重復經顱磁刺激是一種無創的腦刺激技術，作為一種治療性神經康復手段備受關注。已有研究表明，高頻重復經顱磁刺激可以提高動物在行為測試中的認知能力和神經元興奮性。本文旨在研究小鼠自然老化過程中，高頻重復經顱磁刺激對其認知能力和神經興奮性的影響。實驗采用青年小鼠、成年小鼠、老年小鼠各 12 只，且每個年齡段小鼠被隨機分成刺激組和對照組。刺激組小鼠接受連續 15 天的高頻重復經顱磁刺激，對照組接受連續 15 天的偽刺激。刺激結束之后，進行新物體識別與跳臺測試，用以檢查小鼠的學習記憶能力。行為學測試結束之后，進行全細胞腦片膜片鉗實驗，用以記錄并分析海馬齒狀回顆粒神經元的靜息膜電位、動作電位及其相關電特性指標。數據分析表明，小鼠認知能力與神經興奮性隨著老化而顯著衰退，高頻重復經顱磁刺激能顯著改善認知損傷并緩解神經電特性指標的衰退。通過改變海馬齒狀回顆粒神經元電生理特性以及提高神經元興奮性，可能是重復經顱磁刺激緩解認知損傷、提高認知能力的機制之一。
引用本文： 朱海軍, 丁沖, 李洋, 徐桂芝. 重復經顱磁刺激顯著改善小鼠老化過程中認知損傷及提高神經元興奮性. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(3): 380-388. doi: 10.7507/1001-5515.201905072 復制
引言
重復經顱磁刺激是一種應用在認知與神經科學領域的非侵入性、無創的大腦刺激與調控技術[1-2]。重復經顱磁刺激技術是利用電磁感應的原理，通過刺激線圈產生快速變化的脈沖磁場，在大腦皮層中誘導產生變化的磁場[3-4]。作為一種科研技術和臨床治療手段，重復經顱磁刺激早已廣泛地應用在基礎神經科學和神經疾病領域之中，在阿爾茨海默病、帕金森病、抑郁癥、精神分裂癥等研究中發揮了積極的作用[5-11]。
已有研究結果的一般規律表明，低頻重復經顱磁刺激在大腦中產生抑制作用，而高頻重復經顱磁刺激在大腦中產生興奮作用[2-3]。大量文獻報道，重復經顱磁刺激可以重塑神經連接和誘導神經可塑性[12-16]，以及提高神經元興奮性和改善認知功能等[5, 17-19]。但經顱磁刺激的具體作用機制尚不明確。
海馬腦區是大腦中參與學習記憶過程、調節認知功能的重要組成部分[20]，海馬齒狀回在空間行為中起著至關重要的作用[21]。本文的主要目的是研究在昆明小鼠大腦自然老化過程中，高頻重復經顱磁刺激對其認知功能與神經興奮性的影響。本研究提出假設：大腦老化過程中學習記憶功能的衰退與海馬齒狀回顆粒神經元興奮性的衰退有關，通過改善齒狀回顆粒神經元電生理特性、增加神經興奮性從而緩解認知損傷，是重復經顱磁刺激提高認知能力的潛在作用機制之一。
1 材料與方法
1.1 實驗設計
研究采用不同年齡段昆明小鼠，每個年齡段小鼠按照是否接受刺激分為實驗組與對照組。刺激或偽刺激結束后進行動物行為學測試，包括新物體識別與小鼠跳臺實驗。行為學測試結束后進行腦片膜片鉗電生理實驗。具體實驗流程及時間安排如圖 1 所示。
圖1
實驗設計流程圖
Figure1.
Experimental design
1.2 實驗動物及分組
所有動物實驗均獲得河北工業大學與華北理工大學倫理委員會批準，且符合實驗動物使用規范（實驗動物許可證號：SYXK（冀）2015-0038；倫理審查編號：LX201886）。實驗所需的青年小鼠（2 月齡）、成年小鼠（9 月齡）、老年小鼠（14 月齡）各 12 只，購買自北京華阜康生物科技有限公司。飼養小鼠的實驗環境溫度維持在（25 ± 1）℃，濕度維持在 50%～60%，給予小鼠充足的食物與水，12 小時光照與黑暗交替循環。每個年齡段的小鼠被隨機分成兩組，即刺激組與對照組。
1.3 重復經顱磁刺激
實驗采用英國 Magstim 公司生產的 Rapid2刺激器及型號為 D70 P/N9925-00 的標準八字型線圈。在給刺激組小鼠施加刺激的過程中，線圈的放置方法及線圈與小鼠頭部的位置關系參照相關文獻報道[18]。刺激組的實驗參數采用高頻 20 Hz，刺激強度約為 0.3 T（系線圈最大輸出強度的 15%，線圈最大輸出強度為 2.2 T），每天 1 000 個脈沖刺激，連續進行 15 天。對照組小鼠接受偽刺激，將線圈翻轉垂直于小鼠頭部且離開一段距離，小鼠只能聽到刺激聲音而不接受刺激。刺激在每天上午 8:00～10:00 進行。
1.4 新物體識別
本研究進行的新物體識別測試在參考相關文獻[22-23]的基礎上，一共分為四個階段，即適應期、訓練期、測試Ⅰ期與測試Ⅱ期。在適應期，每只小鼠被單獨放入空置的新物體識別箱體中自由活動 20 min。適應期結束 24 h 后進行訓練期測試，兩個相同的物體被平行且靠近箱體一側放置在箱體底部，每只小鼠被單獨放入箱體中自由探索 10 min。訓練期結束 1 h 后進行測試Ⅰ期的實驗，其中一個物體被一個形狀顏色不一但尺寸相當的新物體替代，每只小鼠被單獨放入箱體中自由探索 5 min，并用攝像機跟蹤記錄。測試Ⅰ期結束的 24 h 之后進行測試Ⅱ期的實驗，另一個舊物體被另一個形狀顏色不一但尺寸相當的新物體替代，每只小鼠被單獨放入箱體中自由探索 5 min，并用攝像機跟蹤記錄。在不同的實驗階段和每兩只小鼠任務之間，箱體與物體都要用 70% 的酒精擦拭，避免動物遺留氣味對自由探索行為造成干擾。新物體識別實驗設計流程見圖 2。
圖2
新物體識別實驗流程圖
Figure2.
