引用本文： 馮寧, 高海德, 劉文志, 陳希, 伍曉汀. 胃癌中鈣黏附分子啟動子甲基化與幽門螺桿菌感染及腫瘤生物學特性的關系. 華西醫學, 2014, 29(1): 43-46. doi: 10.7507/1002-0179.20140012 復制
近年腫瘤分子生物學領域的研究表明，原癌基因和（或）抑癌基因遺傳學和表觀遺傳學的異常共同參與了癌癥的發生[1, 2]。而DNA的甲基化是表觀遺傳學改變的一種最主要的形式。有文獻報道，抑癌基因啟動子的甲基化似乎是導致其失活的主要機制，而這一變化則可能是導致腫瘤發生的直接分子因素[1]。鈣黏附分子（CDH1）基因位于染色體16q22.1，編碼一種表達于上皮細胞內的嗜同種跨膜細胞黏附蛋白表皮鈣黏附分子（E-cadherin）。此種蛋白在建立并維持細胞間連接、細胞極性及組織構架方面起重要作用。CDH1基因被認為在人類腫瘤中是關鍵的腫瘤浸潤抑制基因。E-cadherin蛋白的失活或下調被發現與腫瘤的侵犯和轉移潛能有關。近年研究發現，CDH1基因啟動子的甲基化是在胃癌中導致這一抑癌基因沉默的最普遍機制[1, 2]。本研究旨在建立甲基化特異性聚合酶鏈式反應（MS-PCR）法檢測胃癌手術標本中的CDH1基因啟動子的甲基化情況，分析胃癌人群中CDH1基因啟動子的甲基化水平，并探討CDH1基因在胃癌組織與對照組織中可能的甲基化程度的差異及胃癌中CDH1基因啟動子的甲基化程度與腫瘤生物學特性之間的關系。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取大連大學附屬中山醫院2008年1月－2009年12月不同年齡、性別、病理類型、TNM分期的40例胃癌的腫瘤組織，以40例手術切緣正常黏膜組織作為對照組。設計患者資料采集卡，收集內容包括：住院號、病理號、性別、年齡、組織分型、腫瘤部位、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、幽門螺桿菌感染等情況。
1.2 主要試劑
血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技北京有限公司，甲基化檢測試劑盒（EZ DNA Methylation-Gold Kit）購自美國ZYMO公司，分子標記（фX174-Hae Ⅲ digest DNA Marker）、合成引物及聚合酶鏈式反應試劑盒（PerfectShotTM Ex Taq）均購自寶生物工程（大連）有限公司。
1.3 引物設計
根據查閱文獻所得引物序列，通過比對基因庫中CDH1基因啟動子序列配對無誤，兩對引物序列及各自擴增片段長度如下：
甲基化DNA：正向引物：5’GGTGAATTTTTAGT TAATTAGCGGTAC3’，反向引物：5’CATAACTAA CCGAAAACGCCG3’，擴增所得204 bp產物；非甲基化DNA：正向引物：5’GGTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAGTGGTA3，反向引物：’5’ACCCATAACTAA CCAAAAACACCA3’，擴增所得211 bp產物。
1.4 實驗方法
