焦慮癥是常見的情緒障礙類疾病，嚴重影響著患者正常生活并危害其身心健康。前額葉皮層是焦慮的重要責任腦區。應用清醒動物在體多通道微電極陣列記錄技術可以同時獲取大鼠在高架十字迷宮（EPM）焦慮狀態的動作電位和行為學數據。基于極大似然估計方法（MLE）構建動作電位因果網絡，計算網絡連接強度和全局效率，定量表征大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層動作電位因果網絡連接模式。研究發現大鼠在高架十字迷宮封閉臂的進入次數（44.13±6.99）和停留時間（439.76±50.43）s，均高于開放臂的進入次數（16.50±3.25，P<0.001）和停留時間［（160.23±48.22）s，P<0.001］。封閉臂中的動作電位因果網絡連接強度（0.017 3±0.003 6）和全局效率（0.044 2±0.012 8），均高于開放臂的網絡連接強度（0.010 4±0.003 2，P<0.01）和全局效率（0.034 8±0.011 4，P<0.001），從封閉臂走向開放臂過程中連接強度與全局效率減弱。結果表明內側前額葉皮層動作電位因果網絡變化與焦慮狀態有關，該結果可為研究焦慮狀態的前額葉皮層腦網絡機制提供支持。
引用本文： 保學輝, 董浩然, 劉迢迢, 鄭旭媛. 焦慮狀態前額葉皮層動作電位因果網絡連接模式的研究. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(3): 389-398. doi: 10.7507/1001-5515.201907011 復制
引言
焦慮癥是常見的情緒障礙類疾病，嚴重影響著患者的正常生活并危害其身心健康[1-2]。臨床研究將焦慮定義為一種長期的特征，表現為不確定條件下會出現非適應性的過度警惕和對潛在威脅的高估[3-4]。焦慮作為對威脅、心理應激的反應，是正常且重要的生存本能，但是當焦慮在錯誤的時間頻繁或持續地劇烈發生，對正常生活造成影響時，這種異常的焦慮情緒體驗即是焦慮癥。
高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）實驗由 Pellow 等于 1985 年提出，是研究嚙齒類動物焦慮水平的重要行為學范式[5-6]。高架十字迷宮主要利用了嚙齒類動物對新奇環境探索欲望和對高懸敞開環境恐懼這二者形成的矛盾沖突來考察其焦慮的程度[7]。
已有的研究表明，前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）是焦慮情緒的重要責任腦區[8-9]。大鼠的前額葉皮層分為不同的區域，其中內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）在焦慮神經回路中扮演重要的角色[10]。Stern 等[11]對大鼠內側前額葉皮層注入鈷，使該區域暫時失活，發現內側前額葉皮層失活后的大鼠在高架十字迷宮中增加了對開放臂的探索。Park 等[12]發現焦慮會抑制大鼠前額葉皮層的神經元自發活動，表明異常的內側前額葉皮層活動可以提示焦慮狀態的發生。
腦網絡是研究大腦功能的重要手段之一。研究人員在大腦解剖學的基礎上，借助腦網絡可以研究大腦中不同神經元、神經元群體及腦區之間的動態活動，從網絡的角度研究大腦的認知功能和機制。腦網絡的構建主要是基于宏觀尺度的腦電（electroencephalogram，EEG）、腦磁（magnetoencephalography，MEG）、功能核磁共振（functional magnetic resonance imaging，fMRI）信號，以及微觀尺度的局部場電位（local filed potential，LFP）和鋒電位（spike）等。局部場電位和鋒電位是應用多通道微電極陣列技術獲取的兩種不同模態的神經信號。鋒電位是離散的點電位，從鋒電位中分離在記錄點附近的單個神經元發放可以獲得若干個神經元的動作電位（action potential，AP）。
前額葉皮層對于焦慮樣行為的調控十分重要。但是，前額葉皮層神經元活動的變化對焦慮樣行為會產生什么樣的影響，以及焦慮狀態下前額葉皮層腦網絡機制是怎樣的，目前尚不清楚。因此，本文以正常大鼠在高架十字迷宮的內側前額葉皮層動作電位為研究對象，基于極大似然估計（maximum likelihood estimation，MLE）因果分析方法，構建大鼠焦慮狀態動作電位的因果網絡，計算網絡連接強度，定量表征焦慮狀態動作電位因果網絡連接特性，并應用全局效率定量描述網絡信息傳遞效率[13-14]，以期為研究焦慮狀態前額葉皮層腦網絡機制提供支持。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
實驗動物為 8 只 SPF 級健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠（SD，中國軍事醫學科學院實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006），10～12 周齡，體重 300～350 g。實驗期間飼養于天津醫科大學動物實驗中心，飼養環境保持恒溫（24 ± 2）℃、恒濕 50% ± 5%，每天 12 h 晝夜交替照明（7 點和 19 點），食物與水自由獲取。對大鼠進行分籠飼養（2～3 只/籠）。本實驗符合實驗動物的倫理學要求，通過天津醫科大學動物倫理委員會核準。
1.1.2 高架十字迷宮
高架十字迷宮（上海基爾頓生物科技有限公司，中國）包括兩個開放臂（open arm）、兩個封閉臂（closed arm）及一個連接四臂的中央區域（central platform），開放臂規格為長 50 cm × 寬 10 cm，封閉臂規格為長 50 cm × 寬 10 cm × 高 40 cm，中央區域規格為 10 cm × 10 cm。高架十字迷宮放置于 50 cm 高底座上，迷宮的四個臂相互垂直成十字狀。大鼠高架十字迷宮及行為學記錄分析系統（Noldus 公司，荷蘭）如圖 1a 所示。大鼠焦慮狀態任務為其離開封閉臂并進入開放臂的過程，共 10 s，分別包括離開封閉臂前的 5 s 和進入開放臂后的 5 s。如圖 1b 所示，灰色曲線為大鼠運動軌跡路線，黑色部分表示高架十字迷宮的封閉臂，紅色部分表示迷宮的開放臂，紫紅色箭頭表示行為學參考點（reference point，RP）位置，黑色箭頭表示大鼠從封閉臂走向開放臂的焦慮狀態過程。
圖1
大鼠高架十字迷宮焦慮狀態任務行為學示意圖
a. 行為學記錄分析系統；b. 焦慮狀態任務
Figure1. Behavioristics in the elevated plus maze during anxietya. behavioral record and analysis system; b. the anxiety task
本文記錄大鼠在高架十字迷宮行為學指標包括：進入開放臂次數（open arm entry，OE）；進入封閉臂次數（closed arm entry，CE）；進入開放臂時間（open arm time，OT）；進入封閉臂時間（closed arm time，CT）；大鼠在開放臂停留時間占總時間比例（OT%）。大鼠進入開放臂或封閉臂以四肢完全進入該區域為準，統計時間單位為 s。
1.2 方法
1.2.1 在體植入微電極陣列
本文采用實驗室自制的 16 通道在體植入式微電極陣列，通過植入手術將其植入大鼠內側前額葉皮層。
微電極陣列組成部分：直徑為 33 μm 的鎳鎘合金絲（California Fine Wire 公司，美國），表面有一層 Formavor 材料的絕緣層；印刷電路板（深圳捷多邦公司，中國），厚度為 200 μm，表面有焊盤，可將電極絲的一端焊接在焊盤上，為微電極陣列提供機械支持和電氣連接，焊盤寬度為 100 μm，間距為 300 μm；高密度微型連接器（上海回峰電子科技有限公司，中國），可以傳導電極絲采集到的神經電信號。制備完成的 16 通道在體植入式微電極陣列如圖 2 所示。
圖2
16 通道在體植入式微電極陣列示意圖
Figure2.