Experimental protocol of novel object recognition test
測試Ⅰ期與測試Ⅱ期的小鼠行為被跟蹤記錄，并據此單獨分析每只小鼠探索新物體的時間和 T1 與探索舊物體的時間和 T2，計算得到測試Ⅰ期與測試Ⅱ期的認知指數 CI(1 h) 與 CI(24 h)。認知指數計算公式為 CI = T1/(T1 + T2)。
1.5 小鼠跳臺
跳臺實驗采用中國成都泰盟公司的 8 通道跳臺分析實驗系統，包括主機、刺激器、跳臺箱體。跳臺箱體由 8 個獨立的通道組成，每個通道尺寸 140 mm × 155 mm × 300 mm，每個通道內置一個圓柱形絕緣跳臺（直徑 45 mm，高 45 mm），箱體底部平行鋪有 24 根銅棒組成的銅柵。跳臺實驗分為三個階段，即適應期、電刺激期、被動逃避期。在適應期，每只小鼠被面對箱體壁放在跳臺之上，記錄小鼠第一次跳下臺子的時間作為跳臺潛伏期。適應期結束 24 h 后進行電刺激期的測試，每只小鼠被單獨放置在箱體底部的銅柵之上，并在銅柵上施加 28 V 直流電刺激。當小鼠由于躲避足底電擊跳上臺子之后開始計時，記錄 5 min 內小鼠跳下臺子受到電擊的犯錯誤次數以及 5 min 內小鼠在跳臺上的停留時間百分比。電刺激期結束 24 h 后進行被動逃避期的測試，每只小鼠被面對箱體壁放在跳臺之上，記錄小鼠第一次跳下臺子的時間作為被動逃避潛伏期。在不同的實驗階段和每兩只小鼠任務之間，箱體與臺子都要用 70% 的酒精擦拭，避免遺留氣味對小鼠行為造成干擾。跳臺實驗設計流程見圖 3。
圖3
跳臺實驗流程圖
Figure3.
Experimental protocol of step-down test
1.6 全細胞腦片膜片鉗
小鼠在麻醉狀態下被迅速斷頭取腦，大腦浸入冰水混合狀態且氧飽和的切片液中。使用德國徠卡 VT1200S 型號的震動切片機將大腦切成 300 μm 厚度的腦片，并將腦片移入氧飽和的 32 ℃ 恒溫人工腦脊液中孵育 1 h。取孵育完成的腦片置于膜片鉗平臺上的腦片記錄槽中，安裝上充灌有電極內液的玻璃微電極，在正置顯微鏡下進行封接破膜與信號記錄。切片液、人工腦脊液與電極內液的成分見表 1。
表1
切片液、人工腦脊液與電極內液離子成分
Table1.
The ionic composition of cutting solution, artificial cerebrospinal fluid and internal solutions
實驗選取海馬齒狀回顆粒神經元作為目標細胞。采用全細胞電流鉗記錄模式，記錄顆粒神經元的靜息膜電位、200 pA 刺激 500 ms 時長的長時程去極化電流下的動作電位放電個數，以及 200 pA 去極化電流下的單個誘發動作電位。分析了單個誘發動作電位的后超極化電位幅度、動作電位峰值、動作電位達峰時間、動作電位上升支與下降支平均斜率。動作電位相關指標分析如圖 4 所示。
圖4
動作電位相關指標示意圖
Figure4.
