抗菌肽是一類廣泛存在于自然界，具有廣譜抗菌活性的多肽類物質，因其獨特的抗菌作用機制被視為傳統抗生素的新型替代藥物。由于天然抗菌肽往往存在活性不強、代謝不穩定等缺點，導致其開發與應用受到很多限制，因此基于天然抗菌肽的設計與優化成為了近期研究熱點。本文主要針對核糖體抗菌肽展開，總結其相關的一些衍生肽的設計和優化策略，包括合理的一級結構改造、環化策略、計算機輔助策略等，通過分析總結，期望對抗菌肽設計以及抗感染藥物的研發提供思路。
引用本文： 張若男, 吳迪, 高藝恬. 抗菌肽的設計與優化研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2022, 39(6): 1247-1253. doi: 10.7507/1001-5515.202206017 復制
引言
抗生素的出現為治療細菌感染提供了有力保障，然而由于抗生素的濫用導致細菌耐藥問題逐漸加劇。由于抗生素的研發速率遠遠不及細菌對其產生耐藥的速度，導致人類健康面臨重大威脅，正在逐漸走向后抗生素時代[1]。相較于傳統抗生素，抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）具有廣譜抗菌活性和低細胞毒性的特點，由于主要作用于細菌細胞膜，不易產生耐藥性[2]，因此抗菌肽逐漸成為國內外研究的熱點，有望開發成為新型抗菌藥。
抗菌肽是多細胞生物免疫防御的重要組成部分，在動物、植物、微生物等生物體內廣泛存在，可以從天然來源中提取或者通過化學方法合成[3]。抗菌肽的分類方法有很多，基于生物合成機制，抗菌肽可分為核糖體抗菌肽和非核糖體抗菌肽[4]；根據其二級結構分類，可分為具有α-螺旋結構的肽、具有β-折疊結構的肽、同時具有α-螺旋和β-折疊結構的肽以及富含某種氨基酸的線性肽等。此外，一些綜述將環狀或其他復雜拓撲結構的肽歸為具有第五類結構的抗菌肽[4]。非核糖體合成的抗菌肽通常只來自于細菌和真菌，其抗菌譜一般較窄，如多粘菌素B只對革蘭氏陰性菌有效[5]。而核糖體合成抗菌肽則來源廣泛、結構多樣，是抗菌肽領域研究的重要方向。本綜述主要針對核糖體合成的抗菌肽而展開，這類抗菌肽是基因編碼的由陽離子和疏水氨基酸組成的成熟肽，通常具有廣譜抗菌活性，長度從2～50個氨基酸殘基不等，存在一定的空間結構。
目前抗菌肽的開發與應用仍然存在很多限制，如生物體內的抗菌肽提取困難，生產成本高；部分抗菌肽具有全身毒性、體內不穩定性、抗菌活性低等問題[6-7]。因此，研究者們以天然抗菌肽為模板，進行衍生肽設計優化，以期開發出新的強效低毒抗菌肽藥物。本文將一些抗菌肽的設計和優化方法進行總結分析，以期對抗菌肽藥物的開發提供一定的參考。
1 抗菌肽的設計與優化
從廣義上講，設計與改造抗菌肽的方法大致可以分為三種：傳統化學改造和修飾(包括：引入天然氨基酸或非天然氨基酸進行點突變、脂化修飾、糖基化修飾、雜交、環化等)、計算機輔助設計和高通量篩選。
1.1 傳統化學改造和修飾策略
基于天然多肽的一些缺陷，如細胞毒性和易被蛋白酶水解的不穩定性等，直接使用天然多肽仍然受到很多限制，針對其進行傳統化學改造和修飾，仍是克服此類弊端的常用策略。本文總結了一些傳統化學修飾的方法，包括引入天然或非天然氨基酸進行點突變、模擬天然肽翻譯后修飾的化學修飾(糖基化修飾、氮端的脂化修飾等)、構建雜交肽、環化等多種手段。
1.1.1 點突變
自然界中，20種基本天然氨基酸為：丙氨酸（alanine，A）、精氨酸（arginine，R）、天冬酰胺（asparagine，N）、天冬氨酸（aspartic acid，D）、半胱氨酸（cysteine，C）、谷氨酰胺（glutamine，Q）、谷氨酸（glutamic acid，E）、甘氨酸（glycine，G）、組氨酸（histidine，H）、亮氨酸(leucine，L)、異亮氨酸(isoleucine，I)、賴氨酸（lysine，K）、甲硫氨酸（methionine，M）、苯丙氨酸(phenylalanine，F)、脯氨酸（proline，P）、絲氨酸（serine，S）、蘇氨酸（threonine，T）、色氨酸（tryptophan，W）、絡氨酸（tyrosine，Y）、纈氨酸(valine，V)。
目前，采用天然或非天然氨基酸替換肽序列，進行一級結構改造是多肽優化設計中最常用的方法。凈電荷、疏水性、兩親性是影響抗菌肽抗菌活性的重要因素，改變抗菌肽的凈電荷是優化其抗菌活性的一種有效策略。為了探究凈電荷對肽活性的影響，Ramezanzadeh等[8]通過用帶正電荷的賴氨酸取代帶負電荷的氨基酸殘基的方式設計了天然肽Aurein 1.2（氨基酸序列：GLFDIIKKIAESF）的一系列衍生肽。與母肽相比，凈正電荷為+5的衍生肽Aurein M3（氨基酸序列：GLFKIIKKIWKSF）對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)增強了8～64倍，對革蘭氏陰性菌的治療指數顯著增強，超過天然肽33倍以上，因此增加正電荷或可作為一種有效提高抗菌肽抗菌效力和選擇性的方法。
Schifano等[9]通過用疏水性氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸或纈氨酸）均勻替換天然疏水殘基來修改肽序列，結果發現疏水性降低，抗菌活性隨之降低或完全喪失。此外，Chen等[10]把肽V13KL（序列為：Ac-KWKSFLKTFKSAKKTVLHTALKAISS- NH2）作為模板，通過用疏水的亮氨酸殘基取代丙氨酸殘基以增加肽疏水性，并通過反向操作以降低肽疏水性來對比闡述疏水性與抗菌活性的關系。結果發現，疏水性對于肽抗菌活性的影響存在一個閾值，一旦疏水性偏離最佳疏水閾值會導致抗菌效力降低，因此合理調整抗菌肽的疏水性可能獲得最佳抗菌活性。
