隨著新型冠狀（簡稱：新冠）病毒疫情在全球愈演愈烈，越來越多的人們將疫情遏制的希望寄托于新冠病毒疫苗的研發。目前全球已經有多個研究團隊，采用了不同的疫苗開發技術路線開展新冠病毒疫苗的研發。本文對目前不同路線新冠疫苗的開發與研究現狀進行了綜述和分析，同時也探討了這些不同疫苗今后發展的可能性。
引用本文： 康莊, 唐梅. 新型冠狀病毒疫苗的研發進展及分析. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(3): 373-379. doi: 10.7507/1001-5515.202004025 復制
引言
新型冠狀（簡稱：新冠）病毒（2019 novel cronavirus，2019-nCoV），是繼嚴重急性呼吸道綜合癥（severe acute respiratory syndrome，SARS）冠狀病毒（SARS coronavirus，SARS-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）后，出現的第三個人群間突發傳播的冠狀病毒[1-3]。隨著全球新冠病毒肺炎相關疾病（coronavirus disease 2019，COVID-19）的患者激增，COVID-19 已經成為全球性大流行病，在尚無特效藥物的情況下，短期內研發并盡快使用新冠病毒疫苗是阻止疫情全球化蔓延的有力手段。
新冠病毒與其他冠狀病毒類似，由四個結構蛋白組成，分別是刺突蛋白（spike，S）、包膜蛋白（envelope，E）、膜蛋白/基質蛋白（membrane/matrix，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）[4-5]。S 蛋白通過位于 S1 亞基上的受體結合區（receptor binding domain，RBD）與宿主細胞表面的血管緊張素轉化酶 2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結合，從而進入人體細胞，導致發燒、肺部感染等疾病[6-7]。因為針對病毒 S 蛋白的中和抗體可阻斷病毒侵入宿主細胞[8]，所以目前在研的大多數新冠疫苗都是以 S 蛋白為主要抗原進行設計開發的。
截止 2020 年 4 月，全球范圍內已經公開了上百個新冠病毒疫苗開發項目[9]。按照不同研發途徑和思路以及相關特點，本文將逐步展開介紹，并輔以概括性的歸納和分析，希望為未來的突發流行病疫苗開發提供一些參考。
1 滅活疫苗路線
滅活病毒疫苗是在細胞基質上對病毒進行培養，然后用物理（加熱）或化學（通常采用甲醛溶液或者 β-丙內酯）的方法將具有感染性的完整病毒殺死，使其失去致病力而保留抗原性。常見的病毒類滅活疫苗，比如狂犬疫苗、滅活脊灰疫苗、流感疫苗以及我國率先研發并上市使用的手足口病疫苗，也稱腸道病毒 71 型疫苗（enterovirus type 71，EV71）等，都是采用類似的技術路線[10-11]。此前國內曾有團隊研發針對 SARS-CoV 的滅活疫苗，并完成了Ⅰ期臨床試驗，證明所獲得的冠狀類病毒滅活疫苗的人體安全性，同時能夠 100% 誘導產生中和抗體[12]。
目前，中國生物技術股份有限公司旗下兩個子公司：武漢生物制品研究所有限責任公司和北京生物制品研究所有限責任公司，以及北京科興生物制品有限公司等三個團隊的滅活新冠病毒疫苗，現都已進入了臨床試驗階段[13-15]。
滅活疫苗研發路線相對成熟，只要成功分離并篩選出免疫原性合格且可以在細胞上進行培養的毒株，并能夠應用于規模化生產即可。此外，滅活疫苗質控點和評價方法也比較明確，而且通常都有較好的安全性和免疫原性[10]。但利用滅活疫苗技術路線開發新冠病毒疫苗仍然存在不足之處，主要存在以下幾點：① 是毒株的分離和培養、相關研究評價工作以及后面的生產都存在一定的生物安全風險，對實驗室或者生產車間的生物安全級別要求高，一般要求為生物安全三級；② 是滅活疫苗盡管工藝成熟度高，但是由于生產過程需要進行細胞和病毒培養、建立毒株以及作為基質的細胞株的多級種子庫，因此在生產階段實現產能迅速放大（數千萬劑/年）存在一定難度；③ 是滅活疫苗往往需要多次接種才能產生有足夠保護力的抗體，在作為應急疫苗使用時有所不足。
2 減毒活疫苗路線
減毒活疫苗是從野生株或致病病毒衍生而來的，經典的毒株篩選方法是將相應的野生病毒在實驗室經反復傳代，逐步獲得對人體致病力大大降低的減毒株；當人體接種較小劑量的減毒株時，即可在體內產生良好的免疫反應。目前，此類常見的病毒類減毒株活疫苗也很多，比如：脊灰減毒活疫苗、麻腮風疫苗、水痘疫苗以及我國第一個出口海外的擁有自主知識產權的疫苗——乙型腦炎減毒活疫苗等[16]。
減毒活疫苗優點在于：① 可模擬病毒的自然感染，免疫效果好，免疫應答速度快，既可產生體液免疫，也可產生細胞免疫，往往只接種一劑次就可使機體產生良好的免疫應答；② 生產成本不高，相比滅活疫苗更易量產。不過，減毒活疫苗的缺點也非常明顯：① 研發時間長，合格疫苗候選株的篩選往往需要經多種細胞且多次傳代，有的還需低溫下細胞傳代；② 毒株關鍵指標——殘余毒力評估難度較大；③ 即使減毒活疫苗研發成功，在后續使用過程中也存在疫苗衍生株傳播疾病的可能性，即減毒活疫苗株在極個別接種者（往往是免疫功能缺陷者）體內發生變異重組后，導致未接種疫苗者感染患病[17]；④ 與滅活疫苗相似，減毒活疫苗的研發及生產涉及病毒培養，對生物安全要求相對較高，存在一定生物安全風險。