Schematic diagram of related indexes of action potential
1.7 數據及統計分析
數據分析采用 Two-way ANOVA 分析方法，年齡與治療方式（有無磁刺激）作為兩個主因素。事后分析即組別之間的多重比較采用 Bonferroni-test 矯正下的成對 t 檢驗分析方法。統計結果以均數 ± 標準差的方式呈現，檢驗水準為 0.05。
2 數據分析結果
2.1 新物體識別
如圖 5a 所示，對測試Ⅰ期認知指數的分析表明，年齡（F(2, 30) = 8.858，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 10.73，P < 0.01）均表現出了顯著的主因素效應，且年齡與治療方式表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 7.536，P < 0.01）。事后分析結果表明，老年對照組的測試Ⅰ期認知指數顯著低于青年對照組與成年對照組，老年刺激組的測試Ⅰ期認知指數顯著高于老年對照組。
圖5
新物體識別認知指數
a. 測試Ⅰ期認知指數；b.測試Ⅱ期認知指數。**
a. cognitive index of test Ⅰ phase; b. cognitive index of test Ⅱ phase. **
如圖 5b 所示，對測試Ⅱ期認知指數的分析表明，年齡（F(2, 30) = 0.951 8，P = 0.3974）沒有表現出顯著的主因素效應，治療方式（F(1, 30) = 4.267，P < 0.05）表現出了顯著的主因素效應，年齡與治療方式表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 24.34，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年刺激組的測試Ⅱ期認知指數顯著高于老年對照組。
新物體識別數據分析的結果表明，小鼠在大腦自然老化的過程中，其與空間記憶相關的認知能力是逐漸衰退的，高頻重復經顱磁刺激可以顯著改善年齡老化引起的認知能力的損傷。從對照組測試Ⅰ期與Ⅱ期認知指數的整體分布來看，Ⅰ期認知指數明顯高于Ⅱ期認知指數，或可暗示小鼠在空間記憶相關的行為任務中短期記憶能力比長期記憶能力更強。
2.2 小鼠跳臺
如圖 6a 所示，對跳臺潛伏期的分析表明，年齡（F(2, 30) = 1.207，P = 0.313 1）與治療方式（F(1, 30) = 0.107 8，P = 0.745 0）均沒有表現出顯著的主因素效應，也沒有表現出主因素之間顯著的交互效應（F(2, 30) = 0.016 1，P = 0.984 0）。
圖6
跳臺實驗數據分析
a. 潛伏期；b. 犯錯誤次數；c. 跳臺停留時間百分比；d. 被動逃避潛伏期。**
a. step-down latency; b. number of mistakes; c. percentage of residence time on the platform; d. passive escape latency. **
如圖 6b 所示，對犯錯誤次數的分析表明，年齡（F(2, 30) = 0.221 5，P = 0.802 6）沒有表現出顯著的主因素效應，治療方式（F(1, 30) = 15.32，P < 0.001）有顯著的主因素效應，且主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 4.209，P < 0.05）。事后分析結果表明，老年刺激組的犯錯誤次數顯著低于老年對照組。
如圖 6c 所示，對跳臺停留時間百分比的分析表明，年齡（F(2, 30) = 9.672，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 4.396，P < 0.05）表現出了顯著的主因素效應，主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 16.47，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年對照組的跳臺停留時間百分比顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的跳臺停留時間百分比顯著高于老年對照組。
如圖 6d 所示，對被動逃避潛伏期的分析表明，年齡（F(2, 30) = 9.126，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 7.945，P < 0.01）表現出了顯著的主因素效應，主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 9.234，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年對照組的被動逃避潛伏期顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的被動逃避潛伏期顯著高于老年對照組。
不同于新物體識別用于檢測空間學習記憶能力，跳臺實驗屬于被動逃避條件反射，主要反映動物非空間學習記憶能力的改變。在經歷電擊之前的適應期訓練中，潛伏期沒有明顯變化，說明磁刺激并未顯著影響小鼠的運動能力。犯錯誤次數是小鼠被電擊的次數，反映了短期學習記憶能力，對照組沒有表現出顯著的差異，表明小鼠的非空間短期學習記憶能力在老化過程中未受到顯著影響。在這個過程中老年小鼠的跳臺停留時間百分比明顯降低，說明老年小鼠從受到電擊到再次回到圓臺之間的時間間隔較長。被動逃避潛伏期反映小鼠長期學習記憶能力，由于小鼠對足底電擊形成了恐懼記憶，所以在被動逃避潛伏期的測試中小鼠并沒有很快跳下圓臺，且對照組中老年小鼠的被動逃避潛伏期顯著降低，表明小鼠在老化過程中的非空間長期學習記憶能力有所減退。在高頻重復經顱磁刺激的神經調控作用之下，小鼠的非空間學習記憶能力均得到了明顯改善。
2.3 腦片膜片鉗
如圖 7a 所示，對靜息膜電位的分析表明，年齡（F(2, 30) = 3.854，P < 0.05）與治療方式（F(1, 30) = 22.04，P < 0.001）均表現出了顯著的主因素效應，主因素間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 26.69，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年對照組的靜息膜電位顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的靜息膜電位顯著高于老年對照組。