抗菌肽的兩親性對于抗菌活性及抗菌譜選擇性也有很大影響，Zhu等[11]通過將RI16（序列為：RFRRLRKKTRKRLKKI-NH2）疏水面中心的蘇氨酸替換為色氨酸以增強兩親性，得到了T9W（序列為：RFRRLRKKWRKRLKKI-NH2）。相比較于母肽，T9W對銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）的抗菌活性顯著增加，MIC值降為原來的1/64。總而言之，正電荷、兩親性以及疏水性是影響抗菌肽抗菌作用的重要因素，合理運用這些參數對多肽進行改造是優化抗菌肽的有效策略之一。
1.1.2 抗菌肽的翻譯后修飾
隨著對天然抗菌肽活性功能的深入研究，相同抗菌肽前體可以通過不同翻譯后修飾而獲得不同功能。這一研究為抗菌肽的設計改造提供了新的思路，可以在原有序列的基礎上增加不同的修飾對抗菌肽的活性功能進行進一步的優化。其中，脂化修飾和糖基化修飾對于優化多肽活性顯示出更明顯的優勢。如Li等[12]的文章中就報道了脂化修飾和糖基化修飾均可以增加多肽的穩定性、膜滲透性和抗菌活性。親水肽和疏水脂肪酸通過酰胺鍵連接而成的脂肽，可以將部分脂尾插入細菌膜中，從而促進該脂肽二級結構的形成，增強疏水性和膜裂解能力，進一步增強對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌活性。但多肽的糖基化修飾是將糖苷基共價連接到肽鏈的特定殘基上，包括N-糖基化[13]、O-糖基化[14]、C-糖基化[15]和S-糖基化[16]。這種修飾方法更具有靶向性，有助于提高其對于目標細菌的結合能力從而增強抗菌活性。例如，Kamysz等[17]通過脂化修飾的方法，將肽KR12（序列為：KRIVQRIKDFLR-NH2）的N-末端與一系列N-烷基脂肪酸和芳香酸綴合，在增加抗菌活性的同時增強了其抗生物膜的活性。而Su等[16]通過S-糖基化修飾的方法，將抗菌肽ε-聚-L-賴氨酸(ε-poly-L-lysine，EPL)與殼聚糖(chitosan，CS)共價結合，顯著增強其對陰離子微生物膜的破壞能力，同時不會破壞哺乳動物細胞膜。
1.1.3 雜交肽
多條肽鏈或肽鏈片段之間雜交可以得到一條新的多肽，研究人員通過這種方法獲取新興肽段以期達到增強抗菌效力并降低細胞毒性的目的。這種新興肽段通常被稱為“雜交”肽[18]。例如，將靶向肽和抗菌能力較強的肽雜交是一種常見的設計策略，即利用靶向肽來提高廣譜抗菌肽的特異性，從而達到選擇性地消除病原體的目的。其中，一種特異性抗糞腸球菌（enterococcus faecalis， E. faecalis）的美國模式培養物集存庫（American type culture collection， ATCC）29212菌株的合成抗菌肽[19]，是將E. faecalis特異性信息素cCF10（序列為：LVTLVFV）與肽C6（WKWKWKNGKWKWKW）融合得到cCF10-C6，再通過用E取代陽離子K殘基來修飾該肽的凈電荷從而進一步提高特異性。
此外，雜交策略也可以增加多肽對微生物的選擇性。例如，Choudhury等[20]將從噬菌體文庫篩選得到的靶向葡萄球菌的抗菌肽A12C（序列為：VHMVAGPGREPT）分別與廣譜抗菌肽假黑盤菌素（plectasin）（序列為：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGG FVCKCY）和神經肽（eurosin）（序列為：GFGCPGDAYQCSEHCRALGGGRTGGYCAGPWYL GHPTCTCSF）融合。MIC實驗表明，與單獨的plectasin或eurosin相比，融合肽保留了plectasin和eurosin抑制金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，S. aureus）ATCC 35556菌株的能力，對其他菌株，如E. faecalis ATCC 47077菌株、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis, B. subtiliss） ATCC 6051菌株和鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnosus， L. rhamnosus）ATCC 7469菌株的抗菌能力顯著降低。此外，Kim等[21]的課題組報道了靶向肽PA2（序列為：SQRKLAAKLTSK）和高效抗菌肽GNU7（序列為：RLLRPLLQLLKQKLR）組合而成的雜交肽PA2-GNU7（MIC = 2 μmol），可以特異性靶向P. aeruginosa；并且在多重耐藥P. aeruginosa感染小鼠模型中，PA2-GNU7（濃度為：25 mg/kg）治療組與美羅培南（meropenem）治療組相比，PA2-GNU7的治療存活率增加了75%以上，顯著高于meropenem。
1.1.4 環狀肽
抗菌肽的空間構象是影響抗菌作用的重要因素之一。雖然抗菌肽具有一定的空間構象(α-螺旋和β-折疊)，但相較于蛋白質，由于抗菌肽一級結構較短，空間構象易隨環境發生改變進而影響抗菌作用，因此有效固定空間構象可以作為保持抗菌活性的重要策略之一。肽環化是實現穩定空間構象的一種有效手段。此外，環化肽可以增加多肽類藥物的體內穩定性。研究表明，由于環化肽具有蛋白酶水解穩定性和構象剛性，所以表現出良好的抗菌活性和較強的細胞選擇性，而且也能降低宿主細胞毒性[22]。多肽類藥物一般呈現四種常見的環化類型，包括：頭-尾環化、頭-側鏈環化、側鏈-尾環化、側鏈-側鏈環化[23]，如圖1所示，其中R基代表氨基酸的側鏈基團，不同氨基酸的側鏈基團不同。頭-尾環化通常采用直接耦合的方法來環化線性肽前體，在肽的C-端羧酸和N-端氨基之間形成酰胺鍵，由于缺乏極性的N-端或C-端，使得到的環化肽更耐外肽酶的水解，但會受到環的大小和肽序列的限制，且容易發生C端異構化、環二聚化和偶聯效率低等問題[24]。頭-側鏈或側鏈-尾環化，則是C-端羧酸或者N-端氨基與側鏈氨基酸殘基中的官能團之間形成內酰胺、內酯或硫內酯[24]，從而表現出更高的細胞通透性和對蛋白酶的穩定性。
圖1
抗菌肽環化的四種類型
Figure1.
