磷酸三鈣（TCP）是構建骨組織工程支架常用的生物陶瓷材料。三維（3D）打印的 TCP 支架具有精確可控的孔隙結構，但存在力學性能不足的問題。由于燒結工藝對生物陶瓷支架力學性能的影響至關重要，本文詳細探討了不同燒結溫度對 3D 打印 TCP 支架的力學性能的影響，測試了不同燒結溫度制備的支架的表觀形貌、質量和體積收縮率、孔隙率、力學性能以及降解性能。結果表明，當燒結溫度為 1 150℃ 時，晶粒生長充分、氣孔最少，支架具有最大的體積收縮率、最小的孔隙率以及最優的力學性能，壓縮模量和抗壓強度可以分別達到（100.08 ± 18.6）MPa 和（6.52 ± 0.84）MPa，能夠滿足人體松質骨力學強度的要求。此外，與其他燒結溫度下制備的支架相比，1 150℃ 下燒結制備的支架在酸性環境中降解最慢，進一步說明其在長期植入時具有更佳的力學穩定性。該支架可支持骨髓間充質干細胞（BMSCs）黏附和快速增殖，具有良好的生物相容性。綜上，本文優化了 3D 打印 TCP 支架的燒結工藝，提高了其力學性能，為其作為承重骨的應用奠定了基礎。
引用本文： 滿星云, 索海瑞, 劉家利, 徐銘恩, 王玲. 基于三維打印的磷酸三鈣骨組織工程支架燒結工藝研究. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(1): 112-118. doi: 10.7507/1001-5515.201906065 復制
引言
磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）是一種可降解的生物陶瓷，具有良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性，是理想的人體骨組織修復和替代材料[1]。通過三維（three-dimensional，3D）打印 TCP 生物陶瓷，可以得到定制的 3D 宏觀結構以及精確控制的內部孔隙結構，有利于營養物質的運輸和新骨的長成，因此在骨組織工程領域已得到廣泛的應用[2-3]。然而，3D 打印的 TCP 支架存在脆性大、抗壓強度低以及力學性能不足等問題，在一定程度上限制了其在承重骨上的應用[4]。因此，如何提高 3D 打印 TCP 支架的力學強度現已成為骨組織修復材料研究領域的熱點問題之一。
研究表明，通過優化燒結工藝可以有效改善生物陶瓷的力學性能[5]。目前已有的燒結技術有放電等離子燒結、微波燒結、超高壓燒結、反應熱壓燒結、兩步燒結和熱等靜壓燒結等[6-7]。每種燒結技術都有其各自的優缺點，需要選擇合適的燒結技術才能獲得性能優異的生物陶瓷支架。例如，Mazaheri 等[8]采用兩步燒結的方式燒結羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP），將 HAP 快速升溫到燒結溫度以上抑制晶粒增長，在晶粒變大之前就開始急劇降溫至燒結溫度，然后恒溫抑制晶界遷移，得到較小的晶粒，結果表明燒結出的 HAP 晶粒尺寸為 190 nm，力學強度為（1.92 ± 0.2）MPa。周奎[9]采用箱式爐對 HAP 支架進行兩段燒結，首先以 5℃/min 的升溫速率將支架加熱至預燒結溫度，保溫 1 h；然后將支架以相同的升溫速率加熱到燒結溫度，保溫 2 h，以確保去除雜質；燒結完成的支架結構完整、無變形和開裂現象。生物陶瓷的燒結過程非常復雜，影響燒結的因素很多，材料的化學成分、物理特性、燒結的溫度與燒結時間等均會對其力學性能產生影響[10]。Isa 等[11]研究發現，燒結溫度的不同會導致材料的密度、比表面積以及晶粒尺寸不同，從而導致力學性能不同。目前對于生物陶瓷燒結工藝的研究大部分都集中在 HAP 材料，關于燒結工藝對 3D 打印 TCP 支架力學性能的影響還沒有詳細的研究。
基于以上原因，本研究通過 3D 打印技術制備具有連通網格結構的 TCP 支架，采用兩段燒結的方法對其進行燒結，通過檢測不同燒結溫度下支架的表觀形貌、質量和體積收縮率、孔隙率、力學性能以及降解性能等，研究燒結工藝對其力學性能的影響，從而得到最適合 TCP 支架的燒結工藝。然后，本文進一步在支架上接種骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs），結果表明細胞在支架上能夠很好地黏附和生長，支架具有良好的生物相容性。本研究優化了 3D 打印 TCP 支架的燒結工藝，提高了其力學性能，為其作為承重骨的應用奠定了基礎。