圖7
膜電位及動作電位相關電特性數據分析
a. 靜息膜電位；b. 動作電位發放個數；c. 后超極化電位；d. 動作電位峰值；e. 動作電位達峰時間；f. 動作電位上升支平均斜率；g. 動作電位下降支平均斜率。*
a. resting membrane potential; b. the number of APs released; c. after-hyperpolarizing potential; d. AP peak amplitude; e. time to AP peak amplitude; f. average rise slope of AP; g. average down slope of AP. *
如圖 7b 所示，對動作電位個數的分析表明，年齡（F(2, 30) = 13.62，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 16.25，P < 0.001）均表現出了顯著的主因素效應，主因素間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 5.027，P < 0.05）。事后分析結果表明，老年對照組的動作電位個數顯著少于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的動作電位個數顯著多于老年對照組。
如圖 7c 所示，對后超極化電位的分析表明，年齡（F(2, 30) = 5.806，P < 0.01）與治療方式（F(1, 30) = 9.13，P < 0.01）均表現出了顯著的主因素效應，主因素間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 5.197，P < 0.05）。事后分析結果表明，老年對照組的后超極化電位顯著低于青年對照組，老年刺激組的后超極化電位顯著高于老年對照組。
如圖 7d 所示，對動作電位峰值的分析表明，年齡（F(2, 30) = 0.077，P = 0.926）與治療方式（F(1, 30) = 0.076，P = 0.784）均沒有表現出顯著的主因素效應，也沒有表現出主因素之間顯著的交互效應（F(2, 30) = 0.611，P = 0.549）。
如圖 7e 所示，對動作電位達峰時間的分析表明，年齡（F(2, 30) = 4.985，P < 0.05）與治療方式（F(1, 30) = 9.685，P < 0.01）均表現出了顯著的主因素效應，主因素間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 5.212，P < 0.05）。事后分析結果表明，老年對照組的達峰時間顯著長于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的達峰時間顯著少于老年對照組。
如圖 7f 所示，對動作電位上升支平均斜率的分析表明，年齡（F(2，30)= 12.67，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 4.251，P < 0.05）表現出了顯著的主因素效應，主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 8.008，P < 0.01）。事后分析結果表明，老年對照組的上升支平均斜率顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的上升支平均斜率顯著高于老年對照組。
如圖 7g 所示，對動作電位下降支平均斜率的分析表明，年齡（F(2, 30) = 20.69，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 5.407，P < 0.05）表現出了顯著的主因素效應，主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 11.06，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年對照組下降支平均斜率的絕對值顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的下降支平均斜率的絕對值顯著高于老年對照組。
通過對膜電位及動作電位相關數據的分析可得出，幾乎所有的指標在整體上都呈現出相似的變化趨勢，即隨著自然老化過程的發生，神經興奮性相關指標逐漸衰退，且在高頻重復經顱磁刺激的調控下有所改善，特別是對老年個體相關指標的提高尤為顯著。從具體特征分析來看，老年小鼠的靜息膜電位相比于青年成年小鼠顯著超極化，后超極化電位幅度顯著增加，暗示老年小鼠神經元在靜息狀態下的神經興奮性更低，在相同的刺激下使其去極化產生神經放電更難。同樣地，老年小鼠神經元的后超極化電位幅度顯著增加，使其神經元放電后回到了一個更低的興奮性水平，其再次興奮產生神經放電的能力相對更弱。動作電位達峰時間（從刺激起點至達到峰值的時間）與經線性擬合得到的上升支平均斜率的變化趨勢是一致的，時間越短說明相關離子通道的開閉速率越快，膜電位去極化的過程越迅速，上升支斜率越大。下降支斜率越大，說明復極化的過程越迅速。由此在相同的時間內，神經元的放電頻率越高。
3 討論
本文旨在探究在自然老化過程中，重復經顱磁刺激對昆明小鼠認知能力與神經興奮性的影響，并且提出了假設：老化引起的學習記憶功能的衰退可能與海馬齒狀回顆粒神經元相關電特性的衰退有關，如靜息膜電位、后超極化電位、動作電位放電頻數、動作電位峰值等，且重復經顱磁刺激可能是通過改善海馬齒狀回神經興奮性從而改善認知能力。實驗結果表明，昆明小鼠在老化過程中，伴隨著認知功能與齒狀回顆粒神經元相關電特性的退化，重復經顱磁刺激能顯著改善老年小鼠的這一退化現象，但對健康的青年與成年個體影響較小。這些結果與相關文獻的論述亦不沖突[24]。
基于嚙齒類動物對新事物自主探索的天性，新物體識別測試被用來獲取與空間記憶相關的信息[25]。這種類型的測試可以用來研究海馬在空間和工作記憶水平甚至是在認知形成過程中的功能[26]。本研究進行了短期與長期的學習記憶和空間探索能力的測試，結果顯示老化伴隨認知衰退，而高頻重復經顱磁刺激可以顯著緩解老年小鼠的這一認知損傷。已有相關研究表明，高頻重復經顱磁刺激可以顯著提高睡眠剝奪八齒鼠在新物體識別任務中的認知指數與空間記憶[25]。從實驗設計的改進方面考慮，新的空間位置的識別在這一任務中是很重要的[25]，通過接觸兩個物體的總時間來分析動物的運動能力也是必要的[27]。