16-channel in vivo implantable microelectrode array
1.2.2 多通道微電極陣列的植入
為獲取大鼠內側前額葉皮層動作電位，在大鼠內側前額葉皮層在體植入 16 通道微電極陣列（本實驗室自制）。手術前使用戊巴比妥鈉（Sigma 公司，美國）按照 40 mg/kg 的劑量進行深度麻醉。大鼠固定于腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司，中國）上，使用碘伏和 75% 酒精對大鼠頭皮消毒后，沿顱骨矢狀縫方向剪開皮膚。以前囟點為參考參照大鼠立體定位腦圖譜[15]找到內側前額葉皮層腦區對應的區域（前囟前 2.5～4.5 mm，旁開 0.1～1.1 mm，深度 2.5～3.0 mm）。使用電動顱骨鉆（Foredom 公司，美國）在目標腦區的顱骨四周上開一個矩形窗口，剝離硬腦膜，盡量避免損傷腦組織。顱骨上安置螺釘來進行固定。電極垂直植入目標腦區，使用造牙粉（上海新世紀齒科材料有限公司，中國）將螺釘、顱骨組織以及電極固定在一起，形成整體。待大鼠完全清醒后單籠飼養。大鼠術后恢復期間實驗人員每天撫摸大鼠 15 min，使大鼠盡快熟悉實驗人員，減少實驗干擾。圖 3 為實驗后電極組織學檢驗得到的電極植入位置與腦圖譜對比示意圖。圖中可以看出電極植入位置在大鼠內側前額葉前邊緣皮層（prelimbic cortex，PrL）區域。
圖3
電極植入位置與腦圖譜對比示意圖
Figure3.
Histological verification of the recording sites in mPFC
1.2.3 動作電位的獲取
原始信號由鋒電位和局部場電位兩種不同模態的神經信號組成。鋒電位是電極尖端記錄到多個神經元發放的動作電位總和，局部場電位是電極記錄到的神經元突觸后電位總和。圖 4a 是從一個通道的原始信號中獲取神經元動作電位的示意圖。原始信號通過 < 500 Hz 低通濾波、2 kHz 采樣得到 LFP。原始信號經過 > 500 Hz 高通濾波、30 kHz 采樣后，所得信號再經過閾值檢測，即信號幅值超過預先設定的閾值的位置時，則被識別為一個動作電位，由此得到多神經元動作電位構成的鋒電位。使用 OmniPlexon 神經信號采集系統（Plexon 公司，美國）在線記錄信號，如圖 4b 所示，16 個窗口（編號為 1～16）分別對應電極的 16 個通道，其顯示的信號為鋒電位，若電極的某一通道損壞則關閉該通道對應的采集窗口，以保證所記錄信號的可用性；單只大鼠電極植入手術結束后首次進行高架十字迷宮實驗時，根據所采集鋒電位的特征對每一通道設定模板，符合該模板的信號被錄入并以一類顏色表示，即記錄到一個神經元發放的動作電位。之后將模板保存并記錄該只大鼠的編號，后續實驗中應保證所測每只大鼠的鋒電位信號與其對應的模板一致，即單個通道的神經元個數不變，且所測動作電位波形符合模板，無其他動作電位波形（非模板動作電位波形）出現，由此確定記錄電極位置不變，實驗所記錄數據為有效，否則，淘汰該只大鼠。使用 Offline Sorter 神經信號分類軟件（Plexon 公司，美國）中聚類的方法，去除干擾，將單一神經元的動作電位分離出來，獲取若干個神經元發放的動作電位。Offline Sorter 軟件在對每一通道的鋒電位進行分類時，主要根據信號的主成分（principal component，PC）、能量（energy）、峰值（peak）等進行分類[16]，圖 4c 為使用 Offline Sorter 神經信號分類軟件對一例單通道鋒電位進行分類的示意圖，可見該通道中存在兩個神經元發放的動作電位。
圖4
鋒電位信號及鋒電位分類示意圖
a. 從一個通道原始信號中獲取神經元動作電位；b. 使用 OmniPlexon 神經信號采集系統在線記錄信號；c. 使用 Offline Sorter 軟件進行鋒電位分類
Figure4. Examples of spikes and spike sortinga. neuron action potentials obtained from original signal in one channel; b. online signal recording by using OmniPlexon neural signal acquisition system; c. spike sorting by using Offline Sorter
1.2.4 神經元集群頻率編碼
神經元集群頻率編碼定義為神經元在時間窗內的平均發放率[17]。設定移動的窗口，該窗口內平均發放頻率增大的神經元構成一個神經元集群，逐個計算窗口內神經元集群的發放頻率，可得到神經元發放頻率的時空分布圖，用于表達神經元集群的動態特征。圖 5 為一例大鼠一次實驗內側前額葉皮層神經元集群頻率編碼，橫軸為時間，縱軸為神經元編號，紫紅色直線為行為學參考點。圖 5a 為大鼠一次實驗 12 個神經元的動作電位時空序列。圖 5b 是大鼠一次實驗 12 個神經元發放率的時空分布圖，右側顏色條為發放率標尺。
圖5
內側前額葉皮層神經元集群頻率編碼示意圖
a. 12 個神經元的動作電位時空序列；b. 12 個神經元發放率的時空分布圖
Figure5. Example of rate coding of neural assembly in mPFCa. temporal and spatial sequence of action potential of 12 neurons; b. temporal and spatial distribution of firing rate of 12 neurons
1.2.5 動作電位因果網絡分析方法
應用極大似然估計因果分析方法[18-19]，構建動作電位的因果網絡。神經元的動作電位時空序列是一個離散的點電位，基于廣義線性模型（generalized linear model，GLM）的極大似然估計，可有效計算離散點序列之間的因果網絡[20]。
神經元動作電位可以通過 0-1 分布來表達，把動作電位時空序列分成等長單位時間段，該時間段里有發放則是 1，沒有發放便是 0。這兩種狀態可以完整概括動作電位在時間上的分布。在單位時間內按照 0-1 分布的神經元動作電位時空序列適用于廣義線性模型。使用極大似然估計的方法對離散數據進行因果分析，基于動作電位的時空序列進行建模，詳細步驟如下。
設定神經元i的動作電位時間序列變化過程可以用條件密度函數（conditional intensity function，CIF）表示：