1 材料與方法
1.1 試劑以及儀器
本研究主要試劑：β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）（南京埃普瑞，中國）；聚丙烯酸銨（上海宛道，中國）；聚甲基纖維素（Sigma，美國）；檸檬酸鈉（源葉生物，中國）；無水檸檬酸（源葉生物，中國）；磷酸鹽緩沖液（Multicell，美國）；杜氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified Eagle’s medium，DMEM）高糖培養基（Gibco，美國）；胎牛血清（Multicell，美國）；青霉素/鏈霉素（天津灝洋，中國）；活/死細胞活力檢測試劑盒（南京凱基，中國）。
本研究主要儀器設備：生物 3D 打印機（Bio-Architect，Regenovo，中國）；箱式電阻爐（SX2-2.5-12N，上海一恒科技有限公司，中國）；電子分析天平（BSA224S，Sartorius，德國）；萬能試驗機（AI-7000-S，GOTECH，中國）；電子數顯卡尺（廣陸，中國）；雙功能氣浴恒溫振蕩器（ZD-85，常州金壇良友儀器有限公司，中國）；掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（JSM-6460，JEOL，日本）；精密 pH 計（PB-10，Sartorius，德國）；電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司，中國）；熱重（thermogravimetric，TG）分析儀（PYRIS 1 型，柏金-埃爾默公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（CX23，Olympus，日本）；二氧化碳恒溫培養箱（HF90，Healforce，中國）。
1.2 3D 打印 β-TCP 支架
首先將 β-TCP 粉末、聚甲基纖維素和聚丙烯酸銨按照質量比 50∶2∶1 配制成穩定均一的漿料。將制備好的 β-TCP 漿料填充到定制料筒中，置于打印機噴頭中進行打印。打印的填充間距為 0.8 mm，采用水平和垂直交錯填充的方式，打印的層厚為 0.32 mm，樣品的大小為 5.6 mm × 5.6 mm × 6 mm。
1.3 TG 分析
將 3D 打印制備好的 β-TCP 支架室溫風干 48 h，使用陶瓷研缽將其研碎成精細的粉末。采用 TG 分析儀對粉末進行分析，測試溫度范圍為室溫至 800℃，升溫速率為 10℃/min，在氮氣保護的環境下進行。
1.4 燒結工藝處理
將 3D 打印制備好的 β-TCP 支架室溫風干后放入箱式電阻爐中進行燒結，采用兩段燒結的方法，首先以 5℃/min 的升溫速率將支架加熱到預燒結溫度，保溫 1 h；然后將支架以相同的升溫速率加熱到燒結溫度 1 000～1 200℃，保溫 2 h；最后隨爐冷卻至 100℃ 以下，取出支架。
1.5 SEM 觀察
將燒結溫度 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架固定在樣品臺上，表面噴金處理。采用 SEM 進行觀察，設置掃描電壓為 15 kV，放大倍數為 10 000 倍，對不同燒結溫度制備的支架表面形貌進行觀察。
1.6 收縮率測試
使用電子分析天平稱量在室溫下風干 72 h 后的 3D 打印制備好的 β-TCP 支架質量（記為 W1），對應支架燒結后質量（記為 W2），相應的支架質量收縮率（記為 ηW）如式（1）所示：
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同理，用電子數顯卡尺測量燒結前后支架的長、寬、高，計算支架燒結前體積（記為 V1），對應支架燒結后體積（記為 V2），相應的支架體積收縮率（記為 ηV）如式（2）所示：
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1.7 孔隙率測試
使用密度法測量支架的孔隙率[12]。支架的質量（記為 W），體積（記為 V）。支架的密度（記為 ρ1）如式（3）所示：
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若已知支架材料的密度（記為 ρ2），則孔隙率（記為 ε）如式（4）所示：