按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明書對組織的基因組DNA進行提取。按照甲基化檢測試劑盒的說明對所得DNA甲基化基因進行轉化處理。然后按照PCR反應試劑盒的說明書對目的基因片段進行擴增，每一例標本均分別進行甲基化和非甲基化片段擴增，以正常胃黏膜組織經甲基化基因的轉化處理所得DNA作為對照，同時擴增β-actin基因為內參照。取擴增產物10 μL點樣于2%的瓊脂糖凝膠100 V下電泳20 min至條帶跑開。紫外凝膠成像系統下觀察目的條帶，甲基化擴增結果出現204 bp條帶為甲基化陽性條帶，非甲基化擴增結果出現211 bp條帶為甲基化陰性條帶。結果判定標準為：① 甲基化陽性：甲基化特異性引物擴增出相應長度的片段，但非甲基化特異性引物未擴增出相應長度的片段，則判斷該基因啟動子區5’CpG島甲基化陽性；② 甲基化陰性：非甲基化特異性引物擴增出相應長度的片段，但甲基化特異性引物未擴增出相應長度的片段，則判斷該基因啟動子區5’CpG島甲基化陰性。
1.5 統計學方法
統計各例胃癌標本及對照組的甲基化數據建立數據庫。采用SPSS 19.0軟件進行分析，定性資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 MS-PCR法檢測胃癌細胞中CDH1基因甲基化程度
胃癌組CDH1基因甲基化陽性27例，陽性率67.5%；對照組陽性5例，陽性率12.5%，兩組差異有統計學意義（χ2=25.208，P=0.000）。
2.2 胃癌組織CDH1基因甲基化程度與腫瘤生物學特性的關系
胃癌組CDH1基因甲基化陽性率與性別、腫瘤浸潤程度、淋巴轉移、遠處轉移無關，與腫瘤分化程度、幽門螺桿菌感染有關，見表 1。
表1
胃癌組織CDH1基因甲基化程度與腫瘤生物學特性的關系[n=40，例（%）]
3 討論
編碼E-cadherin蛋白的CDH1基因是一種抑癌基因，位于染色體16q22.1上，包含2.6 kb的編碼序列和16個外顯子。成熟的E-cadherin蛋白屬于細胞間黏附分子家族，是一種位于細胞表面連接處的同型二聚體，它在保持細胞分化和維持正常上皮組織結構方面起重要作用。在胃癌中存在兩種重要的E-cadherin蛋白的下調機制：種系或散發的基因突變以及啟動子區域5’CpG島的甲基化，后者可能引起CDH1基因轉錄的中止。在胚胎發生中，CpG島的甲基化存在于處于細胞分化生長過程中的正常組織中。而在幾種腫瘤中已經發現引起異常甲基化的甲基轉移酶的活性異常，這種現象可以導致異常的CpG島的甲基化及人類抑制基因的轉錄沉默。在胃癌中，CDH1啟動子區域的異常甲基化可能是在E-cadherin失活中最常見的“二次打擊“抑制機制。而幽門螺桿菌感染可能與這種基因沉默機制起協同作用[1-7]。
本研究發現在我國胃癌人群中也存在著與國外的報道類似的CDH1啟動子甲基化現象，并發現此現象與胃癌進展密切相關（P＜0.05）。另外，本研究還發現CDH1啟動子甲基化現象與腫瘤的較低分化程度及幽門螺桿菌感染存在密切關聯（P＜0.05）。但在對CDH1啟動子甲基化與腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移及遠處轉移之間關系的研究中雖未得出明確的統計學關聯，但可看到CDH1啟動子甲基化有趨勢更多地發生在有淋巴轉移的患者中，其結果未獲得統計學意義的原因可能由于研究的樣本數尚不充足，統計效能不足。這亦提示我們在以后的研究中進一步增加納入研究的樣本例數，使結果更具代表性。在對CDH1啟動子甲基化與腫瘤遠處轉移的關聯的研究中亦存在上述問題，由于臨床上對許多術前即明確發生遠處轉移的胃癌患者采取放射、化學療法等保守治療方法，僅少數患者采取手術治療或是術中探查獲知的遠處轉移，故疾病治療模式的限制決定了納入研究的遠處轉移的胃癌患者十分有限，最終影響了統計學的真實性。關于本研究的相關結果在國外亦有部分研究報告給予了支持[1, 2, 4, 5]，但關于CDH1啟動子甲基化的分子機制及其對腫瘤生物學特性產生影響的機制的研究結論尚存不同程度的差異。