Four types of cyclization of antimicrobial peptides
側鏈-側鏈環化是目前穩定二級結構最常用的策略，不同的側鏈官能團會在兩個氨基酸殘基之間形成不同的“橋”。比如，防御素是一類由分子內二硫鍵橋連而成的天然抗菌肽，受防御素的啟發，Mwangi等[25]通過在靠近N-和C-末端的地方引入兩個半胱氨酸殘基，將線性的抗菌肽cathelicidin-BF15-a3（序列為：VKRWKKWKRKWKKWV-NH2）轉化為環肽ZY4（序列為：VCKRWKKWKRKWKKWCV-NH2）。該環肽對中國工業微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection， CICC）21625的P. aeruginosa菌株和鮑曼不動桿菌（acinetobacter baumannii， A. baumannii） ATCC 22933菌株具有良好的抗菌活性，且血清穩定性較高。此外，通過共價鍵合同一螺旋面（如i和i + 4、i和i + 7位置）上的兩個氨基酸使肽鏈環化得到的釘合肽，常被用來穩定α-螺旋構象，從而保持其與靶標的結合能力。目前已經有各種高選擇性的化學連接方法被開發用于合成釘合肽，如閉環復分解（ring-closing metathesis， RCM）、炔烴和疊氮之間的點擊化學、二硫鍵和硫醚等[22]。在抗菌肽數據庫（data repository of antimicrobial peptides，DRAMP）3.0中（網址為：http://dramp.cpu-bioinfor.org/），也特別新增并強調了釘合肽[26]。最近Li等[27]開發了一種合成釘合肽的新方法，通過N-烷基化反應將兩個賴氨酸殘基連接在陽離子α-螺旋抗菌肽的親水表面上，從而形成賴氨酸釘合環肽。他們以抗菌肽OH-CM6（序列為：KFFKKLKKAVKKGFKKFAKV）為模板合成一系列新型環肽，且通過實驗發現這種方法在保留凈電荷和不會誘導溶血的同時，提高了抗菌活性和蛋白酶穩定性。
1.2 計算機輔助設計策略
計算機輔助設計是一種利用計算機輔助設計抗菌肽的方法。經典方法常通過以生物分子互作為基礎，例如依據已知蛋白數據庫同源建模，篩選活性多肽結合位點設計抗菌肽，結合分子動力學中自由能計算篩選潛在活性抗菌肽。此外，還包括集成多組學研究，例如通過結合機器學習模型、深度學習神經網絡等的方式，聯合多組學分析與疾病分子的作用機制，從而深入開發設計優化抗菌肽。另外，應用抗菌肽數據庫數據分析，也可以作為獲得有效抗菌肽的方法之一[28]。為了探究抗菌肽的構效關系，可以采用不同機器學習方法，包括：支持向量機（support vector machine，SVM）[29]、隨機森林(random forest，RF)[30]和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）等方法。此外，在大量可用數據集的背景下，定量構效關系（quantitative structure–activity relationship，QSAR）模型可以將一組肽的序列特征（預測變量）與實驗驗證（響應變量）的抗菌活性值的相關性聯系起來。Waghu等[31]建立了抗菌肽家族cathelicidins的QSAR模型，并應用該模型準確預測設計對大腸桿菌（escherichia coli，E. coli）ATCC 25922菌株有活性的新肽。C肽（C-peptide，CP）（序列為：GGLRRLGRKILRAVKKYG），是一種基于該家族QSAR模型設計的肽，具有很高的抗菌活性，且預測活性與體外測試抗菌活性的MIC均為6.25～12.5 μmol。因此，已有的抗菌肽數據庫可以作為識別和優化抗菌肽的有效工具。
遺傳算法從潛在序列中優化特定屬性（適應度函數）[32]，借此可以尋找具有最佳抗菌活性的肽。Porto等[33]將從番石榴（psidium guava）中分離出的抗菌肽Pg-AMP1作為模板，通過遺傳算法設計得到一個抗菌肽庫，然后篩選該庫中多肽對P. aeruginosa ATCC 27853菌株的活性，并選取疏水力矩和α-螺旋參數結合抗菌活性進行矩陣回歸指導設計優化。其中，抗菌肽Guavanin2（序列為：RQYMRQIEQALRYGYRISRR）是利用該方法設計優化的最優抗菌肽(MIC = 25 μmol），體外篩選最優且對革蘭氏陰性菌具有選擇性。
化學空間是由所有可能的有機小分子組成的屬性空間，包括存在于生物系統中的抗菌肽。使用各種算法去探索肽化學空間的特定區域，并生成有針對性的肽虛擬庫，然后通過虛擬篩選化學空間確定設計合成和經過實驗驗證的過程，能更準確地識別新的有效抗菌肽[34]。Di等[35]利用化學空間的概念，并分析肽活性相關的分子形狀和藥效團來設計生成抗菌雙環肽（antimicrobial bicyclic peptide，AMBP）虛擬庫。他們通過插入線性序列的兩個半胱氨酸殘基與N端的3,5-雙（氯甲基）甲苯基［3,5-bis（chloromethyl）toluoyl，B］之間形成雙分子硫醚，從而提供了雙環結構。其中，D-型雙環肽bp56（序列為：B12LKKKLKC1LC2KLLKKLL， 1和2表示環化點， L為D-型亮氨酸， K為D-型賴氨酸， C為D-型半胱氨酸）能有效地殺死實驗室保存的P. aeruginosa PAO1菌株（MIC = 4 μg/mL）及其他多藥耐藥的P. aeruginosa菌株（ATCC編號為：PEJ2.6、16051788、16050914、16060789、X1604603，MIC均為8 μg/mL）。