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其中，支架材料 β-TCP 的密度為 3.12 g/cm3（記為 ρ2）。
1.8 力學性能測試
使用萬能試驗機測試燒結溫度 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架力學強度，設置加載速度為 5 mm/min。采用電子數顯卡尺測量不同燒結溫度支架的尺寸并記錄。萬能試驗機在垂直方向對支架施加壓力直至支架碎裂，通過應力應變曲線得出支架的抗壓強度和壓縮模量。
1.9 降解性能測試
支架的初始干重記為 m1，將支架放入 15 mL 的離心管中，加入 2 mL 的檸檬酸緩沖液浸沒支架，做好標記后放入雙功能氣浴恒溫振蕩器中，溫度設置為 37℃，轉動速度設置為 130 r/min[13]。分別于第 24、48、72 h 后取出，去離子水沖洗干凈，烘干稱重記為 m2，計算剩余質量相對于原始質量的百分比（D）如式（5）所示：
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1.10 細胞活性檢測
取 500 μL 的 BMSCs 細胞懸浮液（1 × 105 個/mL）接種在 β-TCP 支架上，靜置于培養箱中（37℃，5%CO2）培養，共計 5 d，每隔 2 d 更換一次培養基。用活/死細胞活力檢測試劑盒檢測細胞在 β-TCP 支架上的存活情況，分別在第 1、3、5 d 取出 β-TCP 支架，用磷酸鹽緩沖液清洗支架 2～3 次，加入染色液，室溫下孵育 30 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察 β-TCP 支架上細胞的狀態。
1.11 統計分析
采用統計產品與服務解決方案（Statistical Product and Service Solutions，SPSS）17.0 軟件進行統計學分析。所有數據以平均值 ± 標準差表示，測試樣本不少于 3 個。使用 t 檢驗對數據進行分析，P < 0.05 表示差異具有統計學意義。
2 實驗結果與討論
2.1 TG 分析結果
支架 TG 分析結果如圖 1 所示，整個燒結過程有兩個失重階段，第一個階段發生在從室溫升溫至 100℃ 的溫度范圍內，質量損失在 2% 左右；第二個階段發生在 200～400℃ 的溫度范圍內，質量損失接近 12%；溫度升到 400℃ 以后，支架質量幾乎保持不變。因此支架的預燒結溫度設置為 400℃，升溫速率設置為 5℃/min，防止因為升溫速度過快產生的熱應力導致支架發生開裂，并在預燒結溫度 400℃ 時保溫 1 h，目的是去除所有雜質[14]。由于 TCP 主要分為低溫 β 相（β-TCP）和高溫 α 相（α-TCP），1 200℃ 以上會發生相的轉變，所以最高燒結溫度設置為 1 200℃[15]。
圖1
β-TCP 支架的 TG 曲線
Figure1.
TG curve of β-TCP scaffold
2.2 燒結溫度對支架形貌的影響
如圖 2 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架的宏觀結構。不同燒結溫度的支架與未燒結支架相比，體積均有明顯收縮；隨著燒結溫度從 1 000～1 150℃，支架的體積逐漸減少；而當溫度從 1 150～1 200℃ 時，支架的體積又有所增大，這說明燒結溫度的不同會導致材料內部晶粒之間的孔隙不同，從而影響支架的體積。
圖2
不同燒結溫度制備的支架宏觀照片
Figure2.
Image of scaffolds with different sintering temperature
如圖 3 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架的 SEM 圖。干燥后未燒結的支架，其微觀形貌顯示晶粒細小密集；當燒結溫度為 1 000℃ 時制備的支架，其中部分晶粒已經出現粘結，顆粒之間氣孔較大；當燒結溫度升高到 1 050℃ 和 1 100℃ 時，晶粒長大，晶界移動使相鄰的晶粒粘結，晶粒之間的氣孔逐漸減小；當燒結溫度升高到 1 150℃ 時，晶粒完全長大，晶粒之間幾乎沒有氣孔；當溫度升高到 1 200℃ 時，晶粒之間的氣孔反而比 1 150℃ 多。
圖3
不同燒結溫度制備的支架 SEM 圖
Figure3.