基于被動逃避潛伏期的測量，發展了跳臺的測試方法用以分析小鼠的學習記憶能力[28]，且跳臺測試現已被應用于神經退行性疾病（如健忘癥）中認知能力的研究[29]。本研究的結果顯示：老化伴隨認知衰退，高頻重復經顱磁刺激可以顯著緩解老年小鼠的這一認知損傷；在小鼠沒有接受足底電刺激之前，跳臺潛伏期沒有顯著差異，說明本研究采用的高頻重復經顱磁刺激并未對小鼠的運動能力造成影響；對照組小鼠犯錯誤次數逐漸增多的趨勢與跳臺停留時間百分比顯著降低的趨勢相輔相成。有研究報道高頻重復經顱磁刺激可以顯著提高老年昆明小鼠在跳臺被動逃避任務中的表現[30]，這與本研究的結果高度吻合。
在對動作電位相關電特性指標的分析中，磁刺激的作用可以顯著縮短老年刺激小鼠動作電位達到峰值的時間，并且顯著提高動作電位上升支/下降支的平均斜率，可以推測老化降低了神經元離子通道的活性，而磁刺激的作用使得離子通道的開放與關閉更加活躍。已有文獻報道[17]，老年小鼠的靜息膜電位相比于成年小鼠顯著超極化，動作電位放電頻率顯著降低，后超極化電位幅度顯著增加，25 Hz 的高頻重復經顱磁刺激可以顯著提高老年小鼠的這些神經興奮性指標，這些發現與本研究結果高度相似。
高頻重復經顱磁刺激是一種間接非侵入性的無創腦刺激技術，通過線圈產生磁場穿透顱骨，進而誘導大腦神經興奮性產生變化[3]。在我們的研究中采用了標準的“8”字型線圈，其尺寸大于小鼠頭部。因現有技術的局限性，目前無法做到對小鼠特定腦區的單一精準刺激，因此這種刺激方式是一種全腦刺激。在全腦刺激的前提下，我們研究了海馬齒狀回顆粒神經元興奮性的變化，實驗結果分析證明這種刺激方式是有效的。通過對比其他人員的研究，類似的全腦刺激模式是普遍被采用的[17-18, 31]，因此通過我們采用的刺激方式得到的實驗結果是可靠的。雖然高頻重復經顱磁刺激在本研究中顯示出了積極的作用，但是本研究采用的參數設置并不能盲目應用于臨床治療。到目前為止，關于磁刺激的科學研究與臨床應用，尚無統一制定的參數標準，其治療效果也并不穩定。因此，繼續探索磁刺激作用的神經機制，持續優化刺激方案，仍然是探究重復經顱磁刺激在改善認知功能方面的研究重點。
4 結論
自然老化引起的昆明小鼠認知能力的衰退與海馬齒狀回顆粒神經元相關電特性的衰退有關，高頻重復經顱磁刺激可以緩解認知損傷與神經元相關電特性的衰退，在老年個體中的緩解作用尤為顯著。通過改變海馬齒狀回顆粒神經元電生理特性以及提高神經元興奮性，可能是重復經顱磁刺激緩解認知損傷、提高認知能力的機制之一。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
重復經顱磁刺激是一種應用在認知與神經科學領域的非侵入性、無創的大腦刺激與調控技術[1-2]。重復經顱磁刺激技術是利用電磁感應的原理，通過刺激線圈產生快速變化的脈沖磁場，在大腦皮層中誘導產生變化的磁場[3-4]。作為一種科研技術和臨床治療手段，重復經顱磁刺激早已廣泛地應用在基礎神經科學和神經疾病領域之中，在阿爾茨海默病、帕金森病、抑郁癥、精神分裂癥等研究中發揮了積極的作用[5-11]。
已有研究結果的一般規律表明，低頻重復經顱磁刺激在大腦中產生抑制作用，而高頻重復經顱磁刺激在大腦中產生興奮作用[2-3]。大量文獻報道，重復經顱磁刺激可以重塑神經連接和誘導神經可塑性[12-16]，以及提高神經元興奮性和改善認知功能等[5, 17-19]。但經顱磁刺激的具體作用機制尚不明確。
海馬腦區是大腦中參與學習記憶過程、調節認知功能的重要組成部分[20]，海馬齒狀回在空間行為中起著至關重要的作用[21]。本文的主要目的是研究在昆明小鼠大腦自然老化過程中，高頻重復經顱磁刺激對其認知功能與神經興奮性的影響。本研究提出假設：大腦老化過程中學習記憶功能的衰退與海馬齒狀回顆粒神經元興奮性的衰退有關，通過改善齒狀回顆粒神經元電生理特性、增加神經興奮性從而緩解認知損傷，是重復經顱磁刺激提高認知能力的潛在作用機制之一。
1 材料與方法
1.1 實驗設計
研究采用不同年齡段昆明小鼠，每個年齡段小鼠按照是否接受刺激分為實驗組與對照組。刺激或偽刺激結束后進行動物行為學測試，包括新物體識別與小鼠跳臺實驗。行為學測試結束后進行腦片膜片鉗電生理實驗。具體實驗流程及時間安排如圖 1 所示。
圖1
實驗設計流程圖
Figure1.
Experimental design
1.2 實驗動物及分組
所有動物實驗均獲得河北工業大學與華北理工大學倫理委員會批準，且符合實驗動物使用規范（實驗動物許可證號：SYXK（冀）2015-0038；倫理審查編號：LX201886）。實驗所需的青年小鼠（2 月齡）、成年小鼠（9 月齡）、老年小鼠（14 月齡）各 12 只，購買自北京華阜康生物科技有限公司。飼養小鼠的實驗環境溫度維持在（25 ± 1）℃，濕度維持在 50%～60%，給予小鼠充足的食物與水，12 小時光照與黑暗交替循環。每個年齡段的小鼠被隨機分成兩組，即刺激組與對照組。
1.3 重復經顱磁刺激
實驗采用英國 Magstim 公司生產的 Rapid2刺激器及型號為 D70 P/N9925-00 的標準八字型線圈。在給刺激組小鼠施加刺激的過程中，線圈的放置方法及線圈與小鼠頭部的位置關系參照相關文獻報道[18]。刺激組的實驗參數采用高頻 20 Hz，刺激強度約為 0.3 T（系線圈最大輸出強度的 15%，線圈最大輸出強度為 2.2 T），每天 1 000 個脈沖刺激，連續進行 15 天。對照組小鼠接受偽刺激，將線圈翻轉垂直于小鼠頭部且離開一段距離，小鼠只能聽到刺激聲音而不接受刺激。刺激在每天上午 8:00～10:00 進行。
1.4 新物體識別
本研究進行的新物體識別測試在參考相關文獻[22-23]的基礎上，一共分為四個階段，即適應期、訓練期、測試Ⅰ期與測試Ⅱ期。在適應期，每只小鼠被單獨放入空置的新物體識別箱體中自由活動 20 min。適應期結束 24 h 后進行訓練期測試，兩個相同的物體被平行且靠近箱體一側放置在箱體底部，每只小鼠被單獨放入箱體中自由探索 10 min。訓練期結束 1 h 后進行測試Ⅰ期的實驗，其中一個物體被一個形狀顏色不一但尺寸相當的新物體替代，每只小鼠被單獨放入箱體中自由探索 5 min，并用攝像機跟蹤記錄。測試Ⅰ期結束的 24 h 之后進行測試Ⅱ期的實驗，另一個舊物體被另一個形狀顏色不一但尺寸相當的新物體替代，每只小鼠被單獨放入箱體中自由探索 5 min，并用攝像機跟蹤記錄。在不同的實驗階段和每兩只小鼠任務之間，箱體與物體都要用 70% 的酒精擦拭，避免動物遺留氣味對自由探索行為造成干擾。新物體識別實驗設計流程見圖 2。
圖2
新物體識別實驗流程圖
Figure2.
