泳和第二向垂直電泳直至溴酚藍遷移至凝膠底邊停止電泳，進行銀染。然后掃描獲取圖像，運用軟件進行分析，找出差異表達的蛋白點。
1.2.3 質譜分析及蛋白質數據庫檢索
將篩選出的差異蛋白質斑點進行酶切、萃取、濃縮抽干后進行質譜分析。利用Mascot軟件搜索NCBI、Swiss-Port數據庫尋找匹配的相關蛋白質。
2 結果
2.1 雙向電泳圖譜
經雙向電泳及銀染后獲得H8和Caski細胞的亞細胞蛋白質雙向電泳圖譜（圖 1～6）。
圖1
H8細胞細胞質蛋白質圖 ? ?圖 2 Caski細胞細胞質蛋白質圖 ? ? 圖 3 H8細胞細胞膜蛋白質圖 ? ? 圖 4 Caski細胞細胞膜蛋白質圖 ? ? 圖 5 H8細胞細胞核蛋白質圖 ? ? 圖 6 Caski細胞細胞核蛋白質圖
2.2 差異蛋白質及其MALDT-TOF-MS-PMF分析
通過分析篩選差異較大的蛋白點進行肽質量指紋圖譜鑒定現初步鑒定出：6個細胞質差異蛋白質，分別為：鈣結合蛋白（S100P）、人核因子kB抑制物激酶β（IKKb）、細胞周期素依賴性蛋白激酶（CDK6）、TAF2（transcription initiation factor TFIID subunit 2）、腫瘤壞死因子受體相關因子5（TRAF5）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶3（STK3），其中S100P、IKKb、CDK6、TAF2、TRAF5這5種蛋白質在Caski細胞的細胞質中高表達，STK3蛋白質在Caski細胞的細胞質中表達缺失。
3個細胞膜差異蛋白質，分別為：LRC8D、外胚葉發育不全蛋白受體（EDAR）、Metaxin-1，均在宮頸永生化細胞的細胞膜中表達上調。
9個細胞核差異蛋白質，分別為：TGFβ1誘導的抗凋亡因子（TIAF1）、睪丸激素受體相關蛋白（TRA16）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶4C抗體（PP4C）、CDK6、ANR16（ankyrin repeat domain-containing protein 16）、ZN211、1組蛋白乙酰化酶（MYST）、整合因子復合體亞基6（INT6）、核纖層蛋白 A/C（LMNA），其中TIAF1、TRA16、PP4C、CDK6、ANR16、ZN211這6種蛋白質在Caski細胞核中高表達，MYST1、INT6、LMNA這3種蛋白質在Caski細胞核中低表達。
3 討論
運用蛋白質組學方法對亞細胞結構組分進行研究是目前的研究熱點[6]，幾乎所有的亞細胞組分的蛋白質表達譜都有報道，但在宮頸癌和正常宮頸上皮研究近幾年僅有少量文獻報道。Trejo-Becerril等[7]使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）方法對正常宮頸細胞及宮頸癌細胞的膜蛋白進行檢測發現，29例正常的宮頸細胞中有一種高度表達的蛋白質；而48例腫瘤細胞中則有3種，預示患者有一個完全的臨床反應的蛋白質，并有一種高分子量蛋白表達下調或丟失。林英姿等[8]比較10例宮頸癌組織及癌旁正常組織的雙向凝膠電泳圖譜，初步鑒定了8個與腫瘤基因、細胞周期調控、信號轉導等有關的蛋白質。蔡思娜等[9]采用表面增強激光解吸離子化飛行時間質譜儀和弱陽離子結合芯片（CM10）檢測24例宮頸鱗狀細胞癌及25例年齡相匹配的健康女性的血清蛋白質，經分析篩選出6個有分類意義的差異蛋白質。羅俊華等[10]以43例宮頸浸潤癌患者、32例宮頸良性病患者及71例健康女性作為訓練組，其血清與金屬親和吸附芯片（IMAC-Cu）結合檢測差異蛋白質，發現了3種蛋白質含量與宮頸癌密切相關，可能成為宮頸癌診斷的生物標志物。曾亮等[11]建立了早期宮頸癌組和中-晚期宮頸癌組的二維凝膠電泳圖譜，通過進行質譜分析和生物信息學查詢，鑒定了在中-晚期組下調的蛋白4個，中-晚期組上調的蛋白8個，通過蛋白質印跡法和免疫組織化學檢測顯示鈣結合蛋白A9（S100A9）在中-晚期組中的表達高于早期組，細胞角蛋白19（CK19）在早期組中的表達高于中-晚期組。但他們都是通過提取細胞總蛋白對宮頸癌進行研究，由于全細胞蛋白多且復雜，分析困難，更難以準確地從亞細胞結構上把握癌前和癌的相關蛋白。而本實驗從亞細胞結構上對宮頸癌前病變和宮頸癌細胞進行研究，尋找出差異蛋白質，從而定位更為準確，功能研究更具體。
本實驗用2-DE方法分析人類乳頭狀瘤病毒-16陽性的H8細胞（癌前病變模型）和Caski細胞（癌細胞）亞細胞成分蛋白（細胞質、細胞膜和細胞核蛋白）差異表達，得到了清晰易辨的電泳圖譜。然后再通過質譜分析，鑒定出6種細胞質差異蛋白質、3種細胞膜差異蛋白質和9種細胞核差異蛋白質，其中S100P、IKKb、CDK6、TAF2、TRAF5、TIAF1、TRA16、PP4C、CDK6、ANR16、ZN211蛋白質在Caski細胞中高表達可能與促進細胞增殖、分化，抑制細胞凋亡，加快細胞周期造成細胞周期調節失控和細胞異常增殖有關，從而導致腫瘤的發生。而STK3、EDAR、Metaixn-1、LRC8D可能與細胞凋亡密切相關，從而抑制腫瘤形成。MYST1、INT6、LMNA與減弱了細胞對各種致癌因子的防御能力有關。
綜上所述，宮頸癌前病變發展為宮頸癌是一個復雜過程，從宮頸癌的亞細胞蛋白組學研究可看出兩者之間蛋白不僅有量的差別，也有質的區別；宮頸鱗狀上皮永生化細胞和癌細胞亞細胞結構蛋白差異表達為闡明宮頸癌發生、腫瘤標記物尋找的機制提供了實驗依據；也為建立宮頸癌蛋白組數據庫提供豐富資源。
