引用本文： 周世廣, 楊建華, 王英琨, 馮靈香. 大腸癌組織中尿激酶型纖溶酶原激活劑和糖原合成酶激酶-3β磷酸化的表達及意義. 華西醫學, 2014, 29(1): 39-42. doi: 10.7507/1002-0179.20140011 復制
大腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著國人生活水平提高和生活習慣改變，其發病率逐年增高，且有發病年輕化的趨勢。惡性腫瘤的發生與侵襲、轉移是一個復雜的過程，其中尿激酶型纖溶酶原激活系統在使細胞外基質降解過程以及惡性腫瘤細胞的侵襲轉移中起著主要作用。本研究擬用微波EliVisionTM免疫組織化學法檢測正常大腸黏膜、大腸癌和大腸腺瘤組織中尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）和糖原合成酶激酶-3β磷酸化（P-GSK3β）的表達情況，分析這兩種蛋白表達與大腸癌生物學行為的關系，并探討它們在大腸癌中發生、發展中的作用，為臨床治療提供科學依據。
1 資料與方法
1.1 一般資料
所有病理標本均選取2006年1月－2010年12月在河北省邯鄲市中心醫院行大腸癌手術標本，共計78例，所有患者術前均未行化學治療或放射治療等相關治療。78例患者中，男53例，女25例；年齡39～79歲，平均59.3歲；有淋巴結轉移43例，無淋巴轉移35例。按WHO消化系統腫瘤分類標準（2000年）進行組織學分級：高分化24例，中分化24例，低分化30例。所有病例根據國際抗癌聯盟2003年修訂的TNM分期標準進行臨床病理分期。同時，另取同期手術切除和結腸鏡活檢并經病理確診的大腸腺瘤30例，另取距腫瘤5 cm以上正常大腸黏膜組織20例作為正常對照組。
1.2 試劑與方法
鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（SP）試劑盒、二硝基聯苯胺（DAB）顯色液及uPA和P-GSK3β（北京中杉金橋生物技術有限公司）。采用SP法，免疫組織化學染色按SP試劑盒說明操作，以3%過氧化氫室溫孵育10 min除去內源性過氧化物酶的活性，抗原熱修復，加入一抗、二抗和辣根過氧化物酶，DAB顯色，蘇木素襯染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。其陽性對照組選取已知uPA和P-GSK3β陽性表達的乳腺癌切片，陰性對照是以磷酸鹽緩沖液緩沖液代替一抗。
1.3 結果判斷
uPA和P-GSK3β的陽性表達均主要定位于細胞質，以uPA和P-GSK3β在細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達。定性觀察按細胞有無顯色及染色強度進行計分：細胞質內無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按顯色細胞的比例記分：每200倍視野下，計數1 000個細胞，顯色細胞＜10%為0分，10%～30%顯色為1分，31%～60%顯色為2分，≥61%以上顯色為3分。以上每例兩個積分相乘，積分0分為陰性，積分≥1分為陽性。為減少人為因素造成的判斷誤差，由2名高年資病理醫師逐一觀察同一切片，以兩人觀察結果一致作為最終的評定結果。
1.4 統計學方法
應用SPSS 16.0統計軟件，組間陽性表達率的比較采用χ2檢驗，uPA和P-GSK3β在大腸癌組織陽性表達的相關性分析采用Spearman相關分析，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 uPA、P-GSK3β在正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌組織中的表達
uPA、P-GSK3β的染色結果以細胞質內出現棕色顆粒或染成棕黃色為陽性信號（圖 1、2）。大腸癌uPA、P-GSK3β陽性表達率顯著高于正常大腸黏膜、大腸腺瘤（P＜0.05），正常大腸黏膜、大腸腺瘤的uPA、P-GSK3β陽性表達率差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。