由于傳統減毒傳代的篩選方式費時費力，近年疫苗開發已經鮮有應用。針對目前疫情的緊急狀態，新冠減毒株的研發選擇傳代減毒策略的可能性很小。而從另一種角度考慮，比如 Lam 等[18]發現新冠病毒與穿山甲體內的某個冠狀病毒受體結合域（receptor binding domain，RBD）氨基酸序列相似性高達 97.4%，就像 17 世紀時詹納（Jenner）醫生利用牛痘預防天花那樣[19]，如果能從已經發現的動物冠狀病毒中，找到免疫后對新冠病毒有交叉保護作用同時無人體致病性的毒株，可以嘗試作為疫苗候選株進行繼續的評價和開發。此外，利用反向遺傳學技術，對新冠病毒進行定點的基因突變或者缺失，快速獲得不致病且免疫原性好的疫苗候選株，也是值得嘗試的思路。曾經有科學團隊嘗試通過對病毒 E 蛋白基因進行定點缺失和突變操作，其開發的 SARS-CoV 減毒株被證明可在小鼠上誘導產生體液和細胞免疫，并且能夠保護其免受 SARS-CoV 的攻擊[20-22]。
3 重組蛋白疫苗路線
相比于傳統的滅活和減毒路線，重組蛋白疫苗以其安全性好、低成本等優勢成為近年來疫苗研發的熱門方向。其過程是，基于已發布的病毒基因序列，將病毒目的抗原基因構建在表達載體上，再轉化到細菌、酵母、哺乳動物或昆蟲細胞中，誘導表達出抗原蛋白，最后純化后制成疫苗。常見的重組蛋白疫苗有乙肝疫苗和宮頸癌疫苗——人乳頭瘤病毒疫苗，以及中國率先研制的戊肝疫苗等。
新冠病毒表面抗原 S 蛋白具有天然三聚體結構，成都三葉草公司利用其 Trimer-Tag?（蛋白質三聚體化）專利技術，在哺乳動物細胞內表達、純化，得到與新冠病毒天然表面抗原 S 蛋白構象高度相似的共價三聚體融合蛋白——“S-三聚體”，同時試驗證明該“S-三聚體”抗原可以與病毒感染患者康復后血清中的特異性抗體結合[23]。
重組蛋白疫苗技術路線最大的優點是：① 安全性高，除了部分評價工作，生產及研發無需高等級生物安全實驗室；② 疫苗生產的工藝路線確定后，易于大規模生產。但由于是利用不同表達系統表達病毒部分蛋白作為抗原，所表達蛋白三維結構與病毒蛋白天然構象可能存在差異，所以免疫原性是否足夠，往往是重組蛋白路線能否成功的關鍵。為了解決免疫原性的問題，病毒類重組蛋白疫苗通常利用病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）構建技術，讓重組蛋白自組裝成一個類病毒顆粒以增強其免疫原性，之前提到的乙肝疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗、戊肝疫苗都是如此[24]。也有成功案例是利用疫苗佐劑達到輔助增強疫苗效果的目的，比如利用鋁佐劑吸附（乙肝疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗）；或者是更優效的復合免疫刺激佐劑，比如葛蘭素史克公司（GlaxoSmithKline，GSK）的重組帶狀皰疹病毒疫苗就是利用表達帶狀皰疹病毒 E 蛋白與該公司擁有專利技術的佐劑系統聯合使用，取得了良好的臨床效果[25]。2020 年 4 月 3 日，GSK 公司和廈門萬泰滄海生物技術有限公司（簡稱：廈門萬泰）聯合宣布開展研究合作，GSK 將向廈門萬泰提供疫苗佐劑系統，以評估廈門萬泰與廈門大學開發的重組蛋白冠狀病毒候選疫苗的臨床前效果[26]。
4 病毒載體疫苗路線
病毒載體疫苗，是使用活病毒（通常為仍具備復制活性的減毒株，或者是非復制型病毒）作為載體，將編碼外源性抗原的基因通過病毒載體呈遞到宿主細胞，使得抗原在宿主中進行表達并誘導產生相應的免疫應答。自從 20 世紀 80 年代以來，研究發現多種病毒可以作為疫苗載體，包括腺病毒、細小病毒（如腺相關病毒）、副粘病毒（如麻疹病毒、新城疫病毒或人副流感病毒）、彈狀病毒（如水皰性口炎病毒）和痘病毒（如重組牛痘安卡拉病毒）[27]。目前已經上市的預防用載體病毒疫苗不多，都未能得以大規模應用，比如黃熱病毒減毒株 17D 為基因骨架構建的重組登革熱疫苗 Dengvaxia[28]。2019 年底，歐盟和美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準了默沙東公司生產的以重組水皰性口炎病毒為載體的埃博拉疫苗 ERVEBO（rVSVΔG-ZEBOV-GP）上市，上市前該疫苗在 III 期臨床中取得較為滿意的結果[29]。中國人民解放軍軍事科學院（簡稱：軍科院）軍事醫學研究院和天津康希諾生物股份公司（簡稱：康希諾）合作開發的重組埃博拉病毒疫苗于 2017 年在中國獲批，是利用腺病毒 Ad5 為載體開發的預防埃博拉病毒感染的疫苗[30]。
2020 年 3 月 16 日，軍科院院士陳薇和康希諾公司聯合研制的重組新型冠狀病毒疫苗（腺病毒載體）的Ⅰ期臨床試驗已經在武漢開展[31]，現已完成了 14 天的初步安全性觀察，并于 4 月 12 日開展Ⅱ期臨床試驗[32]。英國牛津大學詹納研究所同樣利用腺病毒載體技術開發的新冠病毒疫苗于 4 月 23 日也開始進行Ⅰ期臨床試驗[33]。法國巴斯德研究所利用改良后的麻疹疫苗株作為載體，表達新冠病毒抗原基因的相關研發也在進展之中。此外，麻疹病毒能容納多個外源基因，不會與宿主基因組整合，因此安全性高，可被開發用于重組病毒載體疫苗。利用麻疹病毒開發針對基孔肯雅病毒的載體疫苗已經完成了Ⅱ期臨床試驗[34]，而利用麻疹病毒開發的 MERS-CoV 載體疫苗免疫小鼠后在攻毒試驗中也證明其確實具有保護效果[35]。