 |
其中Ni（t）表示神經元 i 動作電位在（0，t］時間段內的發放個數，t 屬于時間范圍（0，T］，本文中 T 設為 500 ms。Hi（t）表示在時間間隔 ［t－MiW，t），在一個固定窗口寬度W、Mi個互不重疊的矩形窗內，神經元 i 在時間 t 以前所有神經元的已發放歷史，Pr 設為概率函數。CIF 表示神經元 i 基于所有神經元已發放歷史的前提條件下，在 t 時刻產生一次發放的概率。在時間間隔 ［t，t+Δ），神經元產生一個動作電位的概率可以近似表示為λ（t|Hi（t））Δ。神經元產生基于廣義線性模型建立 CIF 的對數函數：
 |
γi為參數向量，表示為：
 |
其中γi，0表示神經元 i 發放活動的基礎水平，γi，q，m 表示全部神經元的已發放歷史Rq，m（t）在時間［t ? mW，t ?（m ? 1）W）對神經元 i 動作電位發放概率的影響（
）。參數向量 γi 表示所有神經元已發放歷史對神經元 i 動作電位發放產生的影響。本文中 W = 2 ms，使用多個已發放歷史區間 MiW 可擬合多個模型，通過赤池信息量準則（Akaike’s information criterion，AIC）選取最佳擬合模型，確定 Mi。
計算每個神經元動作電位時空序列的似然函數。由于動作電位時空序列是離散點電位，因此將動作電位的時間間隔（0，T］ 離散區分為 K 個小的時間間隔，時刻 t 轉換至其當前所在的區間 k。使用似然函數計算各神經元之間的因果連接，神經元 i 發放的動作電位使用似然函數 Li（γi）表示為以下形式：
 |
如果神經元 i 在時間間隔（tk ? 1，tk］中有動作電位的發放，則 ΔNi［k］值為 1；沒有動作電位發放，其值為 0。
表示神經元 i 在時間間隔（tk ? 1，tk］出現兩次及兩次以上動作電位發放的概率。K 的取值決定 Δ，需要使 Δ 盡量趨近于 1 ms。本文中K = 500。
其他神經元已發放歷史對神經元 i 會造成影響，排除神經元 j 對 i 造成的影響后，重新構建模型計算得到似然函數 Li（γij），因此神經元 j 對 i 的相對因果連接值可表示為：
 |
式中 
表示為從 γi 模型排除神經元 j 對 i 的影響后構建的新模型。Γij 表示神經元 j 到 i 因果連接的估計值。計算得到的估計值需要經過統計學處理剔除錯誤值。使用基于 95% 置信水平的卡方擬合優度檢驗方法（Chi-square goodness of fit test，GOF），經過檢驗后錯誤估計值置零，認為該因果連接無效，滿足檢驗條件的 Γij 保留，定義檢驗有效的因果連接值為 CCij（causal connectivity）。
對于一個神經元集群，計算任意兩個神經元之間的因果連接值CCij，組成神經元集群的因果連接矩陣，可以表示為：
 |
其中，N為因果連接矩陣中神經元個數，矩陣中對角線的零值表示任意神經元的自身因果連接為零。
一個網絡是由若干節點以及連接它們之間的邊構成的，本文基于CC矩陣來構建神經元動作電位因果網絡。
計算動作電位因果網絡的CC連接矩陣的平均 CC：
 |
式中，CCij 表示從神經元 j 到神經元 i 的因果連接強度，N 表示因果網絡中節點的個數。平均 CC 可以定量描述神經元動作電位因果網絡整體的因果連接強度。CC 值越大，神經元動作電位因果網絡的平均因果連接強度越大。
1.2.6 網絡全局效率
以神經元為節點、神經元間的因果連接為邊構建因果連接矩陣，神經元 i 和 j 之間的因果連接強度 CCij 的倒數定義為節點 j 到 i 的路徑長度 Lij，其公式為：
 |
全局效率（global efficiency，Eglob）是衡量信息在網絡中傳遞快慢的綜合指標[21]。全局效率越高，則網絡中各節點之間信息傳遞的速率就越快。定義為網絡中任意節點 i、j 之間最短路徑長度的倒數。最短路徑的計算是在因果網絡連通圖中進行，不存在的節點之間的最短路徑長度為無窮大。全局效率的計算公式如下：
 |
其中 dij 表示節點 i 和 j 之間的最短路徑長度（dij∈Lij）。
1.2.7 統計學方法
所有結果以平均值 ± 標準差形式表示。利用 SPSS 22.0 軟件（IBM 公司，美國）進行統計，使用 t 檢驗方法進行統計學分析。P 值 < 0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
本文記錄 8 只大鼠共 166 試次的實驗數據，每只大鼠在實驗中，從內側前額葉皮層鋒電位分類后獲得的神經元個數保持不變，且所測動作電位波形符合模板，無其他動作電位波形（非模板動作電位波形）出現，由此確定記錄電極位置不變，實驗所記錄數據為有效。8 只大鼠分別獲得其內側前額葉皮層 12、15、16、15、19、14、18 和 12 個神經元動作電位。
2.1 大鼠高架十字迷宮行為學結果
8 只大鼠在高架十字迷宮的行為學結果見圖 6。圖 6a 為大鼠進入高架十字迷宮開放臂和封閉臂的次數統計結果，進入封閉臂的次數為（44.13 ± 6.99）次，進入開放臂的次數為（16.50 ± 3.25）次，明顯低于封閉臂（P < 0.001）。圖 6b 為大鼠在高架十字迷宮開放臂和封閉臂的停留時間統計結果，在封閉臂停留時間為（439.76 ± 50.43）s，在開放臂停留時間為（160.23 ± 48.22）s，開放臂停留時間明顯低于封閉臂（P < 0.001）。行為學結果表明大鼠在高架十字迷宮中表現為正常的焦慮水平。
圖6
大鼠高架十字迷宮行為學結果
a. 進入次數；b.停留時間。***
a. entries; b. residence period. ***
2.2 焦慮狀態神經元集群頻率編碼
本文選擇時間窗口窗寬為 500 ms，移動步長為 125 ms[22]，移動逐步計算窗內神經元發放頻率，分析焦慮狀態與神經元集群發放的關系。圖 7a 為 8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層神經元集群頻率編碼圖。橫軸為時間，縱軸為神經元編號，右側顏色條為動作電位發放率標尺，紫紅色直線表示高架十字迷宮行為學參考點（高架十字迷宮中大鼠四肢完全離開封閉臂的時刻 RP）。可以看出大鼠在焦慮狀態任務時，封閉臂內神經元集群的發放多于開放臂。圖 7b 為 8 只大鼠焦慮狀態任務內側前額葉皮層神經元集群動作電位發放率時間變化曲線，圖中橫軸為時間，縱軸為動作電位發放率，紫紅色實線為行為學參考點（RP），藍色虛線為發放率最高點，紅色陰影區域代表標準差。可見大鼠在封閉臂中內側前額葉皮層神經元集群發放率增加，在開放臂內下降。