CDH1啟動子甲基化導致的E-cadherin基因轉錄沉默可能在胃癌發展中扮演著重要的角色。Grabiano等[8]對胃癌標本檢測中預計有40%和80%的基因甲基化概率。而本研究中所獲得的CDH1啟動子甲基化率與其他多項研究所得的結果近似[8-10]。Monika等[2]的研究中尚未發現CDH1啟動子甲基化與彌漫型胃癌或腸型胃癌的分型具有統計學意義。而有些研究發現CDH1啟動子甲基化與彌漫型胃癌有顯著關聯[8, 9, 11]，而在其他研究者的實驗中未獲得此種結論[10]。Monika等[2]的研究還得出胃癌中CDH1啟動子甲基化與日本Goseki分型有顯著關聯。而Goseki分型是基于綜合兩種形態學特征而作出的，即腫瘤腺管的分化程度和細胞質內黏液的量。Goseki分型將胃癌分為4型：Ⅰ型：腺管分化好，細胞質內黏液少；Ⅱ型：腺管分化好，細胞質內黏液多；Ⅲ型：腺管分化差，細胞質內黏液少；Ⅳ型：腺管分化差，細胞質內黏液多[12]。有研究提示CDH1啟動子甲基化更多地出現在GosekiⅢ型中（83%），包括含有少量細胞內黏液的低分化腫瘤[9]。而在GosekiⅡ型和Ⅳ型中觀察到的CDH1啟動子甲基化低發生率的現象可以用細胞質內黏液的保護作用來解釋。同樣，CDH1啟動子甲基化更多地出現在GosekiⅢ型中的現象提示其可能因為黏液少而缺乏相關保護造成的。在Maekita等[13]的研究中發現CDH1啟動子甲基化更多地出現在原發性胃癌中，尤其是未分化彌漫型胃癌中，而這種現象可能與E-cadherin表達降低有關。他們的發現印證了之前有關在未分化型胃癌中進行的E-cadherin免疫組織化學檢測的結果，之前的發現是E-cadherin表達降低發生在54%～100%的未分化型胃癌中[14]。日本的Oka等[15]對日本胃癌患者的研究中也發現了在85%的未分化型胃癌中有E-cadherin表達降低，而在分化型胃癌中僅有30%的患者存在此種現象。而上述發現與本研究中所得出的結果基本相符，說明在中國胃癌人群中亦存在E-cadherin表達降低的現象，并且其可能與腫瘤的分化和進展有關聯。
在未分化彌漫型胃癌中以經典的“二次打擊”學說來解釋CDH1失活已經被廣為接受，這種現象出現在此種胃癌的近半數患者中。CDH1基因的甲基化及E-cadherin表達降低的高發生率與此種組織變異類型的高發生率之間存在密切關聯，這強烈提示了E-cadherin表達的失活可能在未分化/彌漫型胃癌的發生和發展中起到關鍵性的作用[16-18]。Graff等[19]在對CDH1啟動子甲基化機制的體外實驗研究中發現，在時間依賴性的CDH1基因CpG島甲基化起始于高密度CpG島的側翼部分，并沿細胞通道最終延伸到CpG島的核心區域。而上述模式可能是由于特異性β1糖蛋白的保護作用使然。近年來出現了在胃癌中人類錯配修復基因（hMLH1）啟動子甲基化的相關報道[19]。這些現象是在進展期胃癌中發現的，尚未在原位癌及不典型增生組織中發現，提示甲基化可能出現腫瘤發育的較晚的時候。另外，還有研究提示這種甲基化早期是以部分甲基化或單等位基因的形式出現的，只是在后期才發展成雙等位基因[19, 20]。
綜上所述，本研究采用免疫組織化學方法研究了胃癌的CDH1基因甲基化程度，并回顧性分析了上述改變與腫瘤分化、浸潤、淋巴轉移及遠處轉移之間的統計學關聯，發現CDH1基因甲基化可能參與了胃癌的發展過程，并且CDH1基因甲基化可能導致了腫瘤分化程度的降低。雖然在實驗中發現CDH1基因甲基化更多地出現在有淋巴轉移的患者中，但兩者之間差異無統計學意義，提示后續的研究可能需要增加相關胃癌手術標本的例數以求獲得滿意的統計學效能。同時我們還發現CDH1基因甲基化與胃癌患者的幽門螺桿菌感染之間可能存在密切關系，提示幽門螺桿菌感染可能參與了抑癌基因甲基化失活及腫瘤演變的發展過程，而其中涉及的確切細胞信號轉導通路等機制需要后續的相關研究進一步揭示。