圖1
光學顯微鏡下uPA在大腸癌組織切片中的免疫組織化學染色情況（SP×200） ? ?圖 2 光學顯微鏡下P-GSK 3β在大腸癌組織切片中的免疫組織化學染色情況（SP×200）
表1
正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌組織中uPA、P-GSK3β的表達
2.2 uPA、P-GSK3β在大腸癌組織中的表達與臨床病理指標的關系
在大腸癌組織中，uPA、P-GSK3β的陽性表達與患者的性別、年齡、部位和大小無明顯相關性（P＞0.05），而與組織學分級、病理分期以及淋巴結轉移有關（P＜0.05），見表 2。
表2
uPA和P-GSK3β蛋白在大腸癌中的表達與臨床病理指標的關系
2.3 uPA、P-GSK3β在大腸癌組織中的相關性分析
大腸癌組織中uPA和P-GSK3β的陽性表達進行相關性分析發現，二者在大腸癌組織中的陽性表達呈正相關（r=0.381，P=0.001），見表 3。
表3
uPA和P-GSK3β蛋白在大腸癌組織中的相關性
3 討論
浸潤和轉移是惡性腫瘤最重要的生物學特征，癌基因激活、抑癌基因失活或突變以及腫瘤血管生成等因素和步驟參與了惡性腫瘤的浸潤轉移。其中，腫瘤細胞分泌的蛋白水解酶對細胞外基質和基底膜水解作用是腫瘤細胞浸潤生長和轉移的分子基礎和先決條件[1]。uPA是一種絲氨酸蛋白酶，它介導的纖維蛋白溶解系統與惡性腫瘤浸潤轉移密切相關[2]。uPA與表面受體結合后活性增加，可使無活性的纖維蛋白酶原變成有活性的纖維蛋白酶，與纖維蛋白酶通過直接和間接作用降解細胞外基質，促進腫瘤細胞侵襲、轉移[3]。研究發現，多種惡性腫瘤中如胃癌、乳腺癌、肺癌等中均有uPA的過表達[4-6]。本研究可見，從正常大腸黏膜組織到大腸腺瘤組織再到大腸癌組織，uPA從不表達到弱陽性表達直至強陽性表達，大腸癌與正常大腸黏膜和大腸腺瘤組織之間的陽性表達差異有統計學意義（P＜0.05），說明uPA在大腸癌變過程中起到促進作用；此外，本研究亦發現uPA與病理分期及組織學分級有關（P＜0.05），病理分期高、組織分化程度低的組織，uPA的陽性表達越強，提示uPA表達水平促進了惡性程度高的腫瘤侵襲能力，預后較差；uPA與有無淋巴結轉移有關（P＜0.05），說明在大腸癌侵襲轉移中發揮了重要作用。
GSK3是一個多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是許多信號通路如Wnt、PI3/AKT、核因子-κB（NF-κB）等中的重要組成部分。GSK3β作為GSK3一個亞型，人體大多數器官、組織和細胞有表達，GSK3β的活性由不同位點的磷酸化狀態調節，當GSK3β發生磷酸化可降低其活性。已有研究發現，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的P38MAPK可通過使GSK3β的N端絲氨酸9處或是C端磷酸化失活，使Wnt通路中的主要蛋白β-catenin的穩定性發生改變，在腫瘤細胞發生β-catenin的核異位，進而促進惡性腫瘤的發生發展和浸潤轉移[7, 8]。因此，由此可判定磷酸化后GSK3β（P-GSK3β）可能對腫瘤起到促進作用，使腫瘤細胞間黏附功能下降以及腫瘤細胞-基質間黏附力增強[9, 10]。我們研究發現P-GSK3β在正常大腸黏膜組織中不表達，大腸腺瘤中弱表達，而大腸癌組織中呈高表達。且P-GSK3β與大腸癌中淋巴結轉移、病理分期及組織學分級有關（P＜0.05），提示P-GSK3β在大腸癌的發生發展起促進作用。
本研究發現uPA和P-GSK3β在大腸癌組織中表達呈正相關，其機制可能是：uPA基因啟動子區有AP-1、SP-1、ETS 等轉錄因子結合位點[11, 12]，MAPK通路中的p38活化后可磷酸化增強包括ETS在內的多種轉錄因子的活性，引起uPA 基因轉錄增強，uPA 產生增多。同時，P38也可使GSK3β的N端或是C端絲氨酸磷酸化失活，進而促進β-catenin發生核異位，Wnt信號通路激活。uPA和P-GSK3β可能通過MAPK通路中的P38發生交互作用。