圖7
8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層神經元集群頻率編碼
a. 頻率編碼圖；b. 發放率隨時間變化曲線
Figure7. Rate coding of neural assembly in mPFC of 8 rats during anxietya. rate coding map; b. dynamic curve of firing rate
8 只大鼠焦慮狀態任務過程中內側前額葉皮層神經元集群動作電位平均發放率如圖 8 所示。圖 8a 為動作電位平均發放率隨時間變化的曲線，圖中藍色虛線指示曲線峰值出現的時刻，紅色陰影區域代表標準差，紫紅色實線表示高架十字迷宮行為學參考點 RP。圖 8b 為封閉臂和開放臂神經元集群動作電位平均發放率統計結果。可見在正常大鼠從高架十字迷宮封閉臂走向開放臂的焦慮狀態過程中，平均發放率在封閉臂內增加，在行為學參考點 RP 前達到峰值，進入開放臂后降低。焦慮狀態封閉臂的神經元集群動作電位平均發放率為 3.389 5 ± 0.696 3，開放臂的平均發放率為 2.746 2 ± 0.570 3，前者顯著高于后者（P < 0.001）。
圖8
8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層神經元集群動作電位平均發放率
a. 平均發放率隨時間變化曲線；b. 平均發放率統計結果。***
a. dynamic curve of average firing rate; b. statistics of average firing rate. ***
2.3 焦慮狀態動作電位因果網絡連接強度
本文選擇時間窗口窗寬為 500 ms，移動步長為 125 ms。步長為窗寬的 1/4，進行窗口滑動，彌補了在一個固定的窗口中進行因果網絡分析動態信息的局限，可以描述動作電位因果網絡隨時間的變化。
8 只大鼠焦慮狀態任務過程中內側前額葉皮層動作電位因果網絡的連接強度如圖 9 所示。圖 9a 為網絡連接強度隨時間變化的曲線，藍色虛線指示曲線峰值出現的時刻，紅色陰影區域代表標準差，紫紅色實線表示高架十字迷宮行為學參考點 RP。圖 9b 為封閉臂和開放臂動作電位因果網絡平均連接強度統計結果。可見在正常大鼠從高架十字迷宮封閉臂走向開放臂的焦慮狀態過程中，平均連接強度在封閉臂內增加，在行為學參考點 RP 前達到峰值，進入開放臂后降低。焦慮狀態封閉臂的動作電位網絡連接強度為 0.017 3 ± 0.003 6，開放臂的網絡連接強度為 0.010 4 ± 0.003 2，前者顯著高于后者（P < 0.01）。
圖9
8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層動作電位因果網絡平均連接強度
a. 平均連接強度隨時間變化曲線；b. 平均連接強度統計結果。**
a. dynamic curve of average connectivity strength; b. statistics of average connectivity strength. **
2.4 焦慮狀態動作電位因果網絡全局效率
8 只大鼠焦慮狀態任務過程中內側前額葉皮層動作電位因果網絡平均全局效率如圖 10 所示。圖 10a 為全局效率的時間變化曲線，藍色虛線指示曲線峰值出現的時刻，紅色陰影區域代表標準差，紫紅色實線表示高架十字迷宮行為學參考點 RP。圖 10b 為封閉臂和開放臂動作電位因果網絡平均全局效率統計結果。正常大鼠在從高架十字迷宮封閉臂走向開放臂的過程中，動作電位因果網絡平均全局效率在封閉臂內增加，在行為學參考點 RP 前達到峰值，進入開放臂后降低；焦慮狀態封閉臂的全局效率為 0.044 2 ± 0.012 8，開放臂的全局效率為 0.034 8 ± 0.011 4，前者明顯高于后者（P < 0.001）。
圖10
8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層動作電位因果網絡平均全局效率
a.平均全局效率隨時間變化曲線；b.平均全局效率統計結果。***
a. dynamic curve of average global efficiency; b. statistics of average global efficiency. ***
3 討論
本文研究結果表明內側前額葉皮層動作電位因果網絡連接強度及全局效率在封閉臂內較高，在開放臂內較低，從封閉臂走向開放臂過程中網絡連接強度與全局效率減弱。大鼠在高架十字迷宮焦慮狀態中內側前額葉皮層神經元活動的變化先于行為學變化，提示內側前額葉皮層動作電位因果網絡連接強度和信息傳輸效率減弱與焦慮狀態有關。
神經電信號由鋒電位和局部場電位組成，本文使用的動作電位由鋒電位提取得到。Adhikari 等[23]研究發現，小鼠內側前額葉皮層中神經元發放的變化優先于其離開封閉臂，提示焦慮狀態時內側前額葉皮層的神經元活動可能在調控焦慮樣行為中起著主導地位。本文的結果顯示，大鼠在高架十字迷宮探索時，內側前額葉皮層中動作電位因果網絡連接強度和全局效率曲線變化均發生在大鼠離開封閉臂之前，同時曲線峰值均出現在行為學參考點之前，提示大鼠內側前額葉動作電位因果網絡在焦慮狀態過程中參與調控焦慮樣行為。Lu 等[24]發現正常大鼠焦慮狀態前額葉皮層局部場電位特征頻段為 theta 頻段（4～12 Hz），而且 theta 頻段局部場電位的能量、網絡連接強度及全局效率均減弱。本文以動作電位作為研究對象得到的結果與局部場電位變化趨勢一致，提示這兩種不同模態的神經信號都參與了焦慮樣行為。后續研究可將局部場電位和鋒電位組合構成數據對，研究二者模態信號的協同編碼機制。
焦慮情緒相關的腦區不僅局限于前額葉皮層，海馬和杏仁核等腦區同樣與焦慮有密切的聯系。Padilla-Coreano 等[25]研究表明，與焦慮相關的腦神經活動需要內側前額葉皮層、海馬和杏仁核的共同參與。焦慮神經環路中的信息傳遞，包含激活和抑制等調控行為[26-27]。在今后的研究中利用神經電生理和光遺傳技術可以將海馬或杏仁核等作為研究對象，從腦網絡信息傳遞的角度進一步探索焦慮的機制。
綜上所述，在焦慮狀態下前額葉皮層的腦網絡存在特征性，這對焦慮癥的診斷和治療具有重要的參考意義，也為焦慮癥發病機制的研究提供了幫助。進一步地，利用網絡參數可以幫助我們獲得關于大腦結構網絡與功能的認知和理解，為焦慮癥的早期診斷和治療提供重要依據，并為焦慮癥發病機制的研究提供創新的思路和技術。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