病毒載體疫苗路線具備減毒活疫苗部分優點，比如病毒載體本身可誘導產生強烈免疫應答（體液免疫和細胞免疫），因此通常不需要使用額外的佐劑。此外病毒載體疫苗的接種可以考慮不同的途徑，除肌肉接種外，鼻腔接種、皮內接種和口服接種都可以考慮，作為應急疫苗使用，給藥途徑易于實施。本技術路線短板在于，某些載體病毒可能存在潛在的宿主基因組整合能力，這一點需要在臨床研究開始之前和研究期間仔細評估。而且如果病毒載體是來自能夠感染人的病毒，比如麻疹、流感、腺病毒，都可能因為接種者原有的中和抗體或者免疫記憶，對病毒載體免疫原性產生影響，從而最終影響疫苗的保護效果[36]。
5 核酸疫苗路線（DNA 疫苗/mRNA 疫苗）
基于核酸的疫苗技術路線是使用編碼抗原的質粒 DNA 或 mRNA被細胞攝取后表達抗原蛋白，從而誘導機體產生體液免疫和細胞免疫。核酸疫苗路線支持各種抗原的遞送，可以利用平臺化的技術開發多種病原體的疫苗。疫苗的生產與編碼的蛋白質特性無關，因此不同的疫苗所需生產、純化和驗證方法都是相同的，更重要的是核酸疫苗的生產原料主要依賴于化學合成，大規模生產更容易；不同核酸疫苗制造所需的設施設備相同，研發、生產和生產線建設相對其他技術路線，所需時間大大減少。核酸疫苗路線的兩大技術（DNA 疫苗/mRNA 疫苗）非常適合開發應對 COVID-19 這種突發的緊急傳染病的疫苗。
5.1 DNA 疫苗
DNA 疫苗通常是通過將編碼目的抗原的真核表達元件插入質粒而成。20 世紀 90 年代的 DNA 疫苗研究中，最常見的給藥途徑是肌內或皮內注射，而單獨注射 DNA 疫苗免疫原性相對較低，特別是在大型動物模型和人類中更明顯。為改善這種情況，現在已經開發出了能夠增強 DNA 攝取、表達和免疫原性的其他接種方式，包括各種遞送裝置，例如基因槍、無針注射裝置和體內電穿孔裝置[37]。此外，不同的 DNA 疫苗呈遞制劑也在相應研發中，比如將 DNA 疫苗包裹在脂質體納米顆粒中，加入陽離子脂質體和膽固醇，吸附到如聚乙烯亞胺的聚合物上制備成可生物降解的納米顆粒[38]。這些手段都是為了改善細胞對 DNA 分子的攝取，從而增強抗原的表達。DNA 疫苗已經被用于針對各種人類病原體，如艾滋病毒、流感病毒、瘧疾、乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒和單純皰疹病毒等多種疫苗的開發，并已進入到臨床試驗階段[39]。
美國 Inovio 公司的新型冠狀病毒候選疫苗，就是 DNA 疫苗的一種。2020 年 4 月 6 日 Inovio 公司已經入組了 40 名健康受試者，開展其 DNA 新冠疫苗的 I 期臨床試驗[40]。Inovio 公司之前的成功案例就是利用同樣平臺技術開發的 MERS-CoV 疫苗，該 DNA 疫苗 I 期臨床研究中，顯示其具有良好的耐受性，在大約 95% 的受試者中誘導出了高水平的抗體反應，同時在近 90% 的受試者中產生了廣泛的 T 細胞應答，并在受試者給藥后 60 周內產生了持久的抗體反應[41]。
DNA 疫苗除了前面說的優勢，也存在著一些缺點。比如注射后 DNA 質粒可能會長期存在于體內，這樣會額外增加轉染到細胞核中外源基因整合到宿主染色體中的風險。而且，DNA 疫苗往往容易出現免疫原性較低、保護效果有限的情況，這也是相關研究團隊亟待解決的瓶頸問題[42]。
5.2 mRNA 疫苗
mRNA 是內源性蛋白質產生的模板，是遺傳信息的中間載體。mRNA 疫苗是將在體外合成的 mRNA 直接遞送到體內，由體內的細胞翻譯成抗原蛋白，達到激活免疫系統，引起特異性免疫的效果。mRNA 疫苗主要有兩種類型，非復制型（non-replicating）和自我擴增型（self-amplifying）。相比非復制型的 mRNA，自我擴增型 mRNA 不僅能編碼抗原，還有類似病毒復制過程的序列，使其可以在細胞內復制，提高蛋白表達量。mRNA 疫苗能夠被順利遞送進入細胞是其發揮作用的前提，這一過程難度很大。首先，裸露的 mRNA 直接進入體內會被降解；其次，mRNA 需要穿過帶負電荷的磷脂雙分子層結構的細胞膜才可進入細胞內部，而裸 mRNA 作為一種分子量較大且帶負電荷的分子，沒有載體幾乎不可能進入細胞。如何實現高效的 mRNA 遞送是本技術路線的最大難題。目前比較常見的是利用載體輔助 mRNA 的遞送，常用載體包括樹突細胞、魚精蛋白、脂質體和高分子載體等。脂質納米粒載體目前是 mRNA 疫苗最常用的載體之一。此外，也有使用物理方法輔助 mRNA 穿透細胞膜的，比如電基因槍、電穿孔法等[43]。大部分 mRNA 疫苗產品目前尚處于臨床階段，國際上還沒有獲批的 mRNA 疫苗或者治療產品上市，但因該技術具有胞內翻譯抗原和生產周期短等特點，mRNA 疫苗在癌癥疫苗，以及流感、HIV 等變異性高的病毒疫苗領域，都具一定的優勢[44]。