無論是以合成還是抗菌活性篩選的方式制備優化抗菌肽，成本都較為昂貴且耗時較長，因此如果能利用生物信息學資源和使用計算機輔助分析抗菌肽數據從而優化抗菌肽抗菌功能就不失為一種有效途徑。計算機輔助設計方法使人們能夠借助多種算法去探索抗菌肽的構效關系。抗菌肽庫也可以提供數據或者模板序列，從而促進計算機輔助設計和優化創新肽序列。
1.3 高通量篩選
高通量篩選是一種基于通量和覆蓋范圍的篩選方法。傳統高通量篩選有效抗菌肽的方式，主要采用噬菌體展示。噬菌體展示能夠得到多樣性的肽庫，為設計有效抗菌肽提供了新思路。Heinis等[36]通過噬菌體展示法得到雙環肽，首先在絲狀噬菌體表面生成了序列為C-X6-C-X6-C的線性肽庫，其中C是半胱氨酸，X是20種天然氨基酸中的任意一種；然后再通過將線性肽與小分子支架三(溴甲基)苯［tris-（bromomethyl）benzene，TBMB］反應，TBMB選擇性地烷基化序列中的三個C殘基，將線性肽轉化為雙環肽。
此外，點合成（spot synthesis）也是高通量篩選方法，主要在纖維素上合成肽陣列，可以直接篩選合成數百個肽，提供了在平面上直接合成大量肽的可能性[37]。Hilpert等[38]利用點合成篩選了一個基于牛抗菌肽bactenecin衍生物（序列為：RLARIVVIRVAR-NH2）組成的完整替代文庫。結果發現，其中的Sub3（序列為：RRWRIVVIRVRR-NH2）顯示出廣譜活性，對E. coli UB1005菌株的MIC低至0.5 μg/mL。
1.4 其他設計方法
1.4.1 短片段重復設計肽
幾個氨基酸進行簡單重復也可被設計合成為有效抗菌肽[39-41]。如Wang等[42]構建了（XYPX）n重復單元，其中X代表異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸，Y代表精氨酸或賴氨酸，P代表脯氨酸。然后對氨基酸進行排列組合并進一步篩選，發現具有七個重復單元的肽R7I（序列為：IRPIIRPIIRPIIRPIIRPIIRPIIRPI-NH2），對革蘭氏陰性菌具有較好的抗菌活性，同時在小鼠腹膜炎模型中仍保持優異的活性。
色氨酸拉鏈（trpzip）肽是已知最穩定的β-發夾肽之一，無需共價二硫化物約束或金屬結合即可自發折疊，其β-片層臂可由簡單的氨基酸組成。Xu等[43]以（WK）nPG（KW）n-NH2（n = 1、2、3、4、5， P代表D-型脯氨酸）為模板，設計得到五條抗菌肽。MIC結果表明，WK3（序列為：WKWKWKPGKWKWKW-NH2）和WK4（序列為：WKWKWKWKPGKWKWKWKW-NH2）的抗菌效力最強，六種測試菌株的MIC均為1～4 μmol，但WK3具有更好的選擇性。這表明，肽的抗菌效力隨著重復單元的增加而增加，進一步增加鏈長會導致抗菌活性降低甚至喪失。
1.4.2 自組裝抗菌肽
利用多肽單元之間通過如氫鍵、π-π堆積等非共價相互作用自發形成有序的納米球或納米管等超分子結構，通常需要多條肽鏈的合作才能在細菌膜上打孔[44]。Shen等[45]設計了一種在陰離子溶液（pH > 9.4）中自組裝成納米纖維的陽離子八肽，即FF8（序列為：KRRFFRRK）。該肽特異性靶向帶負電的類脂膜，在脂膜表面累積并在其上自組裝成納米纖維，是革蘭氏陰性菌的有效抗菌肽和選擇性試劑（如對E. coli和S. aureus的MIC分別為25.6 μmol和625 μmol）。
2 不同設計與優化方法的對比
本文描述了幾種不同抗菌肽的設計與優化策略，通過對不同方法進行比較，可以提高優化效率。
傳統化學改造和修飾策略是藥物發現從初步篩選到先導優化的關鍵方法。點突變是對多肽的一級結構進行修飾，雖然簡單直接，但優化過程工業化生產和人工篩選的成本通常比較高。N-末端脂化修飾可以提高抗菌肽的疏水性，增強膜滲透性，但未考慮降低抗菌肽對哺乳動物細胞毒性的問題；糖基化修飾更傾向于改善抗菌肽的穩定性和靶向識別結合目標的能力，但缺乏創新性。構建雜交肽可以增強多肽的靶向特異性和對微生物的選擇性，在提高靶向殺菌能力的同時可以保護有益菌群，但因其僅能殺滅一種細菌從而導致其應用范圍受到限制。環化是對多肽的二級結構進行修飾，雖然空間構象穩定、具有細胞選擇性并能降低細胞毒性，但環化過程易產生異構體、二聚體，且環化效率低，可能需要對肽鏈基團進行保護和脫保護導致生產工藝復雜。
計算機輔助設計策略雖然更具有創新性，但肽庫篩選規模相對龐大且迭代和篩選成本較高，新的軟件算法的開發也依然需要提升。高通量篩選具有直接靶向性，篩選規模介于傳統化學改造和修飾策略與計算機輔助設計策略之間，篩選成本也相對較高。綜上，目前已有的多種設計優化方法各有優缺點，研究者們可依據客觀條件綜合考慮后擇優選擇。
3 結論與展望
抗生素濫用引發的細菌耐藥性問題迫使人們必須加快新型抗菌藥物的研發步伐。抗菌肽往往具有毒副作用小和不易誘發耐藥性的特點，有望開發成為新型抗菌候選藥物。然而天然抗菌肽通常存在體內有效性低、毒性高且生產成本高的問題，因此對其進行設計與優化，增強其作為候選藥物的潛力。
目前設計與優化抗菌肽的方法包括傳統化學改造和修飾策略、計算機輔助設計等，同時高通量肽合成和篩選技術也加快了該領域的研究進展。無論是是簡單的氨基酸替換，還是復雜的機器學習方法，在設計和優化抗菌肽以及提高肽抗菌活性方面已經取得了一定的進展。但是目前的研究仍然存在一些局限，比如大多數抗菌肽的研究只在幾種微生物菌種上進行測試；研究者測試抗菌肽的MIC方法尚沒有統一的標準；不同研究報道的同種細菌不同菌株的MIC測試值不能直接進行比較總結；新型抗菌藥物的開發需要多學科環境，包括微生物學、藥物化學、合成化學等多個研究領域等。盡管存在這些不足，但隨著設計方法的進步，未來將會開啟更多設計新型抗菌肽的可能性，從而得到更安全、更有效、更具有臨床應用潛力的候選藥物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張若男為綜述主要撰寫人，負責相關文獻資料收集與分析、文章撰寫及文章修改；吳迪指導論文寫作；高藝恬是論文的主要審核人，對文章框架和主題提供了指導性的意見。