SEM images of scaffolds with different sintering temperature
在燒結溫度達到 400℃ 時，材料中的有機物都已被完全去除，所以在燒結溫度高于 1 000℃ 時，只是 β-TCP 晶粒長大和晶體移動的過程[7]。在這個過程中，晶粒生長和晶界移動使晶粒發生粘結，導致氣孔率下降；在 1 150℃ 時晶粒得到最大生長，晶粒之間的氣孔最小，當燒結溫度從 1 150℃ 升高到 1 200℃，大晶粒會二次結晶，吞并周圍的小晶粒生長，使得氣孔被包裹在晶粒內部，導致支架的氣孔率增加[16]。
2.3 燒結溫度對支架質量和體積收縮率的影響
生物陶瓷的燒結過程會伴隨其質量和體積的收縮。如圖 4 左圖所示，燒結溫度從 1 000～1 200℃，質量收縮率的范圍在 18.8% ± 0.9%～20.74% ± 1.7% 之間，支架質量的收縮是支架中水分和有機物的去除所致，差異不具有統計學意義（P > 0.05）。如圖 4 右圖所示，燒結溫度從 1 000～1 200℃，體積收縮率的范圍在 16.41% ± 0.86%～55.06% ± 0.38% 之間。燒結溫度從 1 000～1 150℃，支架的體積收縮率逐漸升高，差異具有統計學意義（P < 0.05）；而當燒結溫度從 1 150～1 200℃ 時，支架的體積收縮率有所下降，差異不具有統計學意義（P > 0.05）。
圖4
不同燒結溫度制備的支架質量和體積收縮率（*P < 0.05）
Figure4.
The mass and volume shrinkage of scaffolds with different sintering temperature (*P < 0.05)
2.4 燒結溫度對支架孔隙率的影響
如圖 5 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架的孔隙率。燒結溫度為 1 000℃ 時孔隙率最大，為 74.07% ± 0.55%；當燒結溫度升高到 1 150℃ 時，孔隙率最小，為 54.94% ± 0.79%；在燒結溫度從 1 000～1 150℃ 的溫度區間，支架的孔隙率呈遞減趨勢，差異具有統計學意義（P < 0.05），而燒結溫度為 1 150℃ 和 1 200℃ 的支架孔隙率差異不具有統計學意義（P > 0.05）。燒結過程中支架的體積收縮是材料晶粒之間氣孔的變化所致，支架孔隙率的差異是支架體積收縮率的變化所致，所以支架在 1 150℃ 時體積收縮率最大，為 55.06% ± 0.38%；孔隙率最小，為 54.94% ± 0.79%。而文獻報道，人體松質骨孔隙率在 30%～90% 范圍之內[17]，因此本文制備支架可滿足此指標范圍。
圖5
不同燒結溫度制備的支架的孔隙率（*P < 0.05）
Figure5.
The porosity of scaffolds with different sintering tem perature (*P < 0.05)
2.5 燒結溫度對支架力學強度的影響
如圖 6 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架的抗壓強度和壓縮模量。抗壓強度和壓縮模量的變化與孔隙率的變化呈相反的趨勢，燒結溫度在 1 000～1 150℃ 之間時，隨著燒結溫度的升高，支架的抗壓強度和壓縮模量升高；而燒結溫度從 1 150～1 200℃ 變化時，支架的抗壓強度和壓縮模量下降。因此，燒結溫度為 1 150℃ 時力學性能達到最優，抗壓強度為（6.52 ± 0.84）MPa，相比于 1 000℃ 和 1 050℃ 提高了接近 2.5 倍，差異具有統計學意義（P < 0.05）；壓縮模量為（100.08 ± 18.6）MPa，這符合人體松質骨力學性能的要求（抗壓強度 2～12 MPa，壓縮模量 50～500 MPa）[17-18]。
圖6
不同燒結溫度制備的支架的力學性能（*P < 0.05）
Figure6.