焦慮癥是常見的情緒障礙類疾病，嚴重影響著患者的正常生活并危害其身心健康[1-2]。臨床研究將焦慮定義為一種長期的特征，表現為不確定條件下會出現非適應性的過度警惕和對潛在威脅的高估[3-4]。焦慮作為對威脅、心理應激的反應，是正常且重要的生存本能，但是當焦慮在錯誤的時間頻繁或持續地劇烈發生，對正常生活造成影響時，這種異常的焦慮情緒體驗即是焦慮癥。
高架十字迷宮（elevated plus maze，EPM）實驗由 Pellow 等于 1985 年提出，是研究嚙齒類動物焦慮水平的重要行為學范式[5-6]。高架十字迷宮主要利用了嚙齒類動物對新奇環境探索欲望和對高懸敞開環境恐懼這二者形成的矛盾沖突來考察其焦慮的程度[7]。
已有的研究表明，前額葉皮層（prefrontal cortex，PFC）是焦慮情緒的重要責任腦區[8-9]。大鼠的前額葉皮層分為不同的區域，其中內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex，mPFC）在焦慮神經回路中扮演重要的角色[10]。Stern 等[11]對大鼠內側前額葉皮層注入鈷，使該區域暫時失活，發現內側前額葉皮層失活后的大鼠在高架十字迷宮中增加了對開放臂的探索。Park 等[12]發現焦慮會抑制大鼠前額葉皮層的神經元自發活動，表明異常的內側前額葉皮層活動可以提示焦慮狀態的發生。
腦網絡是研究大腦功能的重要手段之一。研究人員在大腦解剖學的基礎上，借助腦網絡可以研究大腦中不同神經元、神經元群體及腦區之間的動態活動，從網絡的角度研究大腦的認知功能和機制。腦網絡的構建主要是基于宏觀尺度的腦電（electroencephalogram，EEG）、腦磁（magnetoencephalography，MEG）、功能核磁共振（functional magnetic resonance imaging，fMRI）信號，以及微觀尺度的局部場電位（local filed potential，LFP）和鋒電位（spike）等。局部場電位和鋒電位是應用多通道微電極陣列技術獲取的兩種不同模態的神經信號。鋒電位是離散的點電位，從鋒電位中分離在記錄點附近的單個神經元發放可以獲得若干個神經元的動作電位（action potential，AP）。
前額葉皮層對于焦慮樣行為的調控十分重要。但是，前額葉皮層神經元活動的變化對焦慮樣行為會產生什么樣的影響，以及焦慮狀態下前額葉皮層腦網絡機制是怎樣的，目前尚不清楚。因此，本文以正常大鼠在高架十字迷宮的內側前額葉皮層動作電位為研究對象，基于極大似然估計（maximum likelihood estimation，MLE）因果分析方法，構建大鼠焦慮狀態動作電位的因果網絡，計算網絡連接強度，定量表征焦慮狀態動作電位因果網絡連接特性，并應用全局效率定量描述網絡信息傳遞效率[13-14]，以期為研究焦慮狀態前額葉皮層腦網絡機制提供支持。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物
實驗動物為 8 只 SPF 級健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠（SD，中國軍事醫學科學院實驗動物中心，實驗動物許可證號：SCXK（京）2016-0006），10～12 周齡，體重 300～350 g。實驗期間飼養于天津醫科大學動物實驗中心，飼養環境保持恒溫（24 ± 2）℃、恒濕 50% ± 5%，每天 12 h 晝夜交替照明（7 點和 19 點），食物與水自由獲取。對大鼠進行分籠飼養（2～3 只/籠）。本實驗符合實驗動物的倫理學要求，通過天津醫科大學動物倫理委員會核準。
1.1.2 高架十字迷宮
高架十字迷宮（上海基爾頓生物科技有限公司，中國）包括兩個開放臂（open arm）、兩個封閉臂（closed arm）及一個連接四臂的中央區域（central platform），開放臂規格為長 50 cm × 寬 10 cm，封閉臂規格為長 50 cm × 寬 10 cm × 高 40 cm，中央區域規格為 10 cm × 10 cm。高架十字迷宮放置于 50 cm 高底座上，迷宮的四個臂相互垂直成十字狀。大鼠高架十字迷宮及行為學記錄分析系統（Noldus 公司，荷蘭）如圖 1a 所示。大鼠焦慮狀態任務為其離開封閉臂并進入開放臂的過程，共 10 s，分別包括離開封閉臂前的 5 s 和進入開放臂后的 5 s。如圖 1b 所示，灰色曲線為大鼠運動軌跡路線，黑色部分表示高架十字迷宮的封閉臂，紅色部分表示迷宮的開放臂，紫紅色箭頭表示行為學參考點（reference point，RP）位置，黑色箭頭表示大鼠從封閉臂走向開放臂的焦慮狀態過程。
圖1
大鼠高架十字迷宮焦慮狀態任務行為學示意圖
a. 行為學記錄分析系統；b. 焦慮狀態任務
Figure1. Behavioristics in the elevated plus maze during anxietya. behavioral record and analysis system; b. the anxiety task
本文記錄大鼠在高架十字迷宮行為學指標包括：進入開放臂次數（open arm entry，OE）；進入封閉臂次數（closed arm entry，CE）；進入開放臂時間（open arm time，OT）；進入封閉臂時間（closed arm time，CT）；大鼠在開放臂停留時間占總時間比例（OT%）。大鼠進入開放臂或封閉臂以四肢完全進入該區域為準，統計時間單位為 s。
1.2 方法
1.2.1 在體植入微電極陣列
本文采用實驗室自制的 16 通道在體植入式微電極陣列，通過植入手術將其植入大鼠內側前額葉皮層。
微電極陣列組成部分：直徑為 33 μm 的鎳鎘合金絲（California Fine Wire 公司，美國），表面有一層 Formavor 材料的絕緣層；印刷電路板（深圳捷多邦公司，中國），厚度為 200 μm，表面有焊盤，可將電極絲的一端焊接在焊盤上，為微電極陣列提供機械支持和電氣連接，焊盤寬度為 100 μm，間距為 300 μm；高密度微型連接器（上海回峰電子科技有限公司，中國），可以傳導電極絲采集到的神經電信號。制備完成的 16 通道在體植入式微電極陣列如圖 2 所示。
圖2
16 通道在體植入式微電極陣列示意圖
Figure2.