近年腫瘤分子生物學領域的研究表明，原癌基因和（或）抑癌基因遺傳學和表觀遺傳學的異常共同參與了癌癥的發生[1, 2]。而DNA的甲基化是表觀遺傳學改變的一種最主要的形式。有文獻報道，抑癌基因啟動子的甲基化似乎是導致其失活的主要機制，而這一變化則可能是導致腫瘤發生的直接分子因素[1]。鈣黏附分子（CDH1）基因位于染色體16q22.1，編碼一種表達于上皮細胞內的嗜同種跨膜細胞黏附蛋白表皮鈣黏附分子（E-cadherin）。此種蛋白在建立并維持細胞間連接、細胞極性及組織構架方面起重要作用。CDH1基因被認為在人類腫瘤中是關鍵的腫瘤浸潤抑制基因。E-cadherin蛋白的失活或下調被發現與腫瘤的侵犯和轉移潛能有關。近年研究發現，CDH1基因啟動子的甲基化是在胃癌中導致這一抑癌基因沉默的最普遍機制[1, 2]。本研究旨在建立甲基化特異性聚合酶鏈式反應（MS-PCR）法檢測胃癌手術標本中的CDH1基因啟動子的甲基化情況，分析胃癌人群中CDH1基因啟動子的甲基化水平，并探討CDH1基因在胃癌組織與對照組織中可能的甲基化程度的差異及胃癌中CDH1基因啟動子的甲基化程度與腫瘤生物學特性之間的關系。
1 資料與方法
1.1 一般資料
選取大連大學附屬中山醫院2008年1月－2009年12月不同年齡、性別、病理類型、TNM分期的40例胃癌的腫瘤組織，以40例手術切緣正常黏膜組織作為對照組。設計患者資料采集卡，收集內容包括：住院號、病理號、性別、年齡、組織分型、腫瘤部位、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、幽門螺桿菌感染等情況。
1.2 主要試劑
血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技北京有限公司，甲基化檢測試劑盒（EZ DNA Methylation-Gold Kit）購自美國ZYMO公司，分子標記（фX174-Hae Ⅲ digest DNA Marker）、合成引物及聚合酶鏈式反應試劑盒（PerfectShotTM Ex Taq）均購自寶生物工程（大連）有限公司。
1.3 引物設計
根據查閱文獻所得引物序列，通過比對基因庫中CDH1基因啟動子序列配對無誤，兩對引物序列及各自擴增片段長度如下：
甲基化DNA：正向引物：5’GGTGAATTTTTAGT TAATTAGCGGTAC3’，反向引物：5’CATAACTAA CCGAAAACGCCG3’，擴增所得204 bp產物；非甲基化DNA：正向引物：5’GGTAGGTGAATTTTTAGTTAATTAGTGGTA3，反向引物：’5’ACCCATAACTAA CCAAAAACACCA3’，擴增所得211 bp產物。
1.4 實驗方法
按照血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒的說明書對組織的基因組DNA進行提取。按照甲基化檢測試劑盒的說明對所得DNA甲基化基因進行轉化處理。然后按照PCR反應試劑盒的說明書對目的基因片段進行擴增，每一例標本均分別進行甲基化和非甲基化片段擴增，以正常胃黏膜組織經甲基化基因的轉化處理所得DNA作為對照，同時擴增β-actin基因為內參照。取擴增產物10 μL點樣于2%的瓊脂糖凝膠100 V下電泳20 min至條帶跑開。紫外凝膠成像系統下觀察目的條帶，甲基化擴增結果出現204 bp條帶為甲基化陽性條帶，非甲基化擴增結果出現211 bp條帶為甲基化陰性條帶。結果判定標準為：① 甲基化陽性：甲基化特異性引物擴增出相應長度的片段，但非甲基化特異性引物未擴增出相應長度的片段，則判斷該基因啟動子區5’CpG島甲基化陽性；② 甲基化陰性：非甲基化特異性引物擴增出相應長度的片段，但甲基化特異性引物未擴增出相應長度的片段，則判斷該基因啟動子區5’CpG島甲基化陰性。