美國 Moderna 公司和德國 BioNTech 公司都在利用 mRNA 技術平臺研發新冠疫苗。Moderna 公司目前有 7 種在進行中的 mRNA 疫苗臨床試驗，同時也在進行 MERS-CoV 疫苗的開發，但目前尚處于動物實驗階段。該公司已經于 2020 年 3 月 16 日入組了 40 位健康受試者，開展了關于新冠候選疫苗 I 期臨床試驗，受試者將以 28 天間隔接受兩次肌肉注射，然后接受為期 12 個月的隨訪[45]。美國輝瑞公司與 BioNTech 公司聯合開發的新冠疫苗也在 4 月 29 日進了 I 期臨床試驗[46]。
mRNA 疫苗生產工藝簡單、合成快速、成本較低；在細胞質中翻譯不進入細胞核，相比 DNA 疫苗沒有整合宿主基因組的風險；作為核酸本身具有激活免疫反應的佐劑作用。在新冠病毒疫情突發又缺乏疫苗的當下，具備上述優點的 mRNA 疫苗很適合作為應急疫苗，但本身分子的穩定性是 mRNA 疫苗批量生產最大的挑戰。此外，不同于單純的體外細胞實驗，人體內環境復雜，mRNA 遞送系統是否有效也極為關鍵。在質量控制方面，如何檢測殘留的模板 DNA 和合成不完全的 mRNA，同樣是當前研究開發 mRNA 疫苗所需面臨的一大質量控制難題[47]。
6 新冠疫苗開發的相關思考
6.1 疫苗設計應注意的問題
世界衛生組織的《COVID-19 全球研究路線圖》里指出，冠狀病毒疫苗免疫后的動物，再次暴露于活病毒時，可能發生抗體依賴的疾病增強（antibody-dependent enhancement，ADE）效應，導致接種疫苗后感染病毒反而出現更嚴重的感染和疾病反應[48]。在進行 SARS-CoV 載體疫苗（重組牛痘病毒安卡拉株）研究時，發現在模型動物雪貂中，病毒特異抗體可結晶段（fragment crystallizable，Fc）通過與巨噬細胞 Fc 段受體結合，從而使得病毒可以感染不含 ACE2 受體的巨噬細胞，增強了病毒的感染性，而且中和抗體水平越低，感染越嚴重[49-50]。20 世紀呼吸道合胞病毒滅活疫苗研發失敗，臨床試驗發現并無保護作用，2 名接種的嬰兒因感染野毒株型呼吸道合胞病毒導致死亡，后來 Román 等[51]的研究揭示就是因為該滅活疫苗誘發了 ADE。
Tseng 等[52]使用小鼠作為模式動物評估了 4 種 SARS-CoV 疫苗，其中有兩種滅活病毒疫苗、一種重組 S 蛋白疫苗、一種病毒樣顆粒疫苗；盡管 4 種疫苗均能顯著抑制小鼠體內 SARS-CoV 復制，但導致了更嚴重的嗜酸性粒細胞浸潤肺部和免疫反應偏向 Th2 型，這些現象類似呼吸道合胞病毒滅活疫苗由于產生了非中和抗體引發的 ADE。Yasui 等[53]發現接種針對 SARS-CoV 的 N 蛋白疫苗后，小鼠也表現出更嚴重的肺炎。Bolles 等[54]的研究表示，滅活 SARS-CoV 全病毒疫苗不足以提供完全的保護，反而會促進了更強的嗜酸性粒細胞浸潤肺部組織。Liu 等[55]發現抗 SARS-CoV 的 S 蛋白的抗體是誘發急性肺損傷的因素之一。以上研究提示，在疫苗研發過程中要注意的不僅是滅活疫苗，單純以 S 蛋白作為抗原的重組蛋白疫苗、DNA 和 mRNA 疫苗，甚至是病毒載體疫苗，都有可能導致 ADE 發生。
防止 ADE 發生的一個關鍵措施就是選擇合適的靶抗原，減少非中和抗體誘導區。很多研究團隊的策略是只選擇優勢中和抗體誘導區，比如抗原只選擇 RBD 區，但筆者認為這樣抗原分子量較小，抗原本身的免疫原性可能受到影響。另外可以優化免疫策略，比如采用更優效的佐劑，輔助抗原產生高滴度中和抗體以降低 ADE 發生的可能性。最后新冠疫苗的設計最好能兼顧體液免疫和細胞免疫，在進行動物實驗和臨床試驗時也可以通過抗體水平和細胞免疫的相關檢測，提前對疫苗可能出現的 ADE 風險進行預估。
6.2 新冠疫苗的后續臨床設想
目前全球范圍進入臨床的新冠疫苗都在Ⅰ期或Ⅱ期階段。對于 COVID-19 這種新發、突發傳染病，預防性疫苗需要在新冠病毒流行區域進行Ⅲ期臨床試驗，觀察對照組和試驗組之間的病例（或病毒感染）差異。鑒于目前國內新冠疫情的發展和控制情況，新冠疫苗在國內選擇區域進行Ⅲ期臨床試驗可能性不大。Ⅲ期臨床可能需要在國外新冠病毒流行區域選擇受試者人群進行臨床研究。
另外一方面，鑒于目前新冠疫情在海外疫情比較嚴重，筆者認為如果有疫苗通過Ⅰ、Ⅱ期臨床被初步驗證有效性（保證安全性），可以考慮緊急狀態下開展相對大規模的單臂式（無對照組，全部接種試驗疫苗）Ⅲ期臨床設計，先給予醫護人員、防疫人員以及其他易感人群最大可能的保護，然后通過未接種區域人群的感染數據進行對比分析，最終確定Ⅲ期臨床的實際結果。Eyal 等[56]甚至認為可以選擇部分受試者，接種疫苗再進行病毒攻擊挑戰（自愿情況下），以加速新冠疫苗Ⅲ期臨床研究的進度。
6.3 未來應用的展望
新冠病毒目前已經在全球范圍內流行，短時期內各國對新冠疫苗的需求將會是數億甚至數十億；理想的新冠疫苗除了安全、有效，也需要易于儲存、運輸和接種，同時對生產成本和可及性也有一定要求。不同技術路線的疫苗，根據其固有特點，在新冠疫情發展的不同階段有可能得到不同的應用。比如，腺病毒載體疫苗可能最先應急使用，滅活疫苗和重組蛋白疫苗可能在后期大規模應用于大面積人群。
2003 年，國內 SARS 疫情期間，也曾有多個研究團隊進行過多種技術路線 SARS 疫苗的研發，但因為疫情快速得以控制，相關疫苗研究推進到臨床試驗階段時，因為沒有受試者而終止。如果新冠疫苗也因為疫情得以控制無法進行Ⅲ期臨床研究，已經完成Ⅱ期臨床的新冠疫苗也應該作為戰略儲備疫苗，以備不時之需。考慮到冠狀病毒已經數次成為嚴重威脅人類的流行病原體，建議在注意公共衛生防御系統，應急響應系統完善建立的同時，完善通用冠狀病毒應急疫苗研發平臺、通用呼吸道病毒應急疫苗研發平臺甚至是通用傳染病病原體應急疫苗研發平臺的建設，避免再次出現面對疫情而疫苗緩不濟急的情況。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