16-channel in vivo implantable microelectrode array
1.2.2 多通道微電極陣列的植入
為獲取大鼠內側前額葉皮層動作電位，在大鼠內側前額葉皮層在體植入 16 通道微電極陣列（本實驗室自制）。手術前使用戊巴比妥鈉（Sigma 公司，美國）按照 40 mg/kg 的劑量進行深度麻醉。大鼠固定于腦立體定位儀（深圳瑞沃德生命科技有限公司，中國）上，使用碘伏和 75% 酒精對大鼠頭皮消毒后，沿顱骨矢狀縫方向剪開皮膚。以前囟點為參考參照大鼠立體定位腦圖譜[15]找到內側前額葉皮層腦區對應的區域（前囟前 2.5～4.5 mm，旁開 0.1～1.1 mm，深度 2.5～3.0 mm）。使用電動顱骨鉆（Foredom 公司，美國）在目標腦區的顱骨四周上開一個矩形窗口，剝離硬腦膜，盡量避免損傷腦組織。顱骨上安置螺釘來進行固定。電極垂直植入目標腦區，使用造牙粉（上海新世紀齒科材料有限公司，中國）將螺釘、顱骨組織以及電極固定在一起，形成整體。待大鼠完全清醒后單籠飼養。大鼠術后恢復期間實驗人員每天撫摸大鼠 15 min，使大鼠盡快熟悉實驗人員，減少實驗干擾。圖 3 為實驗后電極組織學檢驗得到的電極植入位置與腦圖譜對比示意圖。圖中可以看出電極植入位置在大鼠內側前額葉前邊緣皮層（prelimbic cortex，PrL）區域。
圖3
電極植入位置與腦圖譜對比示意圖
Figure3.
Histological verification of the recording sites in mPFC
1.2.3 動作電位的獲取
原始信號由鋒電位和局部場電位兩種不同模態的神經信號組成。鋒電位是電極尖端記錄到多個神經元發放的動作電位總和，局部場電位是電極記錄到的神經元突觸后電位總和。圖 4a 是從一個通道的原始信號中獲取神經元動作電位的示意圖。原始信號通過 < 500 Hz 低通濾波、2 kHz 采樣得到 LFP。原始信號經過 > 500 Hz 高通濾波、30 kHz 采樣后，所得信號再經過閾值檢測，即信號幅值超過預先設定的閾值的位置時，則被識別為一個動作電位，由此得到多神經元動作電位構成的鋒電位。使用 OmniPlexon 神經信號采集系統（Plexon 公司，美國）在線記錄信號，如圖 4b 所示，16 個窗口（編號為 1～16）分別對應電極的 16 個通道，其顯示的信號為鋒電位，若電極的某一通道損壞則關閉該通道對應的采集窗口，以保證所記錄信號的可用性；單只大鼠電極植入手術結束后首次進行高架十字迷宮實驗時，根據所采集鋒電位的特征對每一通道設定模板，符合該模板的信號被錄入并以一類顏色表示，即記錄到一個神經元發放的動作電位。之后將模板保存并記錄該只大鼠的編號，后續實驗中應保證所測每只大鼠的鋒電位信號與其對應的模板一致，即單個通道的神經元個數不變，且所測動作電位波形符合模板，無其他動作電位波形（非模板動作電位波形）出現，由此確定記錄電極位置不變，實驗所記錄數據為有效，否則，淘汰該只大鼠。使用 Offline Sorter 神經信號分類軟件（Plexon 公司，美國）中聚類的方法，去除干擾，將單一神經元的動作電位分離出來，獲取若干個神經元發放的動作電位。Offline Sorter 軟件在對每一通道的鋒電位進行分類時，主要根據信號的主成分（principal component，PC）、能量（energy）、峰值（peak）等進行分類[16]，圖 4c 為使用 Offline Sorter 神經信號分類軟件對一例單通道鋒電位進行分類的示意圖，可見該通道中存在兩個神經元發放的動作電位。
圖4
鋒電位信號及鋒電位分類示意圖
a. 從一個通道原始信號中獲取神經元動作電位；b. 使用 OmniPlexon 神經信號采集系統在線記錄信號；c. 使用 Offline Sorter 軟件進行鋒電位分類
Figure4. Examples of spikes and spike sortinga. neuron action potentials obtained from original signal in one channel; b. online signal recording by using OmniPlexon neural signal acquisition system; c. spike sorting by using Offline Sorter
1.2.4 神經元集群頻率編碼
神經元集群頻率編碼定義為神經元在時間窗內的平均發放率[17]。設定移動的窗口，該窗口內平均發放頻率增大的神經元構成一個神經元集群，逐個計算窗口內神經元集群的發放頻率，可得到神經元發放頻率的時空分布圖，用于表達神經元集群的動態特征。圖 5 為一例大鼠一次實驗內側前額葉皮層神經元集群頻率編碼，橫軸為時間，縱軸為神經元編號，紫紅色直線為行為學參考點。圖 5a 為大鼠一次實驗 12 個神經元的動作電位時空序列。圖 5b 是大鼠一次實驗 12 個神經元發放率的時空分布圖，右側顏色條為發放率標尺。
圖5
內側前額葉皮層神經元集群頻率編碼示意圖
a. 12 個神經元的動作電位時空序列；b. 12 個神經元發放率的時空分布圖
Figure5. Example of rate coding of neural assembly in mPFCa. temporal and spatial sequence of action potential of 12 neurons; b. temporal and spatial distribution of firing rate of 12 neurons
1.2.5 動作電位因果網絡分析方法
應用極大似然估計因果分析方法[18-19]，構建動作電位的因果網絡。神經元的動作電位時空序列是一個離散的點電位，基于廣義線性模型（generalized linear model，GLM）的極大似然估計，可有效計算離散點序列之間的因果網絡[20]。
神經元動作電位可以通過 0-1 分布來表達，把動作電位時空序列分成等長單位時間段，該時間段里有發放則是 1，沒有發放便是 0。這兩種狀態可以完整概括動作電位在時間上的分布。在單位時間內按照 0-1 分布的神經元動作電位時空序列適用于廣義線性模型。使用極大似然估計的方法對離散數據進行因果分析，基于動作電位的時空序列進行建模，詳細步驟如下。
設定神經元i的動作電位時間序列變化過程可以用條件密度函數（conditional intensity function，CIF）表示：
|