Mechanical properties of scaffolds with different sintering temperature (*P < 0.05)
2.6 燒結溫度對支架降解性能的影響
研究表明，β-TCP 的生物降解主要有在體液中溶解和被破骨細胞吞噬消化這兩種途徑[19]。趙娜如等[20]研究 β-TCP 在模擬體液中的降解情況，結果表明 β-TCP 浸泡在模擬體液 20 d 后幾乎沒有溶解。由于植入區的組織液中含有一些酸性代謝產物（檸檬酸鹽、乳酸鹽等）會造成局部弱酸性的環境，陸華等[21]將材料浸泡在 37℃ 下 pH 值為 3.0 ± 0.2 的檸檬酸緩沖液中研究 β-TCP 的降解情況，結果表明 β-TCP 多孔生物陶瓷在體外能夠被降解，其降解的成分主要是鈣和磷。本研究將燒結溫度 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架浸泡在磷酸鹽緩沖液中，結果表明不同燒結溫度制備的 β-TCP 支架浸泡在磷酸鹽緩沖液 30 d 幾乎沒有降解，無法比較不同燒結溫度支架降解性能的差異；而后將材料浸泡在 pH 值為 3.0 ± 0.2 的檸檬酸緩沖液中，進一步探究不同燒結溫度的 β-TCP 支架的降解情況。
如圖 7 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架在 pH = 3.0 ± 0.2 的檸檬酸緩沖液中的降解情況。從圖中可以看出，燒結溫度為 1 000℃ 的支架降解相對最快，在第 3 d 時質量損失達到 49.65%；而燒結溫度為 1 150℃ 的支架降解相對最慢，第 3 d 時質量損失為 37.98%；在燒結溫度為 1 000～1 150℃ 的區間內，支架的降解速度隨溫度的升高而降低；相對于 1 150℃ 燒結的支架，1 200℃ 燒結的支架降解速度增快。結果表明，燒結溫度為 1 150℃ 的支架降解速度最慢，這是由于該燒結溫度的支架具有相對更小的體積、更低的孔隙率以及更優異的力學性能。
圖7
不同燒結溫度制備的支架的降解
Figure7.
The degradation of scaffolds with different sintering temperature
2.7 支架對 BMSCs 細胞活性的影響
如圖 8 所示是 BMSCs 在 β-TCP 支架上第 1、3、5 d 的形態分布圖。在第 1 d 時，有大量的活細胞黏附在支架上；到第 3 d，細胞生長旺盛，已有大量增殖；到第 5 d，細胞鋪滿整個支架表面，連成片狀，排列緊密，多層疊加。由此可見，燒結后的 3D 打印制備的 β-TCP 支架能夠支持 BMSCs 細胞黏附和快速生長，支架具有良好的生物相容性，可為細胞的生長和增殖提供一個 3D 平臺，這有利于植入體內后引導骨組織細胞的快速黏附和增殖。
圖8
BMSCs 在支架中形態分布
Figure8.
BMSCs cellular morphology on scaffolds
3 結論
本文通過 3D 打印制備了具有內部連通網格結構的 β-TCP 骨組織工程支架。為了提高支架的力學強度，本文對支架的燒結工藝展開詳細研究，首先通過熱重分析得到支架的預燒結溫度，而后采用兩段燒結的方法對其燒結，檢測不同燒結溫度下支架的表觀形貌、孔隙率、力學性能以及降解性能等，得出最佳的燒結溫度為 1 150℃。在該溫度下，材料的晶粒生長充分、氣孔最少，因此得到的支架具有致密的結構和優良的力學性能。此外，支架還能夠支持 BMSCs 細胞的黏附和快速生長，具有良好的生物相容性，有望在承重骨的修復中得到廣泛應用。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）是一種可降解的生物陶瓷，具有良好的生物相容性、生物活性以及生物降解性，是理想的人體骨組織修復和替代材料[1]。通過三維（three-dimensional，3D）打印 TCP 生物陶瓷，可以得到定制的 3D 宏觀結構以及精確控制的內部孔隙結構，有利于營養物質的運輸和新骨的長成，因此在骨組織工程領域已得到廣泛的應用[2-3]。然而，3D 打印的 TCP 支架存在脆性大、抗壓強度低以及力學性能不足等問題，在一定程度上限制了其在承重骨上的應用[4]。因此，如何提高 3D 打印 TCP 支架的力學強度現已成為骨組織修復材料研究領域的熱點問題之一。