新型冠狀（簡稱：新冠）病毒（2019 novel cronavirus，2019-nCoV），是繼嚴重急性呼吸道綜合癥（severe acute respiratory syndrome，SARS）冠狀病毒（SARS coronavirus，SARS-CoV）和中東呼吸綜合癥冠狀病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）后，出現的第三個人群間突發傳播的冠狀病毒[1-3]。隨著全球新冠病毒肺炎相關疾病（coronavirus disease 2019，COVID-19）的患者激增，COVID-19 已經成為全球性大流行病，在尚無特效藥物的情況下，短期內研發并盡快使用新冠病毒疫苗是阻止疫情全球化蔓延的有力手段。
新冠病毒與其他冠狀病毒類似，由四個結構蛋白組成，分別是刺突蛋白（spike，S）、包膜蛋白（envelope，E）、膜蛋白/基質蛋白（membrane/matrix，M）和核衣殼蛋白（nucleocapsid，N）[4-5]。S 蛋白通過位于 S1 亞基上的受體結合區（receptor binding domain，RBD）與宿主細胞表面的血管緊張素轉化酶 2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）受體結合，從而進入人體細胞，導致發燒、肺部感染等疾病[6-7]。因為針對病毒 S 蛋白的中和抗體可阻斷病毒侵入宿主細胞[8]，所以目前在研的大多數新冠疫苗都是以 S 蛋白為主要抗原進行設計開發的。
截止 2020 年 4 月，全球范圍內已經公開了上百個新冠病毒疫苗開發項目[9]。按照不同研發途徑和思路以及相關特點，本文將逐步展開介紹，并輔以概括性的歸納和分析，希望為未來的突發流行病疫苗開發提供一些參考。
1 滅活疫苗路線
滅活病毒疫苗是在細胞基質上對病毒進行培養，然后用物理（加熱）或化學（通常采用甲醛溶液或者 β-丙內酯）的方法將具有感染性的完整病毒殺死，使其失去致病力而保留抗原性。常見的病毒類滅活疫苗，比如狂犬疫苗、滅活脊灰疫苗、流感疫苗以及我國率先研發并上市使用的手足口病疫苗，也稱腸道病毒 71 型疫苗（enterovirus type 71，EV71）等，都是采用類似的技術路線[10-11]。此前國內曾有團隊研發針對 SARS-CoV 的滅活疫苗，并完成了Ⅰ期臨床試驗，證明所獲得的冠狀類病毒滅活疫苗的人體安全性，同時能夠 100% 誘導產生中和抗體[12]。
目前，中國生物技術股份有限公司旗下兩個子公司：武漢生物制品研究所有限責任公司和北京生物制品研究所有限責任公司，以及北京科興生物制品有限公司等三個團隊的滅活新冠病毒疫苗，現都已進入了臨床試驗階段[13-15]。
滅活疫苗研發路線相對成熟，只要成功分離并篩選出免疫原性合格且可以在細胞上進行培養的毒株，并能夠應用于規模化生產即可。此外，滅活疫苗質控點和評價方法也比較明確，而且通常都有較好的安全性和免疫原性[10]。但利用滅活疫苗技術路線開發新冠病毒疫苗仍然存在不足之處，主要存在以下幾點：① 是毒株的分離和培養、相關研究評價工作以及后面的生產都存在一定的生物安全風險，對實驗室或者生產車間的生物安全級別要求高，一般要求為生物安全三級；② 是滅活疫苗盡管工藝成熟度高，但是由于生產過程需要進行細胞和病毒培養、建立毒株以及作為基質的細胞株的多級種子庫，因此在生產階段實現產能迅速放大（數千萬劑/年）存在一定難度；③ 是滅活疫苗往往需要多次接種才能產生有足夠保護力的抗體，在作為應急疫苗使用時有所不足。
2 減毒活疫苗路線
減毒活疫苗是從野生株或致病病毒衍生而來的，經典的毒株篩選方法是將相應的野生病毒在實驗室經反復傳代，逐步獲得對人體致病力大大降低的減毒株；當人體接種較小劑量的減毒株時，即可在體內產生良好的免疫反應。目前，此類常見的病毒類減毒株活疫苗也很多，比如：脊灰減毒活疫苗、麻腮風疫苗、水痘疫苗以及我國第一個出口海外的擁有自主知識產權的疫苗——乙型腦炎減毒活疫苗等[16]。
減毒活疫苗優點在于：① 可模擬病毒的自然感染，免疫效果好，免疫應答速度快，既可產生體液免疫，也可產生細胞免疫，往往只接種一劑次就可使機體產生良好的免疫應答；② 生產成本不高，相比滅活疫苗更易量產。不過，減毒活疫苗的缺點也非常明顯：① 研發時間長，合格疫苗候選株的篩選往往需要經多種細胞且多次傳代，有的還需低溫下細胞傳代；② 毒株關鍵指標——殘余毒力評估難度較大；③ 即使減毒活疫苗研發成功，在后續使用過程中也存在疫苗衍生株傳播疾病的可能性，即減毒活疫苗株在極個別接種者（往往是免疫功能缺陷者）體內發生變異重組后，導致未接種疫苗者感染患病[17]；④ 與滅活疫苗相似，減毒活疫苗的研發及生產涉及病毒培養，對生物安全要求相對較高，存在一定生物安全風險。