引言
抗生素的出現為治療細菌感染提供了有力保障，然而由于抗生素的濫用導致細菌耐藥問題逐漸加劇。由于抗生素的研發速率遠遠不及細菌對其產生耐藥的速度，導致人類健康面臨重大威脅，正在逐漸走向后抗生素時代[1]。相較于傳統抗生素，抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）具有廣譜抗菌活性和低細胞毒性的特點，由于主要作用于細菌細胞膜，不易產生耐藥性[2]，因此抗菌肽逐漸成為國內外研究的熱點，有望開發成為新型抗菌藥。
抗菌肽是多細胞生物免疫防御的重要組成部分，在動物、植物、微生物等生物體內廣泛存在，可以從天然來源中提取或者通過化學方法合成[3]。抗菌肽的分類方法有很多，基于生物合成機制，抗菌肽可分為核糖體抗菌肽和非核糖體抗菌肽[4]；根據其二級結構分類，可分為具有α-螺旋結構的肽、具有β-折疊結構的肽、同時具有α-螺旋和β-折疊結構的肽以及富含某種氨基酸的線性肽等。此外，一些綜述將環狀或其他復雜拓撲結構的肽歸為具有第五類結構的抗菌肽[4]。非核糖體合成的抗菌肽通常只來自于細菌和真菌，其抗菌譜一般較窄，如多粘菌素B只對革蘭氏陰性菌有效[5]。而核糖體合成抗菌肽則來源廣泛、結構多樣，是抗菌肽領域研究的重要方向。本綜述主要針對核糖體合成的抗菌肽而展開，這類抗菌肽是基因編碼的由陽離子和疏水氨基酸組成的成熟肽，通常具有廣譜抗菌活性，長度從2～50個氨基酸殘基不等，存在一定的空間結構。
目前抗菌肽的開發與應用仍然存在很多限制，如生物體內的抗菌肽提取困難，生產成本高；部分抗菌肽具有全身毒性、體內不穩定性、抗菌活性低等問題[6-7]。因此，研究者們以天然抗菌肽為模板，進行衍生肽設計優化，以期開發出新的強效低毒抗菌肽藥物。本文將一些抗菌肽的設計和優化方法進行總結分析，以期對抗菌肽藥物的開發提供一定的參考。
1 抗菌肽的設計與優化
從廣義上講，設計與改造抗菌肽的方法大致可以分為三種：傳統化學改造和修飾(包括：引入天然氨基酸或非天然氨基酸進行點突變、脂化修飾、糖基化修飾、雜交、環化等)、計算機輔助設計和高通量篩選。
1.1 傳統化學改造和修飾策略
基于天然多肽的一些缺陷，如細胞毒性和易被蛋白酶水解的不穩定性等，直接使用天然多肽仍然受到很多限制，針對其進行傳統化學改造和修飾，仍是克服此類弊端的常用策略。本文總結了一些傳統化學修飾的方法，包括引入天然或非天然氨基酸進行點突變、模擬天然肽翻譯后修飾的化學修飾(糖基化修飾、氮端的脂化修飾等)、構建雜交肽、環化等多種手段。
1.1.1 點突變
自然界中，20種基本天然氨基酸為：丙氨酸（alanine，A）、精氨酸（arginine，R）、天冬酰胺（asparagine，N）、天冬氨酸（aspartic acid，D）、半胱氨酸（cysteine，C）、谷氨酰胺（glutamine，Q）、谷氨酸（glutamic acid，E）、甘氨酸（glycine，G）、組氨酸（histidine，H）、亮氨酸(leucine，L)、異亮氨酸(isoleucine，I)、賴氨酸（lysine，K）、甲硫氨酸（methionine，M）、苯丙氨酸(phenylalanine，F)、脯氨酸（proline，P）、絲氨酸（serine，S）、蘇氨酸（threonine，T）、色氨酸（tryptophan，W）、絡氨酸（tyrosine，Y）、纈氨酸(valine，V)。
目前，采用天然或非天然氨基酸替換肽序列，進行一級結構改造是多肽優化設計中最常用的方法。凈電荷、疏水性、兩親性是影響抗菌肽抗菌活性的重要因素，改變抗菌肽的凈電荷是優化其抗菌活性的一種有效策略。為了探究凈電荷對肽活性的影響，Ramezanzadeh等[8]通過用帶正電荷的賴氨酸取代帶負電荷的氨基酸殘基的方式設計了天然肽Aurein 1.2（氨基酸序列：GLFDIIKKIAESF）的一系列衍生肽。與母肽相比，凈正電荷為+5的衍生肽Aurein M3（氨基酸序列：GLFKIIKKIWKSF）對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)增強了8～64倍，對革蘭氏陰性菌的治療指數顯著增強，超過天然肽33倍以上，因此增加正電荷或可作為一種有效提高抗菌肽抗菌效力和選擇性的方法。
Schifano等[9]通過用疏水性氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸或纈氨酸）均勻替換天然疏水殘基來修改肽序列，結果發現疏水性降低，抗菌活性隨之降低或完全喪失。此外，Chen等[10]把肽V13KL（序列為：Ac-KWKSFLKTFKSAKKTVLHTALKAISS- NH2）作為模板，通過用疏水的亮氨酸殘基取代丙氨酸殘基以增加肽疏水性，并通過反向操作以降低肽疏水性來對比闡述疏水性與抗菌活性的關系。結果發現，疏水性對于肽抗菌活性的影響存在一個閾值，一旦疏水性偏離最佳疏水閾值會導致抗菌效力降低，因此合理調整抗菌肽的疏水性可能獲得最佳抗菌活性。
抗菌肽的兩親性對于抗菌活性及抗菌譜選擇性也有很大影響，Zhu等[11]通過將RI16（序列為：RFRRLRKKTRKRLKKI-NH2）疏水面中心的蘇氨酸替換為色氨酸以增強兩親性，得到了T9W（序列為：RFRRLRKKWRKRLKKI-NH2）。相比較于母肽，T9W對銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa）的抗菌活性顯著增加，MIC值降為原來的1/64。總而言之，正電荷、兩親性以及疏水性是影響抗菌肽抗菌作用的重要因素，合理運用這些參數對多肽進行改造是優化抗菌肽的有效策略之一。