研究表明，通過優化燒結工藝可以有效改善生物陶瓷的力學性能[5]。目前已有的燒結技術有放電等離子燒結、微波燒結、超高壓燒結、反應熱壓燒結、兩步燒結和熱等靜壓燒結等[6-7]。每種燒結技術都有其各自的優缺點，需要選擇合適的燒結技術才能獲得性能優異的生物陶瓷支架。例如，Mazaheri 等[8]采用兩步燒結的方式燒結羥基磷灰石（hydroxyapatite，HAP），將 HAP 快速升溫到燒結溫度以上抑制晶粒增長，在晶粒變大之前就開始急劇降溫至燒結溫度，然后恒溫抑制晶界遷移，得到較小的晶粒，結果表明燒結出的 HAP 晶粒尺寸為 190 nm，力學強度為（1.92 ± 0.2）MPa。周奎[9]采用箱式爐對 HAP 支架進行兩段燒結，首先以 5℃/min 的升溫速率將支架加熱至預燒結溫度，保溫 1 h；然后將支架以相同的升溫速率加熱到燒結溫度，保溫 2 h，以確保去除雜質；燒結完成的支架結構完整、無變形和開裂現象。生物陶瓷的燒結過程非常復雜，影響燒結的因素很多，材料的化學成分、物理特性、燒結的溫度與燒結時間等均會對其力學性能產生影響[10]。Isa 等[11]研究發現，燒結溫度的不同會導致材料的密度、比表面積以及晶粒尺寸不同，從而導致力學性能不同。目前對于生物陶瓷燒結工藝的研究大部分都集中在 HAP 材料，關于燒結工藝對 3D 打印 TCP 支架力學性能的影響還沒有詳細的研究。
基于以上原因，本研究通過 3D 打印技術制備具有連通網格結構的 TCP 支架，采用兩段燒結的方法對其進行燒結，通過檢測不同燒結溫度下支架的表觀形貌、質量和體積收縮率、孔隙率、力學性能以及降解性能等，研究燒結工藝對其力學性能的影響，從而得到最適合 TCP 支架的燒結工藝。然后，本文進一步在支架上接種骨髓間充質干細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs），結果表明細胞在支架上能夠很好地黏附和生長，支架具有良好的生物相容性。本研究優化了 3D 打印 TCP 支架的燒結工藝，提高了其力學性能，為其作為承重骨的應用奠定了基礎。
1 材料與方法
1.1 試劑以及儀器
本研究主要試劑：β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate，β-TCP）（南京埃普瑞，中國）；聚丙烯酸銨（上海宛道，中國）；聚甲基纖維素（Sigma，美國）；檸檬酸鈉（源葉生物，中國）；無水檸檬酸（源葉生物，中國）；磷酸鹽緩沖液（Multicell，美國）；杜氏改良伊格爾培養基（Dulbecco's modified Eagle’s medium，DMEM）高糖培養基（Gibco，美國）；胎牛血清（Multicell，美國）；青霉素/鏈霉素（天津灝洋，中國）；活/死細胞活力檢測試劑盒（南京凱基，中國）。
本研究主要儀器設備：生物 3D 打印機（Bio-Architect，Regenovo，中國）；箱式電阻爐（SX2-2.5-12N，上海一恒科技有限公司，中國）；電子分析天平（BSA224S，Sartorius，德國）；萬能試驗機（AI-7000-S，GOTECH，中國）；電子數顯卡尺（廣陸，中國）；雙功能氣浴恒溫振蕩器（ZD-85，常州金壇良友儀器有限公司，中國）；掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（JSM-6460，JEOL，日本）；精密 pH 計（PB-10，Sartorius，德國）；電熱鼓風干燥箱（上海博迅實業有限公司，中國）；熱重（thermogravimetric，TG）分析儀（PYRIS 1 型，柏金-埃爾默公司，美國）；倒置熒光顯微鏡（CX23，Olympus，日本）；二氧化碳恒溫培養箱（HF90，Healforce，中國）。
1.2 3D 打印 β-TCP 支架
首先將 β-TCP 粉末、聚甲基纖維素和聚丙烯酸銨按照質量比 50∶2∶1 配制成穩定均一的漿料。將制備好的 β-TCP 漿料填充到定制料筒中，置于打印機噴頭中進行打印。打印的填充間距為 0.8 mm，采用水平和垂直交錯填充的方式，打印的層厚為 0.32 mm，樣品的大小為 5.6 mm × 5.6 mm × 6 mm。
1.3 TG 分析
將 3D 打印制備好的 β-TCP 支架室溫風干 48 h，使用陶瓷研缽將其研碎成精細的粉末。采用 TG 分析儀對粉末進行分析，測試溫度范圍為室溫至 800℃，升溫速率為 10℃/min，在氮氣保護的環境下進行。
1.4 燒結工藝處理
將 3D 打印制備好的 β-TCP 支架室溫風干后放入箱式電阻爐中進行燒結，采用兩段燒結的方法，首先以 5℃/min 的升溫速率將支架加熱到預燒結溫度，保溫 1 h；然后將支架以相同的升溫速率加熱到燒結溫度 1 000～1 200℃，保溫 2 h；最后隨爐冷卻至 100℃ 以下，取出支架。
1.5 SEM 觀察