Experimental protocol of novel object recognition test
測試Ⅰ期與測試Ⅱ期的小鼠行為被跟蹤記錄，并據此單獨分析每只小鼠探索新物體的時間和 T1 與探索舊物體的時間和 T2，計算得到測試Ⅰ期與測試Ⅱ期的認知指數 CI(1 h) 與 CI(24 h)。認知指數計算公式為 CI = T1/(T1 + T2)。
1.5 小鼠跳臺
跳臺實驗采用中國成都泰盟公司的 8 通道跳臺分析實驗系統，包括主機、刺激器、跳臺箱體。跳臺箱體由 8 個獨立的通道組成，每個通道尺寸 140 mm × 155 mm × 300 mm，每個通道內置一個圓柱形絕緣跳臺（直徑 45 mm，高 45 mm），箱體底部平行鋪有 24 根銅棒組成的銅柵。跳臺實驗分為三個階段，即適應期、電刺激期、被動逃避期。在適應期，每只小鼠被面對箱體壁放在跳臺之上，記錄小鼠第一次跳下臺子的時間作為跳臺潛伏期。適應期結束 24 h 后進行電刺激期的測試，每只小鼠被單獨放置在箱體底部的銅柵之上，并在銅柵上施加 28 V 直流電刺激。當小鼠由于躲避足底電擊跳上臺子之后開始計時，記錄 5 min 內小鼠跳下臺子受到電擊的犯錯誤次數以及 5 min 內小鼠在跳臺上的停留時間百分比。電刺激期結束 24 h 后進行被動逃避期的測試，每只小鼠被面對箱體壁放在跳臺之上，記錄小鼠第一次跳下臺子的時間作為被動逃避潛伏期。在不同的實驗階段和每兩只小鼠任務之間，箱體與臺子都要用 70% 的酒精擦拭，避免遺留氣味對小鼠行為造成干擾。跳臺實驗設計流程見圖 3。
圖3
跳臺實驗流程圖
Figure3.
Experimental protocol of step-down test
1.6 全細胞腦片膜片鉗
小鼠在麻醉狀態下被迅速斷頭取腦，大腦浸入冰水混合狀態且氧飽和的切片液中。使用德國徠卡 VT1200S 型號的震動切片機將大腦切成 300 μm 厚度的腦片，并將腦片移入氧飽和的 32 ℃ 恒溫人工腦脊液中孵育 1 h。取孵育完成的腦片置于膜片鉗平臺上的腦片記錄槽中，安裝上充灌有電極內液的玻璃微電極，在正置顯微鏡下進行封接破膜與信號記錄。切片液、人工腦脊液與電極內液的成分見表 1。
表1
切片液、人工腦脊液與電極內液離子成分
Table1.
The ionic composition of cutting solution, artificial cerebrospinal fluid and internal solutions
實驗選取海馬齒狀回顆粒神經元作為目標細胞。采用全細胞電流鉗記錄模式，記錄顆粒神經元的靜息膜電位、200 pA 刺激 500 ms 時長的長時程去極化電流下的動作電位放電個數，以及 200 pA 去極化電流下的單個誘發動作電位。分析了單個誘發動作電位的后超極化電位幅度、動作電位峰值、動作電位達峰時間、動作電位上升支與下降支平均斜率。動作電位相關指標分析如圖 4 所示。
圖4
動作電位相關指標示意圖
Figure4.
Schematic diagram of related indexes of action potential
1.7 數據及統計分析
數據分析采用 Two-way ANOVA 分析方法，年齡與治療方式（有無磁刺激）作為兩個主因素。事后分析即組別之間的多重比較采用 Bonferroni-test 矯正下的成對 t 檢驗分析方法。統計結果以均數 ± 標準差的方式呈現，檢驗水準為 0.05。
2 數據分析結果
2.1 新物體識別
如圖 5a 所示，對測試Ⅰ期認知指數的分析表明，年齡（F(2, 30) = 8.858，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 10.73，P < 0.01）均表現出了顯著的主因素效應，且年齡與治療方式表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 7.536，P < 0.01）。事后分析結果表明，老年對照組的測試Ⅰ期認知指數顯著低于青年對照組與成年對照組，老年刺激組的測試Ⅰ期認知指數顯著高于老年對照組。
圖5
新物體識別認知指數
a. 測試Ⅰ期認知指數；b.測試Ⅱ期認知指數。**
a. cognitive index of test Ⅰ phase; b. cognitive index of test Ⅱ phase. **
如圖 5b 所示，對測試Ⅱ期認知指數的分析表明，年齡（F(2, 30) = 0.951 8，P = 0.3974）沒有表現出顯著的主因素效應，治療方式（F(1, 30) = 4.267，P < 0.05）表現出了顯著的主因素效應，年齡與治療方式表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 24.34，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年刺激組的測試Ⅱ期認知指數顯著高于老年對照組。
新物體識別數據分析的結果表明，小鼠在大腦自然老化的過程中，其與空間記憶相關的認知能力是逐漸衰退的，高頻重復經顱磁刺激可以顯著改善年齡老化引起的認知能力的損傷。從對照組測試Ⅰ期與Ⅱ期認知指數的整體分布來看，Ⅰ期認知指數明顯高于Ⅱ期認知指數，或可暗示小鼠在空間記憶相關的行為任務中短期記憶能力比長期記憶能力更強。
2.2 小鼠跳臺
如圖 6a 所示，對跳臺潛伏期的分析表明，年齡（F(2, 30) = 1.207，P = 0.313 1）與治療方式（F(1, 30) = 0.107 8，P = 0.745 0）均沒有表現出顯著的主因素效應，也沒有表現出主因素之間顯著的交互效應（F(2, 30) = 0.016 1，P = 0.984 0）。
圖6
跳臺實驗數據分析
a. 潛伏期；b. 犯錯誤次數；c. 跳臺停留時間百分比；d. 被動逃避潛伏期。**
a. step-down latency; b. number of mistakes; c. percentage of residence time on the platform; d. passive escape latency. **