1.1.2 抗菌肽的翻譯后修飾
隨著對天然抗菌肽活性功能的深入研究，相同抗菌肽前體可以通過不同翻譯后修飾而獲得不同功能。這一研究為抗菌肽的設計改造提供了新的思路，可以在原有序列的基礎上增加不同的修飾對抗菌肽的活性功能進行進一步的優化。其中，脂化修飾和糖基化修飾對于優化多肽活性顯示出更明顯的優勢。如Li等[12]的文章中就報道了脂化修飾和糖基化修飾均可以增加多肽的穩定性、膜滲透性和抗菌活性。親水肽和疏水脂肪酸通過酰胺鍵連接而成的脂肽，可以將部分脂尾插入細菌膜中，從而促進該脂肽二級結構的形成，增強疏水性和膜裂解能力，進一步增強對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌的抗菌活性。但多肽的糖基化修飾是將糖苷基共價連接到肽鏈的特定殘基上，包括N-糖基化[13]、O-糖基化[14]、C-糖基化[15]和S-糖基化[16]。這種修飾方法更具有靶向性，有助于提高其對于目標細菌的結合能力從而增強抗菌活性。例如，Kamysz等[17]通過脂化修飾的方法，將肽KR12（序列為：KRIVQRIKDFLR-NH2）的N-末端與一系列N-烷基脂肪酸和芳香酸綴合，在增加抗菌活性的同時增強了其抗生物膜的活性。而Su等[16]通過S-糖基化修飾的方法，將抗菌肽ε-聚-L-賴氨酸(ε-poly-L-lysine，EPL)與殼聚糖(chitosan，CS)共價結合，顯著增強其對陰離子微生物膜的破壞能力，同時不會破壞哺乳動物細胞膜。
1.1.3 雜交肽
多條肽鏈或肽鏈片段之間雜交可以得到一條新的多肽，研究人員通過這種方法獲取新興肽段以期達到增強抗菌效力并降低細胞毒性的目的。這種新興肽段通常被稱為“雜交”肽[18]。例如，將靶向肽和抗菌能力較強的肽雜交是一種常見的設計策略，即利用靶向肽來提高廣譜抗菌肽的特異性，從而達到選擇性地消除病原體的目的。其中，一種特異性抗糞腸球菌（enterococcus faecalis， E. faecalis）的美國模式培養物集存庫（American type culture collection， ATCC）29212菌株的合成抗菌肽[19]，是將E. faecalis特異性信息素cCF10（序列為：LVTLVFV）與肽C6（WKWKWKNGKWKWKW）融合得到cCF10-C6，再通過用E取代陽離子K殘基來修飾該肽的凈電荷從而進一步提高特異性。
此外，雜交策略也可以增加多肽對微生物的選擇性。例如，Choudhury等[20]將從噬菌體文庫篩選得到的靶向葡萄球菌的抗菌肽A12C（序列為：VHMVAGPGREPT）分別與廣譜抗菌肽假黑盤菌素（plectasin）（序列為：GFGCNGPWDEDDMQCHNHCKSIKGYKGGYCAKGG FVCKCY）和神經肽（eurosin）（序列為：GFGCPGDAYQCSEHCRALGGGRTGGYCAGPWYL GHPTCTCSF）融合。MIC實驗表明，與單獨的plectasin或eurosin相比，融合肽保留了plectasin和eurosin抑制金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus，S. aureus）ATCC 35556菌株的能力，對其他菌株，如E. faecalis ATCC 47077菌株、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis, B. subtiliss） ATCC 6051菌株和鼠李糖乳桿菌（lactobacillus rhamnosus， L. rhamnosus）ATCC 7469菌株的抗菌能力顯著降低。此外，Kim等[21]的課題組報道了靶向肽PA2（序列為：SQRKLAAKLTSK）和高效抗菌肽GNU7（序列為：RLLRPLLQLLKQKLR）組合而成的雜交肽PA2-GNU7（MIC = 2 μmol），可以特異性靶向P. aeruginosa；并且在多重耐藥P. aeruginosa感染小鼠模型中，PA2-GNU7（濃度為：25 mg/kg）治療組與美羅培南（meropenem）治療組相比，PA2-GNU7的治療存活率增加了75%以上，顯著高于meropenem。
1.1.4 環狀肽
抗菌肽的空間構象是影響抗菌作用的重要因素之一。雖然抗菌肽具有一定的空間構象(α-螺旋和β-折疊)，但相較于蛋白質，由于抗菌肽一級結構較短，空間構象易隨環境發生改變進而影響抗菌作用，因此有效固定空間構象可以作為保持抗菌活性的重要策略之一。肽環化是實現穩定空間構象的一種有效手段。此外，環化肽可以增加多肽類藥物的體內穩定性。研究表明，由于環化肽具有蛋白酶水解穩定性和構象剛性，所以表現出良好的抗菌活性和較強的細胞選擇性，而且也能降低宿主細胞毒性[22]。多肽類藥物一般呈現四種常見的環化類型，包括：頭-尾環化、頭-側鏈環化、側鏈-尾環化、側鏈-側鏈環化[23]，如圖1所示，其中R基代表氨基酸的側鏈基團，不同氨基酸的側鏈基團不同。頭-尾環化通常采用直接耦合的方法來環化線性肽前體，在肽的C-端羧酸和N-端氨基之間形成酰胺鍵，由于缺乏極性的N-端或C-端，使得到的環化肽更耐外肽酶的水解，但會受到環的大小和肽序列的限制，且容易發生C端異構化、環二聚化和偶聯效率低等問題[24]。頭-側鏈或側鏈-尾環化，則是C-端羧酸或者N-端氨基與側鏈氨基酸殘基中的官能團之間形成內酰胺、內酯或硫內酯[24]，從而表現出更高的細胞通透性和對蛋白酶的穩定性。
圖1
抗菌肽環化的四種類型
Figure1.