由于傳統減毒傳代的篩選方式費時費力，近年疫苗開發已經鮮有應用。針對目前疫情的緊急狀態，新冠減毒株的研發選擇傳代減毒策略的可能性很小。而從另一種角度考慮，比如 Lam 等[18]發現新冠病毒與穿山甲體內的某個冠狀病毒受體結合域（receptor binding domain，RBD）氨基酸序列相似性高達 97.4%，就像 17 世紀時詹納（Jenner）醫生利用牛痘預防天花那樣[19]，如果能從已經發現的動物冠狀病毒中，找到免疫后對新冠病毒有交叉保護作用同時無人體致病性的毒株，可以嘗試作為疫苗候選株進行繼續的評價和開發。此外，利用反向遺傳學技術，對新冠病毒進行定點的基因突變或者缺失，快速獲得不致病且免疫原性好的疫苗候選株，也是值得嘗試的思路。曾經有科學團隊嘗試通過對病毒 E 蛋白基因進行定點缺失和突變操作，其開發的 SARS-CoV 減毒株被證明可在小鼠上誘導產生體液和細胞免疫，并且能夠保護其免受 SARS-CoV 的攻擊[20-22]。
3 重組蛋白疫苗路線
相比于傳統的滅活和減毒路線，重組蛋白疫苗以其安全性好、低成本等優勢成為近年來疫苗研發的熱門方向。其過程是，基于已發布的病毒基因序列，將病毒目的抗原基因構建在表達載體上，再轉化到細菌、酵母、哺乳動物或昆蟲細胞中，誘導表達出抗原蛋白，最后純化后制成疫苗。常見的重組蛋白疫苗有乙肝疫苗和宮頸癌疫苗——人乳頭瘤病毒疫苗，以及中國率先研制的戊肝疫苗等。
新冠病毒表面抗原 S 蛋白具有天然三聚體結構，成都三葉草公司利用其 Trimer-Tag?（蛋白質三聚體化）專利技術，在哺乳動物細胞內表達、純化，得到與新冠病毒天然表面抗原 S 蛋白構象高度相似的共價三聚體融合蛋白——“S-三聚體”，同時試驗證明該“S-三聚體”抗原可以與病毒感染患者康復后血清中的特異性抗體結合[23]。
重組蛋白疫苗技術路線最大的優點是：① 安全性高，除了部分評價工作，生產及研發無需高等級生物安全實驗室；② 疫苗生產的工藝路線確定后，易于大規模生產。但由于是利用不同表達系統表達病毒部分蛋白作為抗原，所表達蛋白三維結構與病毒蛋白天然構象可能存在差異，所以免疫原性是否足夠，往往是重組蛋白路線能否成功的關鍵。為了解決免疫原性的問題，病毒類重組蛋白疫苗通常利用病毒樣顆粒（virus-like particles，VLP）構建技術，讓重組蛋白自組裝成一個類病毒顆粒以增強其免疫原性，之前提到的乙肝疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗、戊肝疫苗都是如此[24]。也有成功案例是利用疫苗佐劑達到輔助增強疫苗效果的目的，比如利用鋁佐劑吸附（乙肝疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗）；或者是更優效的復合免疫刺激佐劑，比如葛蘭素史克公司（GlaxoSmithKline，GSK）的重組帶狀皰疹病毒疫苗就是利用表達帶狀皰疹病毒 E 蛋白與該公司擁有專利技術的佐劑系統聯合使用，取得了良好的臨床效果[25]。2020 年 4 月 3 日，GSK 公司和廈門萬泰滄海生物技術有限公司（簡稱：廈門萬泰）聯合宣布開展研究合作，GSK 將向廈門萬泰提供疫苗佐劑系統，以評估廈門萬泰與廈門大學開發的重組蛋白冠狀病毒候選疫苗的臨床前效果[26]。
4 病毒載體疫苗路線
病毒載體疫苗，是使用活病毒（通常為仍具備復制活性的減毒株，或者是非復制型病毒）作為載體，將編碼外源性抗原的基因通過病毒載體呈遞到宿主細胞，使得抗原在宿主中進行表達并誘導產生相應的免疫應答。自從 20 世紀 80 年代以來，研究發現多種病毒可以作為疫苗載體，包括腺病毒、細小病毒（如腺相關病毒）、副粘病毒（如麻疹病毒、新城疫病毒或人副流感病毒）、彈狀病毒（如水皰性口炎病毒）和痘病毒（如重組牛痘安卡拉病毒）[27]。目前已經上市的預防用載體病毒疫苗不多，都未能得以大規模應用，比如黃熱病毒減毒株 17D 為基因骨架構建的重組登革熱疫苗 Dengvaxia[28]。2019 年底，歐盟和美國食品藥品監督管理局（food and drug administration，FDA）批準了默沙東公司生產的以重組水皰性口炎病毒為載體的埃博拉疫苗 ERVEBO（rVSVΔG-ZEBOV-GP）上市，上市前該疫苗在 III 期臨床中取得較為滿意的結果[29]。中國人民解放軍軍事科學院（簡稱：軍科院）軍事醫學研究院和天津康希諾生物股份公司（簡稱：康希諾）合作開發的重組埃博拉病毒疫苗于 2017 年在中國獲批，是利用腺病毒 Ad5 為載體開發的預防埃博拉病毒感染的疫苗[30]。
2020 年 3 月 16 日，軍科院院士陳薇和康希諾公司聯合研制的重組新型冠狀病毒疫苗（腺病毒載體）的Ⅰ期臨床試驗已經在武漢開展[31]，現已完成了 14 天的初步安全性觀察，并于 4 月 12 日開展Ⅱ期臨床試驗[32]。英國牛津大學詹納研究所同樣利用腺病毒載體技術開發的新冠病毒疫苗于 4 月 23 日也開始進行Ⅰ期臨床試驗[33]。法國巴斯德研究所利用改良后的麻疹疫苗株作為載體，表達新冠病毒抗原基因的相關研發也在進展之中。此外，麻疹病毒能容納多個外源基因，不會與宿主基因組整合，因此安全性高，可被開發用于重組病毒載體疫苗。利用麻疹病毒開發針對基孔肯雅病毒的載體疫苗已經完成了Ⅱ期臨床試驗[34]，而利用麻疹病毒開發的 MERS-CoV 載體疫苗免疫小鼠后在攻毒試驗中也證明其確實具有保護效果[35]。