如圖 6b 所示，對犯錯誤次數的分析表明，年齡（F(2, 30) = 0.221 5，P = 0.802 6）沒有表現出顯著的主因素效應，治療方式（F(1, 30) = 15.32，P < 0.001）有顯著的主因素效應，且主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 4.209，P < 0.05）。事后分析結果表明，老年刺激組的犯錯誤次數顯著低于老年對照組。
如圖 6c 所示，對跳臺停留時間百分比的分析表明，年齡（F(2, 30) = 9.672，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 4.396，P < 0.05）表現出了顯著的主因素效應，主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 16.47，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年對照組的跳臺停留時間百分比顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的跳臺停留時間百分比顯著高于老年對照組。
如圖 6d 所示，對被動逃避潛伏期的分析表明，年齡（F(2, 30) = 9.126，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 7.945，P < 0.01）表現出了顯著的主因素效應，主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 9.234，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年對照組的被動逃避潛伏期顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的被動逃避潛伏期顯著高于老年對照組。
不同于新物體識別用于檢測空間學習記憶能力，跳臺實驗屬于被動逃避條件反射，主要反映動物非空間學習記憶能力的改變。在經歷電擊之前的適應期訓練中，潛伏期沒有明顯變化，說明磁刺激并未顯著影響小鼠的運動能力。犯錯誤次數是小鼠被電擊的次數，反映了短期學習記憶能力，對照組沒有表現出顯著的差異，表明小鼠的非空間短期學習記憶能力在老化過程中未受到顯著影響。在這個過程中老年小鼠的跳臺停留時間百分比明顯降低，說明老年小鼠從受到電擊到再次回到圓臺之間的時間間隔較長。被動逃避潛伏期反映小鼠長期學習記憶能力，由于小鼠對足底電擊形成了恐懼記憶，所以在被動逃避潛伏期的測試中小鼠并沒有很快跳下圓臺，且對照組中老年小鼠的被動逃避潛伏期顯著降低，表明小鼠在老化過程中的非空間長期學習記憶能力有所減退。在高頻重復經顱磁刺激的神經調控作用之下，小鼠的非空間學習記憶能力均得到了明顯改善。
2.3 腦片膜片鉗
如圖 7a 所示，對靜息膜電位的分析表明，年齡（F(2, 30) = 3.854，P < 0.05）與治療方式（F(1, 30) = 22.04，P < 0.001）均表現出了顯著的主因素效應，主因素間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 26.69，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年對照組的靜息膜電位顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的靜息膜電位顯著高于老年對照組。
圖7
膜電位及動作電位相關電特性數據分析
a. 靜息膜電位；b. 動作電位發放個數；c. 后超極化電位；d. 動作電位峰值；e. 動作電位達峰時間；f. 動作電位上升支平均斜率；g. 動作電位下降支平均斜率。*
a. resting membrane potential; b. the number of APs released; c. after-hyperpolarizing potential; d. AP peak amplitude; e. time to AP peak amplitude; f. average rise slope of AP; g. average down slope of AP. *
如圖 7b 所示，對動作電位個數的分析表明，年齡（F(2, 30) = 13.62，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 16.25，P < 0.001）均表現出了顯著的主因素效應，主因素間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 5.027，P < 0.05）。事后分析結果表明，老年對照組的動作電位個數顯著少于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的動作電位個數顯著多于老年對照組。
如圖 7c 所示，對后超極化電位的分析表明，年齡（F(2, 30) = 5.806，P < 0.01）與治療方式（F(1, 30) = 9.13，P < 0.01）均表現出了顯著的主因素效應，主因素間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 5.197，P < 0.05）。事后分析結果表明，老年對照組的后超極化電位顯著低于青年對照組，老年刺激組的后超極化電位顯著高于老年對照組。
如圖 7d 所示，對動作電位峰值的分析表明，年齡（F(2, 30) = 0.077，P = 0.926）與治療方式（F(1, 30) = 0.076，P = 0.784）均沒有表現出顯著的主因素效應，也沒有表現出主因素之間顯著的交互效應（F(2, 30) = 0.611，P = 0.549）。
如圖 7e 所示，對動作電位達峰時間的分析表明，年齡（F(2, 30) = 4.985，P < 0.05）與治療方式（F(1, 30) = 9.685，P < 0.01）均表現出了顯著的主因素效應，主因素間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 5.212，P < 0.05）。事后分析結果表明，老年對照組的達峰時間顯著長于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的達峰時間顯著少于老年對照組。