Four types of cyclization of antimicrobial peptides
側鏈-側鏈環化是目前穩定二級結構最常用的策略，不同的側鏈官能團會在兩個氨基酸殘基之間形成不同的“橋”。比如，防御素是一類由分子內二硫鍵橋連而成的天然抗菌肽，受防御素的啟發，Mwangi等[25]通過在靠近N-和C-末端的地方引入兩個半胱氨酸殘基，將線性的抗菌肽cathelicidin-BF15-a3（序列為：VKRWKKWKRKWKKWV-NH2）轉化為環肽ZY4（序列為：VCKRWKKWKRKWKKWCV-NH2）。該環肽對中國工業微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection， CICC）21625的P. aeruginosa菌株和鮑曼不動桿菌（acinetobacter baumannii， A. baumannii） ATCC 22933菌株具有良好的抗菌活性，且血清穩定性較高。此外，通過共價鍵合同一螺旋面（如i和i + 4、i和i + 7位置）上的兩個氨基酸使肽鏈環化得到的釘合肽，常被用來穩定α-螺旋構象，從而保持其與靶標的結合能力。目前已經有各種高選擇性的化學連接方法被開發用于合成釘合肽，如閉環復分解（ring-closing metathesis， RCM）、炔烴和疊氮之間的點擊化學、二硫鍵和硫醚等[22]。在抗菌肽數據庫（data repository of antimicrobial peptides，DRAMP）3.0中（網址為：http://dramp.cpu-bioinfor.org/），也特別新增并強調了釘合肽[26]。最近Li等[27]開發了一種合成釘合肽的新方法，通過N-烷基化反應將兩個賴氨酸殘基連接在陽離子α-螺旋抗菌肽的親水表面上，從而形成賴氨酸釘合環肽。他們以抗菌肽OH-CM6（序列為：KFFKKLKKAVKKGFKKFAKV）為模板合成一系列新型環肽，且通過實驗發現這種方法在保留凈電荷和不會誘導溶血的同時，提高了抗菌活性和蛋白酶穩定性。
1.2 計算機輔助設計策略
計算機輔助設計是一種利用計算機輔助設計抗菌肽的方法。經典方法常通過以生物分子互作為基礎，例如依據已知蛋白數據庫同源建模，篩選活性多肽結合位點設計抗菌肽，結合分子動力學中自由能計算篩選潛在活性抗菌肽。此外，還包括集成多組學研究，例如通過結合機器學習模型、深度學習神經網絡等的方式，聯合多組學分析與疾病分子的作用機制，從而深入開發設計優化抗菌肽。另外，應用抗菌肽數據庫數據分析，也可以作為獲得有效抗菌肽的方法之一[28]。為了探究抗菌肽的構效關系，可以采用不同機器學習方法，包括：支持向量機（support vector machine，SVM）[29]、隨機森林(random forest，RF)[30]和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）等方法。此外，在大量可用數據集的背景下，定量構效關系（quantitative structure–activity relationship，QSAR）模型可以將一組肽的序列特征（預測變量）與實驗驗證（響應變量）的抗菌活性值的相關性聯系起來。Waghu等[31]建立了抗菌肽家族cathelicidins的QSAR模型，并應用該模型準確預測設計對大腸桿菌（escherichia coli，E. coli）ATCC 25922菌株有活性的新肽。C肽（C-peptide，CP）（序列為：GGLRRLGRKILRAVKKYG），是一種基于該家族QSAR模型設計的肽，具有很高的抗菌活性，且預測活性與體外測試抗菌活性的MIC均為6.25～12.5 μmol。因此，已有的抗菌肽數據庫可以作為識別和優化抗菌肽的有效工具。
遺傳算法從潛在序列中優化特定屬性（適應度函數）[32]，借此可以尋找具有最佳抗菌活性的肽。Porto等[33]將從番石榴（psidium guava）中分離出的抗菌肽Pg-AMP1作為模板，通過遺傳算法設計得到一個抗菌肽庫，然后篩選該庫中多肽對P. aeruginosa ATCC 27853菌株的活性，并選取疏水力矩和α-螺旋參數結合抗菌活性進行矩陣回歸指導設計優化。其中，抗菌肽Guavanin2（序列為：RQYMRQIEQALRYGYRISRR）是利用該方法設計優化的最優抗菌肽(MIC = 25 μmol），體外篩選最優且對革蘭氏陰性菌具有選擇性。
化學空間是由所有可能的有機小分子組成的屬性空間，包括存在于生物系統中的抗菌肽。使用各種算法去探索肽化學空間的特定區域，并生成有針對性的肽虛擬庫，然后通過虛擬篩選化學空間確定設計合成和經過實驗驗證的過程，能更準確地識別新的有效抗菌肽[34]。Di等[35]利用化學空間的概念，并分析肽活性相關的分子形狀和藥效團來設計生成抗菌雙環肽（antimicrobial bicyclic peptide，AMBP）虛擬庫。他們通過插入線性序列的兩個半胱氨酸殘基與N端的3,5-雙（氯甲基）甲苯基［3,5-bis（chloromethyl）toluoyl，B］之間形成雙分子硫醚，從而提供了雙環結構。其中，D-型雙環肽bp56（序列為：B12LKKKLKC1LC2KLLKKLL， 1和2表示環化點， L為D-型亮氨酸， K為D-型賴氨酸， C為D-型半胱氨酸）能有效地殺死實驗室保存的P. aeruginosa PAO1菌株（MIC = 4 μg/mL）及其他多藥耐藥的P. aeruginosa菌株（ATCC編號為：PEJ2.6、16051788、16050914、16060789、X1604603，MIC均為8 μg/mL）。
無論是以合成還是抗菌活性篩選的方式制備優化抗菌肽，成本都較為昂貴且耗時較長，因此如果能利用生物信息學資源和使用計算機輔助分析抗菌肽數據從而優化抗菌肽抗菌功能就不失為一種有效途徑。計算機輔助設計方法使人們能夠借助多種算法去探索抗菌肽的構效關系。抗菌肽庫也可以提供數據或者模板序列，從而促進計算機輔助設計和優化創新肽序列。