其中Ni（t）表示神經元 i 動作電位在（0，t］時間段內的發放個數，t 屬于時間范圍（0，T］，本文中 T 設為 500 ms。Hi（t）表示在時間間隔 ［t－MiW，t），在一個固定窗口寬度W、Mi個互不重疊的矩形窗內，神經元 i 在時間 t 以前所有神經元的已發放歷史，Pr 設為概率函數。CIF 表示神經元 i 基于所有神經元已發放歷史的前提條件下，在 t 時刻產生一次發放的概率。在時間間隔 ［t，t+Δ），神經元產生一個動作電位的概率可以近似表示為λ（t|Hi（t））Δ。神經元產生基于廣義線性模型建立 CIF 的對數函數：
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γi為參數向量，表示為：
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其中γi，0表示神經元 i 發放活動的基礎水平，γi，q，m 表示全部神經元的已發放歷史Rq，m（t）在時間［t ? mW，t ?（m ? 1）W）對神經元 i 動作電位發放概率的影響（）。參數向量 γi 表示所有神經元已發放歷史對神經元 i 動作電位發放產生的影響。本文中 W = 2 ms，使用多個已發放歷史區間 MiW 可擬合多個模型，通過赤池信息量準則（Akaike’s information criterion，AIC）選取最佳擬合模型，確定 Mi。
計算每個神經元動作電位時空序列的似然函數。由于動作電位時空序列是離散點電位，因此將動作電位的時間間隔（0，T］ 離散區分為 K 個小的時間間隔，時刻 t 轉換至其當前所在的區間 k。使用似然函數計算各神經元之間的因果連接，神經元 i 發放的動作電位使用似然函數 Li（γi）表示為以下形式：
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如果神經元 i 在時間間隔（tk ? 1，tk］中有動作電位的發放，則 ΔNi［k］值為 1；沒有動作電位發放，其值為 0。 表示神經元 i 在時間間隔（tk ? 1，tk］出現兩次及兩次以上動作電位發放的概率。K 的取值決定 Δ，需要使 Δ 盡量趨近于 1 ms。本文中K = 500。
其他神經元已發放歷史對神經元 i 會造成影響，排除神經元 j 對 i 造成的影響后，重新構建模型計算得到似然函數 Li（γij），因此神經元 j 對 i 的相對因果連接值可表示為：
|
式中 表示為從 γi 模型排除神經元 j 對 i 的影響后構建的新模型。Γij 表示神經元 j 到 i 因果連接的估計值。計算得到的估計值需要經過統計學處理剔除錯誤值。使用基于 95% 置信水平的卡方擬合優度檢驗方法（Chi-square goodness of fit test，GOF），經過檢驗后錯誤估計值置零，認為該因果連接無效，滿足檢驗條件的 Γij 保留，定義檢驗有效的因果連接值為 CCij（causal connectivity）。
對于一個神經元集群，計算任意兩個神經元之間的因果連接值CCij，組成神經元集群的因果連接矩陣，可以表示為：
|
其中，N為因果連接矩陣中神經元個數，矩陣中對角線的零值表示任意神經元的自身因果連接為零。
一個網絡是由若干節點以及連接它們之間的邊構成的，本文基于CC矩陣來構建神經元動作電位因果網絡。
計算動作電位因果網絡的CC連接矩陣的平均 CC：
|
式中，CCij 表示從神經元 j 到神經元 i 的因果連接強度，N 表示因果網絡中節點的個數。平均 CC 可以定量描述神經元動作電位因果網絡整體的因果連接強度。CC 值越大，神經元動作電位因果網絡的平均因果連接強度越大。
1.2.6 網絡全局效率
以神經元為節點、神經元間的因果連接為邊構建因果連接矩陣，神經元 i 和 j 之間的因果連接強度 CCij 的倒數定義為節點 j 到 i 的路徑長度 Lij，其公式為：
|
全局效率（global efficiency，Eglob）是衡量信息在網絡中傳遞快慢的綜合指標[21]。全局效率越高，則網絡中各節點之間信息傳遞的速率就越快。定義為網絡中任意節點 i、j 之間最短路徑長度的倒數。最短路徑的計算是在因果網絡連通圖中進行，不存在的節點之間的最短路徑長度為無窮大。全局效率的計算公式如下：
|
其中 dij 表示節點 i 和 j 之間的最短路徑長度（dij∈Lij）。
1.2.7 統計學方法
所有結果以平均值 ± 標準差形式表示。利用 SPSS 22.0 軟件（IBM 公司，美國）進行統計，使用 t 檢驗方法進行統計學分析。P 值 < 0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
本文記錄 8 只大鼠共 166 試次的實驗數據，每只大鼠在實驗中，從內側前額葉皮層鋒電位分類后獲得的神經元個數保持不變，且所測動作電位波形符合模板，無其他動作電位波形（非模板動作電位波形）出現，由此確定記錄電極位置不變，實驗所記錄數據為有效。8 只大鼠分別獲得其內側前額葉皮層 12、15、16、15、19、14、18 和 12 個神經元動作電位。
2.1 大鼠高架十字迷宮行為學結果
8 只大鼠在高架十字迷宮的行為學結果見圖 6。圖 6a 為大鼠進入高架十字迷宮開放臂和封閉臂的次數統計結果，進入封閉臂的次數為（44.13 ± 6.99）次，進入開放臂的次數為（16.50 ± 3.25）次，明顯低于封閉臂（P < 0.001）。圖 6b 為大鼠在高架十字迷宮開放臂和封閉臂的停留時間統計結果，在封閉臂停留時間為（439.76 ± 50.43）s，在開放臂停留時間為（160.23 ± 48.22）s，開放臂停留時間明顯低于封閉臂（P < 0.001）。行為學結果表明大鼠在高架十字迷宮中表現為正常的焦慮水平。
圖6
大鼠高架十字迷宮行為學結果
a. 進入次數；b.停留時間。***
a. entries; b. residence period. ***
2.2 焦慮狀態神經元集群頻率編碼
本文選擇時間窗口窗寬為 500 ms，移動步長為 125 ms[22]，移動逐步計算窗內神經元發放頻率，分析焦慮狀態與神經元集群發放的關系。圖 7a 為 8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層神經元集群頻率編碼圖。橫軸為時間，縱軸為神經元編號，右側顏色條為動作電位發放率標尺，紫紅色直線表示高架十字迷宮行為學參考點（高架十字迷宮中大鼠四肢完全離開封閉臂的時刻 RP）。可以看出大鼠在焦慮狀態任務時，封閉臂內神經元集群的發放多于開放臂。圖 7b 為 8 只大鼠焦慮狀態任務內側前額葉皮層神經元集群動作電位發放率時間變化曲線，圖中橫軸為時間，縱軸為動作電位發放率，紫紅色實線為行為學參考點（RP），藍色虛線為發放率最高點，紅色陰影區域代表標準差。可見大鼠在封閉臂中內側前額葉皮層神經元集群發放率增加，在開放臂內下降。