1.5 統計學方法
統計各例胃癌標本及對照組的甲基化數據建立數據庫。采用SPSS 19.0軟件進行分析，定性資料以率或構成比表示，組間比較采用χ2檢驗，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 MS-PCR法檢測胃癌細胞中CDH1基因甲基化程度
胃癌組CDH1基因甲基化陽性27例，陽性率67.5%；對照組陽性5例，陽性率12.5%，兩組差異有統計學意義（χ2=25.208，P=0.000）。
2.2 胃癌組織CDH1基因甲基化程度與腫瘤生物學特性的關系
胃癌組CDH1基因甲基化陽性率與性別、腫瘤浸潤程度、淋巴轉移、遠處轉移無關，與腫瘤分化程度、幽門螺桿菌感染有關，見表 1。
表1
胃癌組織CDH1基因甲基化程度與腫瘤生物學特性的關系[n=40，例（%）]
3 討論
編碼E-cadherin蛋白的CDH1基因是一種抑癌基因，位于染色體16q22.1上，包含2.6 kb的編碼序列和16個外顯子。成熟的E-cadherin蛋白屬于細胞間黏附分子家族，是一種位于細胞表面連接處的同型二聚體，它在保持細胞分化和維持正常上皮組織結構方面起重要作用。在胃癌中存在兩種重要的E-cadherin蛋白的下調機制：種系或散發的基因突變以及啟動子區域5’CpG島的甲基化，后者可能引起CDH1基因轉錄的中止。在胚胎發生中，CpG島的甲基化存在于處于細胞分化生長過程中的正常組織中。而在幾種腫瘤中已經發現引起異常甲基化的甲基轉移酶的活性異常，這種現象可以導致異常的CpG島的甲基化及人類抑制基因的轉錄沉默。在胃癌中，CDH1啟動子區域的異常甲基化可能是在E-cadherin失活中最常見的“二次打擊“抑制機制。而幽門螺桿菌感染可能與這種基因沉默機制起協同作用[1-7]。
本研究發現在我國胃癌人群中也存在著與國外的報道類似的CDH1啟動子甲基化現象，并發現此現象與胃癌進展密切相關（P＜0.05）。另外，本研究還發現CDH1啟動子甲基化現象與腫瘤的較低分化程度及幽門螺桿菌感染存在密切關聯（P＜0.05）。但在對CDH1啟動子甲基化與腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移及遠處轉移之間關系的研究中雖未得出明確的統計學關聯，但可看到CDH1啟動子甲基化有趨勢更多地發生在有淋巴轉移的患者中，其結果未獲得統計學意義的原因可能由于研究的樣本數尚不充足，統計效能不足。這亦提示我們在以后的研究中進一步增加納入研究的樣本例數，使結果更具代表性。在對CDH1啟動子甲基化與腫瘤遠處轉移的關聯的研究中亦存在上述問題，由于臨床上對許多術前即明確發生遠處轉移的胃癌患者采取放射、化學療法等保守治療方法，僅少數患者采取手術治療或是術中探查獲知的遠處轉移，故疾病治療模式的限制決定了納入研究的遠處轉移的胃癌患者十分有限，最終影響了統計學的真實性。關于本研究的相關結果在國外亦有部分研究報告給予了支持[1, 2, 4, 5]，但關于CDH1啟動子甲基化的分子機制及其對腫瘤生物學特性產生影響的機制的研究結論尚存不同程度的差異。