總之，uPA和P-GSK3β在大腸癌組織中過表達狀態，與大腸癌的發生、發展和轉移密切相關。本研究結果將有助于人們對大腸癌發病機制的認識，為大腸癌防治探索新思路和尋找新方法。
大腸癌是消化系統常見的惡性腫瘤之一，近年來隨著國人生活水平提高和生活習慣改變，其發病率逐年增高，且有發病年輕化的趨勢。惡性腫瘤的發生與侵襲、轉移是一個復雜的過程，其中尿激酶型纖溶酶原激活系統在使細胞外基質降解過程以及惡性腫瘤細胞的侵襲轉移中起著主要作用。本研究擬用微波EliVisionTM免疫組織化學法檢測正常大腸黏膜、大腸癌和大腸腺瘤組織中尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）和糖原合成酶激酶-3β磷酸化（P-GSK3β）的表達情況，分析這兩種蛋白表達與大腸癌生物學行為的關系，并探討它們在大腸癌中發生、發展中的作用，為臨床治療提供科學依據。
1 資料與方法
1.1 一般資料
所有病理標本均選取2006年1月－2010年12月在河北省邯鄲市中心醫院行大腸癌手術標本，共計78例，所有患者術前均未行化學治療或放射治療等相關治療。78例患者中，男53例，女25例；年齡39～79歲，平均59.3歲；有淋巴結轉移43例，無淋巴轉移35例。按WHO消化系統腫瘤分類標準（2000年）進行組織學分級：高分化24例，中分化24例，低分化30例。所有病例根據國際抗癌聯盟2003年修訂的TNM分期標準進行臨床病理分期。同時，另取同期手術切除和結腸鏡活檢并經病理確診的大腸腺瘤30例，另取距腫瘤5 cm以上正常大腸黏膜組織20例作為正常對照組。
1.2 試劑與方法
鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接（SP）試劑盒、二硝基聯苯胺（DAB）顯色液及uPA和P-GSK3β（北京中杉金橋生物技術有限公司）。采用SP法，免疫組織化學染色按SP試劑盒說明操作，以3%過氧化氫室溫孵育10 min除去內源性過氧化物酶的活性，抗原熱修復，加入一抗、二抗和辣根過氧化物酶，DAB顯色，蘇木素襯染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡觀察。其陽性對照組選取已知uPA和P-GSK3β陽性表達的乳腺癌切片，陰性對照是以磷酸鹽緩沖液緩沖液代替一抗。
1.3 結果判斷
uPA和P-GSK3β的陽性表達均主要定位于細胞質，以uPA和P-GSK3β在細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性表達。定性觀察按細胞有無顯色及染色強度進行計分：細胞質內無顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。按顯色細胞的比例記分：每200倍視野下，計數1 000個細胞，顯色細胞＜10%為0分，10%～30%顯色為1分，31%～60%顯色為2分，≥61%以上顯色為3分。以上每例兩個積分相乘，積分0分為陰性，積分≥1分為陽性。為減少人為因素造成的判斷誤差，由2名高年資病理醫師逐一觀察同一切片，以兩人觀察結果一致作為最終的評定結果。
1.4 統計學方法
應用SPSS 16.0統計軟件，組間陽性表達率的比較采用χ2檢驗，uPA和P-GSK3β在大腸癌組織陽性表達的相關性分析采用Spearman相關分析，P值＜0.05為有統計學意義。
2 結果
2.1 uPA、P-GSK3β在正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌組織中的表達
uPA、P-GSK3β的染色結果以細胞質內出現棕色顆粒或染成棕黃色為陽性信號（圖 1、2）。大腸癌uPA、P-GSK3β陽性表達率顯著高于正常大腸黏膜、大腸腺瘤（P＜0.05），正常大腸黏膜、大腸腺瘤的uPA、P-GSK3β陽性表達率差異無統計學意義（P＞0.05），見表 1。
圖1