病毒載體疫苗路線具備減毒活疫苗部分優點，比如病毒載體本身可誘導產生強烈免疫應答（體液免疫和細胞免疫），因此通常不需要使用額外的佐劑。此外病毒載體疫苗的接種可以考慮不同的途徑，除肌肉接種外，鼻腔接種、皮內接種和口服接種都可以考慮，作為應急疫苗使用，給藥途徑易于實施。本技術路線短板在于，某些載體病毒可能存在潛在的宿主基因組整合能力，這一點需要在臨床研究開始之前和研究期間仔細評估。而且如果病毒載體是來自能夠感染人的病毒，比如麻疹、流感、腺病毒，都可能因為接種者原有的中和抗體或者免疫記憶，對病毒載體免疫原性產生影響，從而最終影響疫苗的保護效果[36]。
5 核酸疫苗路線（DNA 疫苗/mRNA 疫苗）
基于核酸的疫苗技術路線是使用編碼抗原的質粒 DNA 或 mRNA被細胞攝取后表達抗原蛋白，從而誘導機體產生體液免疫和細胞免疫。核酸疫苗路線支持各種抗原的遞送，可以利用平臺化的技術開發多種病原體的疫苗。疫苗的生產與編碼的蛋白質特性無關，因此不同的疫苗所需生產、純化和驗證方法都是相同的，更重要的是核酸疫苗的生產原料主要依賴于化學合成，大規模生產更容易；不同核酸疫苗制造所需的設施設備相同，研發、生產和生產線建設相對其他技術路線，所需時間大大減少。核酸疫苗路線的兩大技術（DNA 疫苗/mRNA 疫苗）非常適合開發應對 COVID-19 這種突發的緊急傳染病的疫苗。
5.1 DNA 疫苗
DNA 疫苗通常是通過將編碼目的抗原的真核表達元件插入質粒而成。20 世紀 90 年代的 DNA 疫苗研究中，最常見的給藥途徑是肌內或皮內注射，而單獨注射 DNA 疫苗免疫原性相對較低，特別是在大型動物模型和人類中更明顯。為改善這種情況，現在已經開發出了能夠增強 DNA 攝取、表達和免疫原性的其他接種方式，包括各種遞送裝置，例如基因槍、無針注射裝置和體內電穿孔裝置[37]。此外，不同的 DNA 疫苗呈遞制劑也在相應研發中，比如將 DNA 疫苗包裹在脂質體納米顆粒中，加入陽離子脂質體和膽固醇，吸附到如聚乙烯亞胺的聚合物上制備成可生物降解的納米顆粒[38]。這些手段都是為了改善細胞對 DNA 分子的攝取，從而增強抗原的表達。DNA 疫苗已經被用于針對各種人類病原體，如艾滋病毒、流感病毒、瘧疾、乙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒和單純皰疹病毒等多種疫苗的開發，并已進入到臨床試驗階段[39]。
美國 Inovio 公司的新型冠狀病毒候選疫苗，就是 DNA 疫苗的一種。2020 年 4 月 6 日 Inovio 公司已經入組了 40 名健康受試者，開展其 DNA 新冠疫苗的 I 期臨床試驗[40]。Inovio 公司之前的成功案例就是利用同樣平臺技術開發的 MERS-CoV 疫苗，該 DNA 疫苗 I 期臨床研究中，顯示其具有良好的耐受性，在大約 95% 的受試者中誘導出了高水平的抗體反應，同時在近 90% 的受試者中產生了廣泛的 T 細胞應答，并在受試者給藥后 60 周內產生了持久的抗體反應[41]。
DNA 疫苗除了前面說的優勢，也存在著一些缺點。比如注射后 DNA 質粒可能會長期存在于體內，這樣會額外增加轉染到細胞核中外源基因整合到宿主染色體中的風險。而且，DNA 疫苗往往容易出現免疫原性較低、保護效果有限的情況，這也是相關研究團隊亟待解決的瓶頸問題[42]。
5.2 mRNA 疫苗
mRNA 是內源性蛋白質產生的模板，是遺傳信息的中間載體。mRNA 疫苗是將在體外合成的 mRNA 直接遞送到體內，由體內的細胞翻譯成抗原蛋白，達到激活免疫系統，引起特異性免疫的效果。mRNA 疫苗主要有兩種類型，非復制型（non-replicating）和自我擴增型（self-amplifying）。相比非復制型的 mRNA，自我擴增型 mRNA 不僅能編碼抗原，還有類似病毒復制過程的序列，使其可以在細胞內復制，提高蛋白表達量。mRNA 疫苗能夠被順利遞送進入細胞是其發揮作用的前提，這一過程難度很大。首先，裸露的 mRNA 直接進入體內會被降解；其次，mRNA 需要穿過帶負電荷的磷脂雙分子層結構的細胞膜才可進入細胞內部，而裸 mRNA 作為一種分子量較大且帶負電荷的分子，沒有載體幾乎不可能進入細胞。如何實現高效的 mRNA 遞送是本技術路線的最大難題。目前比較常見的是利用載體輔助 mRNA 的遞送，常用載體包括樹突細胞、魚精蛋白、脂質體和高分子載體等。脂質納米粒載體目前是 mRNA 疫苗最常用的載體之一。此外，也有使用物理方法輔助 mRNA 穿透細胞膜的，比如電基因槍、電穿孔法等[43]。大部分 mRNA 疫苗產品目前尚處于臨床階段，國際上還沒有獲批的 mRNA 疫苗或者治療產品上市，但因該技術具有胞內翻譯抗原和生產周期短等特點，mRNA 疫苗在癌癥疫苗，以及流感、HIV 等變異性高的病毒疫苗領域，都具一定的優勢[44]。
美國 Moderna 公司和德國 BioNTech 公司都在利用 mRNA 技術平臺研發新冠疫苗。Moderna 公司目前有 7 種在進行中的 mRNA 疫苗臨床試驗，同時也在進行 MERS-CoV 疫苗的開發，但目前尚處于動物實驗階段。該公司已經于 2020 年 3 月 16 日入組了 40 位健康受試者，開展了關于新冠候選疫苗 I 期臨床試驗，受試者將以 28 天間隔接受兩次肌肉注射，然后接受為期 12 個月的隨訪[45]。美國輝瑞公司與 BioNTech 公司聯合開發的新冠疫苗也在 4 月 29 日進了 I 期臨床試驗[46]。