1.3 高通量篩選
高通量篩選是一種基于通量和覆蓋范圍的篩選方法。傳統高通量篩選有效抗菌肽的方式，主要采用噬菌體展示。噬菌體展示能夠得到多樣性的肽庫，為設計有效抗菌肽提供了新思路。Heinis等[36]通過噬菌體展示法得到雙環肽，首先在絲狀噬菌體表面生成了序列為C-X6-C-X6-C的線性肽庫，其中C是半胱氨酸，X是20種天然氨基酸中的任意一種；然后再通過將線性肽與小分子支架三(溴甲基)苯［tris-（bromomethyl）benzene，TBMB］反應，TBMB選擇性地烷基化序列中的三個C殘基，將線性肽轉化為雙環肽。
此外，點合成（spot synthesis）也是高通量篩選方法，主要在纖維素上合成肽陣列，可以直接篩選合成數百個肽，提供了在平面上直接合成大量肽的可能性[37]。Hilpert等[38]利用點合成篩選了一個基于牛抗菌肽bactenecin衍生物（序列為：RLARIVVIRVAR-NH2）組成的完整替代文庫。結果發現，其中的Sub3（序列為：RRWRIVVIRVRR-NH2）顯示出廣譜活性，對E. coli UB1005菌株的MIC低至0.5 μg/mL。
1.4 其他設計方法
1.4.1 短片段重復設計肽
幾個氨基酸進行簡單重復也可被設計合成為有效抗菌肽[39-41]。如Wang等[42]構建了（XYPX）n重復單元，其中X代表異亮氨酸、亮氨酸或纈氨酸，Y代表精氨酸或賴氨酸，P代表脯氨酸。然后對氨基酸進行排列組合并進一步篩選，發現具有七個重復單元的肽R7I（序列為：IRPIIRPIIRPIIRPIIRPIIRPIIRPI-NH2），對革蘭氏陰性菌具有較好的抗菌活性，同時在小鼠腹膜炎模型中仍保持優異的活性。
色氨酸拉鏈（trpzip）肽是已知最穩定的β-發夾肽之一，無需共價二硫化物約束或金屬結合即可自發折疊，其β-片層臂可由簡單的氨基酸組成。Xu等[43]以（WK）nPG（KW）n-NH2（n = 1、2、3、4、5， P代表D-型脯氨酸）為模板，設計得到五條抗菌肽。MIC結果表明，WK3（序列為：WKWKWKPGKWKWKW-NH2）和WK4（序列為：WKWKWKWKPGKWKWKWKW-NH2）的抗菌效力最強，六種測試菌株的MIC均為1～4 μmol，但WK3具有更好的選擇性。這表明，肽的抗菌效力隨著重復單元的增加而增加，進一步增加鏈長會導致抗菌活性降低甚至喪失。
1.4.2 自組裝抗菌肽
利用多肽單元之間通過如氫鍵、π-π堆積等非共價相互作用自發形成有序的納米球或納米管等超分子結構，通常需要多條肽鏈的合作才能在細菌膜上打孔[44]。Shen等[45]設計了一種在陰離子溶液（pH > 9.4）中自組裝成納米纖維的陽離子八肽，即FF8（序列為：KRRFFRRK）。該肽特異性靶向帶負電的類脂膜，在脂膜表面累積并在其上自組裝成納米纖維，是革蘭氏陰性菌的有效抗菌肽和選擇性試劑（如對E. coli和S. aureus的MIC分別為25.6 μmol和625 μmol）。
2 不同設計與優化方法的對比
本文描述了幾種不同抗菌肽的設計與優化策略，通過對不同方法進行比較，可以提高優化效率。
傳統化學改造和修飾策略是藥物發現從初步篩選到先導優化的關鍵方法。點突變是對多肽的一級結構進行修飾，雖然簡單直接，但優化過程工業化生產和人工篩選的成本通常比較高。N-末端脂化修飾可以提高抗菌肽的疏水性，增強膜滲透性，但未考慮降低抗菌肽對哺乳動物細胞毒性的問題；糖基化修飾更傾向于改善抗菌肽的穩定性和靶向識別結合目標的能力，但缺乏創新性。構建雜交肽可以增強多肽的靶向特異性和對微生物的選擇性，在提高靶向殺菌能力的同時可以保護有益菌群，但因其僅能殺滅一種細菌從而導致其應用范圍受到限制。環化是對多肽的二級結構進行修飾，雖然空間構象穩定、具有細胞選擇性并能降低細胞毒性，但環化過程易產生異構體、二聚體，且環化效率低，可能需要對肽鏈基團進行保護和脫保護導致生產工藝復雜。
計算機輔助設計策略雖然更具有創新性，但肽庫篩選規模相對龐大且迭代和篩選成本較高，新的軟件算法的開發也依然需要提升。高通量篩選具有直接靶向性，篩選規模介于傳統化學改造和修飾策略與計算機輔助設計策略之間，篩選成本也相對較高。綜上，目前已有的多種設計優化方法各有優缺點，研究者們可依據客觀條件綜合考慮后擇優選擇。
3 結論與展望
抗生素濫用引發的細菌耐藥性問題迫使人們必須加快新型抗菌藥物的研發步伐。抗菌肽往往具有毒副作用小和不易誘發耐藥性的特點，有望開發成為新型抗菌候選藥物。然而天然抗菌肽通常存在體內有效性低、毒性高且生產成本高的問題，因此對其進行設計與優化，增強其作為候選藥物的潛力。
目前設計與優化抗菌肽的方法包括傳統化學改造和修飾策略、計算機輔助設計等，同時高通量肽合成和篩選技術也加快了該領域的研究進展。無論是是簡單的氨基酸替換，還是復雜的機器學習方法，在設計和優化抗菌肽以及提高肽抗菌活性方面已經取得了一定的進展。但是目前的研究仍然存在一些局限，比如大多數抗菌肽的研究只在幾種微生物菌種上進行測試；研究者測試抗菌肽的MIC方法尚沒有統一的標準；不同研究報道的同種細菌不同菌株的MIC測試值不能直接進行比較總結；新型抗菌藥物的開發需要多學科環境，包括微生物學、藥物化學、合成化學等多個研究領域等。盡管存在這些不足，但隨著設計方法的進步，未來將會開啟更多設計新型抗菌肽的可能性，從而得到更安全、更有效、更具有臨床應用潛力的候選藥物。
重要聲明
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
作者貢獻聲明：張若男為綜述主要撰寫人，負責相關文獻資料收集與分析、文章撰寫及文章修改；吳迪指導論文寫作；高藝恬是論文的主要審核人，對文章框架和主題提供了指導性的意見。