圖7
8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層神經元集群頻率編碼
a. 頻率編碼圖；b. 發放率隨時間變化曲線
Figure7. Rate coding of neural assembly in mPFC of 8 rats during anxietya. rate coding map; b. dynamic curve of firing rate
8 只大鼠焦慮狀態任務過程中內側前額葉皮層神經元集群動作電位平均發放率如圖 8 所示。圖 8a 為動作電位平均發放率隨時間變化的曲線，圖中藍色虛線指示曲線峰值出現的時刻，紅色陰影區域代表標準差，紫紅色實線表示高架十字迷宮行為學參考點 RP。圖 8b 為封閉臂和開放臂神經元集群動作電位平均發放率統計結果。可見在正常大鼠從高架十字迷宮封閉臂走向開放臂的焦慮狀態過程中，平均發放率在封閉臂內增加，在行為學參考點 RP 前達到峰值，進入開放臂后降低。焦慮狀態封閉臂的神經元集群動作電位平均發放率為 3.389 5 ± 0.696 3，開放臂的平均發放率為 2.746 2 ± 0.570 3，前者顯著高于后者（P < 0.001）。
圖8
8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層神經元集群動作電位平均發放率
a. 平均發放率隨時間變化曲線；b. 平均發放率統計結果。***
a. dynamic curve of average firing rate; b. statistics of average firing rate. ***
2.3 焦慮狀態動作電位因果網絡連接強度
本文選擇時間窗口窗寬為 500 ms，移動步長為 125 ms。步長為窗寬的 1/4，進行窗口滑動，彌補了在一個固定的窗口中進行因果網絡分析動態信息的局限，可以描述動作電位因果網絡隨時間的變化。
8 只大鼠焦慮狀態任務過程中內側前額葉皮層動作電位因果網絡的連接強度如圖 9 所示。圖 9a 為網絡連接強度隨時間變化的曲線，藍色虛線指示曲線峰值出現的時刻，紅色陰影區域代表標準差，紫紅色實線表示高架十字迷宮行為學參考點 RP。圖 9b 為封閉臂和開放臂動作電位因果網絡平均連接強度統計結果。可見在正常大鼠從高架十字迷宮封閉臂走向開放臂的焦慮狀態過程中，平均連接強度在封閉臂內增加，在行為學參考點 RP 前達到峰值，進入開放臂后降低。焦慮狀態封閉臂的動作電位網絡連接強度為 0.017 3 ± 0.003 6，開放臂的網絡連接強度為 0.010 4 ± 0.003 2，前者顯著高于后者（P < 0.01）。
圖9
8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層動作電位因果網絡平均連接強度
a. 平均連接強度隨時間變化曲線；b. 平均連接強度統計結果。**
a. dynamic curve of average connectivity strength; b. statistics of average connectivity strength. **
2.4 焦慮狀態動作電位因果網絡全局效率
8 只大鼠焦慮狀態任務過程中內側前額葉皮層動作電位因果網絡平均全局效率如圖 10 所示。圖 10a 為全局效率的時間變化曲線，藍色虛線指示曲線峰值出現的時刻，紅色陰影區域代表標準差，紫紅色實線表示高架十字迷宮行為學參考點 RP。圖 10b 為封閉臂和開放臂動作電位因果網絡平均全局效率統計結果。正常大鼠在從高架十字迷宮封閉臂走向開放臂的過程中，動作電位因果網絡平均全局效率在封閉臂內增加，在行為學參考點 RP 前達到峰值，進入開放臂后降低；焦慮狀態封閉臂的全局效率為 0.044 2 ± 0.012 8，開放臂的全局效率為 0.034 8 ± 0.011 4，前者明顯高于后者（P < 0.001）。
圖10
8 只大鼠焦慮狀態內側前額葉皮層動作電位因果網絡平均全局效率
a.平均全局效率隨時間變化曲線；b.平均全局效率統計結果。***
a. dynamic curve of average global efficiency; b. statistics of average global efficiency. ***
3 討論
本文研究結果表明內側前額葉皮層動作電位因果網絡連接強度及全局效率在封閉臂內較高，在開放臂內較低，從封閉臂走向開放臂過程中網絡連接強度與全局效率減弱。大鼠在高架十字迷宮焦慮狀態中內側前額葉皮層神經元活動的變化先于行為學變化，提示內側前額葉皮層動作電位因果網絡連接強度和信息傳輸效率減弱與焦慮狀態有關。
神經電信號由鋒電位和局部場電位組成，本文使用的動作電位由鋒電位提取得到。Adhikari 等[23]研究發現，小鼠內側前額葉皮層中神經元發放的變化優先于其離開封閉臂，提示焦慮狀態時內側前額葉皮層的神經元活動可能在調控焦慮樣行為中起著主導地位。本文的結果顯示，大鼠在高架十字迷宮探索時，內側前額葉皮層中動作電位因果網絡連接強度和全局效率曲線變化均發生在大鼠離開封閉臂之前，同時曲線峰值均出現在行為學參考點之前，提示大鼠內側前額葉動作電位因果網絡在焦慮狀態過程中參與調控焦慮樣行為。Lu 等[24]發現正常大鼠焦慮狀態前額葉皮層局部場電位特征頻段為 theta 頻段（4～12 Hz），而且 theta 頻段局部場電位的能量、網絡連接強度及全局效率均減弱。本文以動作電位作為研究對象得到的結果與局部場電位變化趨勢一致，提示這兩種不同模態的神經信號都參與了焦慮樣行為。后續研究可將局部場電位和鋒電位組合構成數據對，研究二者模態信號的協同編碼機制。
焦慮情緒相關的腦區不僅局限于前額葉皮層，海馬和杏仁核等腦區同樣與焦慮有密切的聯系。Padilla-Coreano 等[25]研究表明，與焦慮相關的腦神經活動需要內側前額葉皮層、海馬和杏仁核的共同參與。焦慮神經環路中的信息傳遞，包含激活和抑制等調控行為[26-27]。在今后的研究中利用神經電生理和光遺傳技術可以將海馬或杏仁核等作為研究對象，從腦網絡信息傳遞的角度進一步探索焦慮的機制。
綜上所述，在焦慮狀態下前額葉皮層的腦網絡存在特征性，這對焦慮癥的診斷和治療具有重要的參考意義，也為焦慮癥發病機制的研究提供了幫助。進一步地，利用網絡參數可以幫助我們獲得關于大腦結構網絡與功能的認知和理解，為焦慮癥的早期診斷和治療提供重要依據，并為焦慮癥發病機制的研究提供創新的思路和技術。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