如圖 7f 所示，對動作電位上升支平均斜率的分析表明，年齡（F(2，30)= 12.67，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 4.251，P < 0.05）表現出了顯著的主因素效應，主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 8.008，P < 0.01）。事后分析結果表明，老年對照組的上升支平均斜率顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的上升支平均斜率顯著高于老年對照組。
如圖 7g 所示，對動作電位下降支平均斜率的分析表明，年齡（F(2, 30) = 20.69，P < 0.001）與治療方式（F(1, 30) = 5.407，P < 0.05）表現出了顯著的主因素效應，主因素之間表現出了顯著的交互效應（F(2, 30) = 11.06，P < 0.001）。事后分析結果表明，老年對照組下降支平均斜率的絕對值顯著低于青年對照組和成年對照組，老年刺激組的下降支平均斜率的絕對值顯著高于老年對照組。
通過對膜電位及動作電位相關數據的分析可得出，幾乎所有的指標在整體上都呈現出相似的變化趨勢，即隨著自然老化過程的發生，神經興奮性相關指標逐漸衰退，且在高頻重復經顱磁刺激的調控下有所改善，特別是對老年個體相關指標的提高尤為顯著。從具體特征分析來看，老年小鼠的靜息膜電位相比于青年成年小鼠顯著超極化，后超極化電位幅度顯著增加，暗示老年小鼠神經元在靜息狀態下的神經興奮性更低，在相同的刺激下使其去極化產生神經放電更難。同樣地，老年小鼠神經元的后超極化電位幅度顯著增加，使其神經元放電后回到了一個更低的興奮性水平，其再次興奮產生神經放電的能力相對更弱。動作電位達峰時間（從刺激起點至達到峰值的時間）與經線性擬合得到的上升支平均斜率的變化趨勢是一致的，時間越短說明相關離子通道的開閉速率越快，膜電位去極化的過程越迅速，上升支斜率越大。下降支斜率越大，說明復極化的過程越迅速。由此在相同的時間內，神經元的放電頻率越高。
3 討論
本文旨在探究在自然老化過程中，重復經顱磁刺激對昆明小鼠認知能力與神經興奮性的影響，并且提出了假設：老化引起的學習記憶功能的衰退可能與海馬齒狀回顆粒神經元相關電特性的衰退有關，如靜息膜電位、后超極化電位、動作電位放電頻數、動作電位峰值等，且重復經顱磁刺激可能是通過改善海馬齒狀回神經興奮性從而改善認知能力。實驗結果表明，昆明小鼠在老化過程中，伴隨著認知功能與齒狀回顆粒神經元相關電特性的退化，重復經顱磁刺激能顯著改善老年小鼠的這一退化現象，但對健康的青年與成年個體影響較小。這些結果與相關文獻的論述亦不沖突[24]。
基于嚙齒類動物對新事物自主探索的天性，新物體識別測試被用來獲取與空間記憶相關的信息[25]。這種類型的測試可以用來研究海馬在空間和工作記憶水平甚至是在認知形成過程中的功能[26]。本研究進行了短期與長期的學習記憶和空間探索能力的測試，結果顯示老化伴隨認知衰退，而高頻重復經顱磁刺激可以顯著緩解老年小鼠的這一認知損傷。已有相關研究表明，高頻重復經顱磁刺激可以顯著提高睡眠剝奪八齒鼠在新物體識別任務中的認知指數與空間記憶[25]。從實驗設計的改進方面考慮，新的空間位置的識別在這一任務中是很重要的[25]，通過接觸兩個物體的總時間來分析動物的運動能力也是必要的[27]。
基于被動逃避潛伏期的測量，發展了跳臺的測試方法用以分析小鼠的學習記憶能力[28]，且跳臺測試現已被應用于神經退行性疾病（如健忘癥）中認知能力的研究[29]。本研究的結果顯示：老化伴隨認知衰退，高頻重復經顱磁刺激可以顯著緩解老年小鼠的這一認知損傷；在小鼠沒有接受足底電刺激之前，跳臺潛伏期沒有顯著差異，說明本研究采用的高頻重復經顱磁刺激并未對小鼠的運動能力造成影響；對照組小鼠犯錯誤次數逐漸增多的趨勢與跳臺停留時間百分比顯著降低的趨勢相輔相成。有研究報道高頻重復經顱磁刺激可以顯著提高老年昆明小鼠在跳臺被動逃避任務中的表現[30]，這與本研究的結果高度吻合。
在對動作電位相關電特性指標的分析中，磁刺激的作用可以顯著縮短老年刺激小鼠動作電位達到峰值的時間，并且顯著提高動作電位上升支/下降支的平均斜率，可以推測老化降低了神經元離子通道的活性，而磁刺激的作用使得離子通道的開放與關閉更加活躍。已有文獻報道[17]，老年小鼠的靜息膜電位相比于成年小鼠顯著超極化，動作電位放電頻率顯著降低，后超極化電位幅度顯著增加，25 Hz 的高頻重復經顱磁刺激可以顯著提高老年小鼠的這些神經興奮性指標，這些發現與本研究結果高度相似。
高頻重復經顱磁刺激是一種間接非侵入性的無創腦刺激技術，通過線圈產生磁場穿透顱骨，進而誘導大腦神經興奮性產生變化[3]。在我們的研究中采用了標準的“8”字型線圈，其尺寸大于小鼠頭部。因現有技術的局限性，目前無法做到對小鼠特定腦區的單一精準刺激，因此這種刺激方式是一種全腦刺激。在全腦刺激的前提下，我們研究了海馬齒狀回顆粒神經元興奮性的變化，實驗結果分析證明這種刺激方式是有效的。通過對比其他人員的研究，類似的全腦刺激模式是普遍被采用的[17-18, 31]，因此通過我們采用的刺激方式得到的實驗結果是可靠的。雖然高頻重復經顱磁刺激在本研究中顯示出了積極的作用，但是本研究采用的參數設置并不能盲目應用于臨床治療。到目前為止，關于磁刺激的科學研究與臨床應用，尚無統一制定的參數標準，其治療效果也并不穩定。因此，繼續探索磁刺激作用的神經機制，持續優化刺激方案，仍然是探究重復經顱磁刺激在改善認知功能方面的研究重點。
4 結論
自然老化引起的昆明小鼠認知能力的衰退與海馬齒狀回顆粒神經元相關電特性的衰退有關，高頻重復經顱磁刺激可以緩解認知損傷與神經元相關電特性的衰退，在老年個體中的緩解作用尤為顯著。通過改變海馬齒狀回顆粒神經元電生理特性以及提高神經元興奮性，可能是重復經顱磁刺激緩解認知損傷、提高認知能力的機制之一。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