CDH1啟動子甲基化導致的E-cadherin基因轉錄沉默可能在胃癌發展中扮演著重要的角色。Grabiano等[8]對胃癌標本檢測中預計有40%和80%的基因甲基化概率。而本研究中所獲得的CDH1啟動子甲基化率與其他多項研究所得的結果近似[8-10]。Monika等[2]的研究中尚未發現CDH1啟動子甲基化與彌漫型胃癌或腸型胃癌的分型具有統計學意義。而有些研究發現CDH1啟動子甲基化與彌漫型胃癌有顯著關聯[8, 9, 11]，而在其他研究者的實驗中未獲得此種結論[10]。Monika等[2]的研究還得出胃癌中CDH1啟動子甲基化與日本Goseki分型有顯著關聯。而Goseki分型是基于綜合兩種形態學特征而作出的，即腫瘤腺管的分化程度和細胞質內黏液的量。Goseki分型將胃癌分為4型：Ⅰ型：腺管分化好，細胞質內黏液少；Ⅱ型：腺管分化好，細胞質內黏液多；Ⅲ型：腺管分化差，細胞質內黏液少；Ⅳ型：腺管分化差，細胞質內黏液多[12]。有研究提示CDH1啟動子甲基化更多地出現在GosekiⅢ型中（83%），包括含有少量細胞內黏液的低分化腫瘤[9]。而在GosekiⅡ型和Ⅳ型中觀察到的CDH1啟動子甲基化低發生率的現象可以用細胞質內黏液的保護作用來解釋。同樣，CDH1啟動子甲基化更多地出現在GosekiⅢ型中的現象提示其可能因為黏液少而缺乏相關保護造成的。在Maekita等[13]的研究中發現CDH1啟動子甲基化更多地出現在原發性胃癌中，尤其是未分化彌漫型胃癌中，而這種現象可能與E-cadherin表達降低有關。他們的發現印證了之前有關在未分化型胃癌中進行的E-cadherin免疫組織化學檢測的結果，之前的發現是E-cadherin表達降低發生在54%～100%的未分化型胃癌中[14]。日本的Oka等[15]對日本胃癌患者的研究中也發現了在85%的未分化型胃癌中有E-cadherin表達降低，而在分化型胃癌中僅有30%的患者存在此種現象。而上述發現與本研究中所得出的結果基本相符，說明在中國胃癌人群中亦存在E-cadherin表達降低的現象，并且其可能與腫瘤的分化和進展有關聯。
在未分化彌漫型胃癌中以經典的“二次打擊”學說來解釋CDH1失活已經被廣為接受，這種現象出現在此種胃癌的近半數患者中。CDH1基因的甲基化及E-cadherin表達降低的高發生率與此種組織變異類型的高發生率之間存在密切關聯，這強烈提示了E-cadherin表達的失活可能在未分化/彌漫型胃癌的發生和發展中起到關鍵性的作用[16-18]。Graff等[19]在對CDH1啟動子甲基化機制的體外實驗研究中發現，在時間依賴性的CDH1基因CpG島甲基化起始于高密度CpG島的側翼部分，并沿細胞通道最終延伸到CpG島的核心區域。而上述模式可能是由于特異性β1糖蛋白的保護作用使然。近年來出現了在胃癌中人類錯配修復基因（hMLH1）啟動子甲基化的相關報道[19]。這些現象是在進展期胃癌中發現的，尚未在原位癌及不典型增生組織中發現，提示甲基化可能出現腫瘤發育的較晚的時候。另外，還有研究提示這種甲基化早期是以部分甲基化或單等位基因的形式出現的，只是在后期才發展成雙等位基因[19, 20]。
綜上所述，本研究采用免疫組織化學方法研究了胃癌的CDH1基因甲基化程度，并回顧性分析了上述改變與腫瘤分化、浸潤、淋巴轉移及遠處轉移之間的統計學關聯，發現CDH1基因甲基化可能參與了胃癌的發展過程，并且CDH1基因甲基化可能導致了腫瘤分化程度的降低。雖然在實驗中發現CDH1基因甲基化更多地出現在有淋巴轉移的患者中，但兩者之間差異無統計學意義，提示后續的研究可能需要增加相關胃癌手術標本的例數以求獲得滿意的統計學效能。同時我們還發現CDH1基因甲基化與胃癌患者的幽門螺桿菌感染之間可能存在密切關系，提示幽門螺桿菌感染可能參與了抑癌基因甲基化失活及腫瘤演變的發展過程，而其中涉及的確切細胞信號轉導通路等機制需要后續的相關研究進一步揭示。