mRNA 疫苗生產工藝簡單、合成快速、成本較低；在細胞質中翻譯不進入細胞核，相比 DNA 疫苗沒有整合宿主基因組的風險；作為核酸本身具有激活免疫反應的佐劑作用。在新冠病毒疫情突發又缺乏疫苗的當下，具備上述優點的 mRNA 疫苗很適合作為應急疫苗，但本身分子的穩定性是 mRNA 疫苗批量生產最大的挑戰。此外，不同于單純的體外細胞實驗，人體內環境復雜，mRNA 遞送系統是否有效也極為關鍵。在質量控制方面，如何檢測殘留的模板 DNA 和合成不完全的 mRNA，同樣是當前研究開發 mRNA 疫苗所需面臨的一大質量控制難題[47]。
6 新冠疫苗開發的相關思考
6.1 疫苗設計應注意的問題
世界衛生組織的《COVID-19 全球研究路線圖》里指出，冠狀病毒疫苗免疫后的動物，再次暴露于活病毒時，可能發生抗體依賴的疾病增強（antibody-dependent enhancement，ADE）效應，導致接種疫苗后感染病毒反而出現更嚴重的感染和疾病反應[48]。在進行 SARS-CoV 載體疫苗（重組牛痘病毒安卡拉株）研究時，發現在模型動物雪貂中，病毒特異抗體可結晶段（fragment crystallizable，Fc）通過與巨噬細胞 Fc 段受體結合，從而使得病毒可以感染不含 ACE2 受體的巨噬細胞，增強了病毒的感染性，而且中和抗體水平越低，感染越嚴重[49-50]。20 世紀呼吸道合胞病毒滅活疫苗研發失敗，臨床試驗發現并無保護作用，2 名接種的嬰兒因感染野毒株型呼吸道合胞病毒導致死亡，后來 Román 等[51]的研究揭示就是因為該滅活疫苗誘發了 ADE。
Tseng 等[52]使用小鼠作為模式動物評估了 4 種 SARS-CoV 疫苗，其中有兩種滅活病毒疫苗、一種重組 S 蛋白疫苗、一種病毒樣顆粒疫苗；盡管 4 種疫苗均能顯著抑制小鼠體內 SARS-CoV 復制，但導致了更嚴重的嗜酸性粒細胞浸潤肺部和免疫反應偏向 Th2 型，這些現象類似呼吸道合胞病毒滅活疫苗由于產生了非中和抗體引發的 ADE。Yasui 等[53]發現接種針對 SARS-CoV 的 N 蛋白疫苗后，小鼠也表現出更嚴重的肺炎。Bolles 等[54]的研究表示，滅活 SARS-CoV 全病毒疫苗不足以提供完全的保護，反而會促進了更強的嗜酸性粒細胞浸潤肺部組織。Liu 等[55]發現抗 SARS-CoV 的 S 蛋白的抗體是誘發急性肺損傷的因素之一。以上研究提示，在疫苗研發過程中要注意的不僅是滅活疫苗，單純以 S 蛋白作為抗原的重組蛋白疫苗、DNA 和 mRNA 疫苗，甚至是病毒載體疫苗，都有可能導致 ADE 發生。
防止 ADE 發生的一個關鍵措施就是選擇合適的靶抗原，減少非中和抗體誘導區。很多研究團隊的策略是只選擇優勢中和抗體誘導區，比如抗原只選擇 RBD 區，但筆者認為這樣抗原分子量較小，抗原本身的免疫原性可能受到影響。另外可以優化免疫策略，比如采用更優效的佐劑，輔助抗原產生高滴度中和抗體以降低 ADE 發生的可能性。最后新冠疫苗的設計最好能兼顧體液免疫和細胞免疫，在進行動物實驗和臨床試驗時也可以通過抗體水平和細胞免疫的相關檢測，提前對疫苗可能出現的 ADE 風險進行預估。
6.2 新冠疫苗的后續臨床設想
目前全球范圍進入臨床的新冠疫苗都在Ⅰ期或Ⅱ期階段。對于 COVID-19 這種新發、突發傳染病，預防性疫苗需要在新冠病毒流行區域進行Ⅲ期臨床試驗，觀察對照組和試驗組之間的病例（或病毒感染）差異。鑒于目前國內新冠疫情的發展和控制情況，新冠疫苗在國內選擇區域進行Ⅲ期臨床試驗可能性不大。Ⅲ期臨床可能需要在國外新冠病毒流行區域選擇受試者人群進行臨床研究。
另外一方面，鑒于目前新冠疫情在海外疫情比較嚴重，筆者認為如果有疫苗通過Ⅰ、Ⅱ期臨床被初步驗證有效性（保證安全性），可以考慮緊急狀態下開展相對大規模的單臂式（無對照組，全部接種試驗疫苗）Ⅲ期臨床設計，先給予醫護人員、防疫人員以及其他易感人群最大可能的保護，然后通過未接種區域人群的感染數據進行對比分析，最終確定Ⅲ期臨床的實際結果。Eyal 等[56]甚至認為可以選擇部分受試者，接種疫苗再進行病毒攻擊挑戰（自愿情況下），以加速新冠疫苗Ⅲ期臨床研究的進度。
6.3 未來應用的展望
新冠病毒目前已經在全球范圍內流行，短時期內各國對新冠疫苗的需求將會是數億甚至數十億；理想的新冠疫苗除了安全、有效，也需要易于儲存、運輸和接種，同時對生產成本和可及性也有一定要求。不同技術路線的疫苗，根據其固有特點，在新冠疫情發展的不同階段有可能得到不同的應用。比如，腺病毒載體疫苗可能最先應急使用，滅活疫苗和重組蛋白疫苗可能在后期大規模應用于大面積人群。
2003 年，國內 SARS 疫情期間，也曾有多個研究團隊進行過多種技術路線 SARS 疫苗的研發，但因為疫情快速得以控制，相關疫苗研究推進到臨床試驗階段時，因為沒有受試者而終止。如果新冠疫苗也因為疫情得以控制無法進行Ⅲ期臨床研究，已經完成Ⅱ期臨床的新冠疫苗也應該作為戰略儲備疫苗，以備不時之需。考慮到冠狀病毒已經數次成為嚴重威脅人類的流行病原體，建議在注意公共衛生防御系統，應急響應系統完善建立的同時，完善通用冠狀病毒應急疫苗研發平臺、通用呼吸道病毒應急疫苗研發平臺甚至是通用傳染病病原體應急疫苗研發平臺的建設，避免再次出現面對疫情而疫苗緩不濟急的情況。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。