光學顯微鏡下uPA在大腸癌組織切片中的免疫組織化學染色情況（SP×200） ? ?圖 2 光學顯微鏡下P-GSK 3β在大腸癌組織切片中的免疫組織化學染色情況（SP×200）
表1
正常大腸黏膜、大腸腺瘤和大腸癌組織中uPA、P-GSK3β的表達
2.2 uPA、P-GSK3β在大腸癌組織中的表達與臨床病理指標的關系
在大腸癌組織中，uPA、P-GSK3β的陽性表達與患者的性別、年齡、部位和大小無明顯相關性（P＞0.05），而與組織學分級、病理分期以及淋巴結轉移有關（P＜0.05），見表 2。
表2
uPA和P-GSK3β蛋白在大腸癌中的表達與臨床病理指標的關系
2.3 uPA、P-GSK3β在大腸癌組織中的相關性分析
大腸癌組織中uPA和P-GSK3β的陽性表達進行相關性分析發現，二者在大腸癌組織中的陽性表達呈正相關（r=0.381，P=0.001），見表 3。
表3
uPA和P-GSK3β蛋白在大腸癌組織中的相關性
3 討論
浸潤和轉移是惡性腫瘤最重要的生物學特征，癌基因激活、抑癌基因失活或突變以及腫瘤血管生成等因素和步驟參與了惡性腫瘤的浸潤轉移。其中，腫瘤細胞分泌的蛋白水解酶對細胞外基質和基底膜水解作用是腫瘤細胞浸潤生長和轉移的分子基礎和先決條件[1]。uPA是一種絲氨酸蛋白酶，它介導的纖維蛋白溶解系統與惡性腫瘤浸潤轉移密切相關[2]。uPA與表面受體結合后活性增加，可使無活性的纖維蛋白酶原變成有活性的纖維蛋白酶，與纖維蛋白酶通過直接和間接作用降解細胞外基質，促進腫瘤細胞侵襲、轉移[3]。研究發現，多種惡性腫瘤中如胃癌、乳腺癌、肺癌等中均有uPA的過表達[4-6]。本研究可見，從正常大腸黏膜組織到大腸腺瘤組織再到大腸癌組織，uPA從不表達到弱陽性表達直至強陽性表達，大腸癌與正常大腸黏膜和大腸腺瘤組織之間的陽性表達差異有統計學意義（P＜0.05），說明uPA在大腸癌變過程中起到促進作用；此外，本研究亦發現uPA與病理分期及組織學分級有關（P＜0.05），病理分期高、組織分化程度低的組織，uPA的陽性表達越強，提示uPA表達水平促進了惡性程度高的腫瘤侵襲能力，預后較差；uPA與有無淋巴結轉移有關（P＜0.05），說明在大腸癌侵襲轉移中發揮了重要作用。
GSK3是一個多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，是許多信號通路如Wnt、PI3/AKT、核因子-κB（NF-κB）等中的重要組成部分。GSK3β作為GSK3一個亞型，人體大多數器官、組織和細胞有表達，GSK3β的活性由不同位點的磷酸化狀態調節，當GSK3β發生磷酸化可降低其活性。已有研究發現，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的P38MAPK可通過使GSK3β的N端絲氨酸9處或是C端磷酸化失活，使Wnt通路中的主要蛋白β-catenin的穩定性發生改變，在腫瘤細胞發生β-catenin的核異位，進而促進惡性腫瘤的發生發展和浸潤轉移[7, 8]。因此，由此可判定磷酸化后GSK3β（P-GSK3β）可能對腫瘤起到促進作用，使腫瘤細胞間黏附功能下降以及腫瘤細胞-基質間黏附力增強[9, 10]。我們研究發現P-GSK3β在正常大腸黏膜組織中不表達，大腸腺瘤中弱表達，而大腸癌組織中呈高表達。且P-GSK3β與大腸癌中淋巴結轉移、病理分期及組織學分級有關（P＜0.05），提示P-GSK3β在大腸癌的發生發展起促進作用。
本研究發現uPA和P-GSK3β在大腸癌組織中表達呈正相關，其機制可能是：uPA基因啟動子區有AP-1、SP-1、ETS 等轉錄因子結合位點[11, 12]，MAPK通路中的p38活化后可磷酸化增強包括ETS在內的多種轉錄因子的活性，引起uPA 基因轉錄增強，uPA 產生增多。同時，P38也可使GSK3β的N端或是C端絲氨酸磷酸化失活，進而促進β-catenin發生核異位，Wnt信號通路激活。uPA和P-GSK3β可能通過MAPK通路中的P38發生交互作用。
總之，uPA和P-GSK3β在大腸癌組織中過表達狀態，與大腸癌的發生、發展和轉移密切相關。本研究結果將有助于人們對大腸癌發病機制的認識，為大腸癌防治探索新思路和尋找新方法。