將燒結溫度 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架固定在樣品臺上，表面噴金處理。采用 SEM 進行觀察，設置掃描電壓為 15 kV，放大倍數為 10 000 倍，對不同燒結溫度制備的支架表面形貌進行觀察。
1.6 收縮率測試
使用電子分析天平稱量在室溫下風干 72 h 后的 3D 打印制備好的 β-TCP 支架質量（記為 W1），對應支架燒結后質量（記為 W2），相應的支架質量收縮率（記為 ηW）如式（1）所示：
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同理，用電子數顯卡尺測量燒結前后支架的長、寬、高，計算支架燒結前體積（記為 V1），對應支架燒結后體積（記為 V2），相應的支架體積收縮率（記為 ηV）如式（2）所示：
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1.7 孔隙率測試
使用密度法測量支架的孔隙率[12]。支架的質量（記為 W），體積（記為 V）。支架的密度（記為 ρ1）如式（3）所示：
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若已知支架材料的密度（記為 ρ2），則孔隙率（記為 ε）如式（4）所示：
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其中，支架材料 β-TCP 的密度為 3.12 g/cm3（記為 ρ2）。
1.8 力學性能測試
使用萬能試驗機測試燒結溫度 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架力學強度，設置加載速度為 5 mm/min。采用電子數顯卡尺測量不同燒結溫度支架的尺寸并記錄。萬能試驗機在垂直方向對支架施加壓力直至支架碎裂，通過應力應變曲線得出支架的抗壓強度和壓縮模量。
1.9 降解性能測試
支架的初始干重記為 m1，將支架放入 15 mL 的離心管中，加入 2 mL 的檸檬酸緩沖液浸沒支架，做好標記后放入雙功能氣浴恒溫振蕩器中，溫度設置為 37℃，轉動速度設置為 130 r/min[13]。分別于第 24、48、72 h 后取出，去離子水沖洗干凈，烘干稱重記為 m2，計算剩余質量相對于原始質量的百分比（D）如式（5）所示：
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1.10 細胞活性檢測
取 500 μL 的 BMSCs 細胞懸浮液（1 × 105 個/mL）接種在 β-TCP 支架上，靜置于培養箱中（37℃，5%CO2）培養，共計 5 d，每隔 2 d 更換一次培養基。用活/死細胞活力檢測試劑盒檢測細胞在 β-TCP 支架上的存活情況，分別在第 1、3、5 d 取出 β-TCP 支架，用磷酸鹽緩沖液清洗支架 2～3 次，加入染色液，室溫下孵育 30 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察 β-TCP 支架上細胞的狀態。
1.11 統計分析
采用統計產品與服務解決方案（Statistical Product and Service Solutions，SPSS）17.0 軟件進行統計學分析。所有數據以平均值 ± 標準差表示，測試樣本不少于 3 個。使用 t 檢驗對數據進行分析，P < 0.05 表示差異具有統計學意義。
2 實驗結果與討論
2.1 TG 分析結果
支架 TG 分析結果如圖 1 所示，整個燒結過程有兩個失重階段，第一個階段發生在從室溫升溫至 100℃ 的溫度范圍內，質量損失在 2% 左右；第二個階段發生在 200～400℃ 的溫度范圍內，質量損失接近 12%；溫度升到 400℃ 以后，支架質量幾乎保持不變。因此支架的預燒結溫度設置為 400℃，升溫速率設置為 5℃/min，防止因為升溫速度過快產生的熱應力導致支架發生開裂，并在預燒結溫度 400℃ 時保溫 1 h，目的是去除所有雜質[14]。由于 TCP 主要分為低溫 β 相（β-TCP）和高溫 α 相（α-TCP），1 200℃ 以上會發生相的轉變，所以最高燒結溫度設置為 1 200℃[15]。
圖1
β-TCP 支架的 TG 曲線
Figure1.
TG curve of β-TCP scaffold
2.2 燒結溫度對支架形貌的影響
如圖 2 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架的宏觀結構。不同燒結溫度的支架與未燒結支架相比，體積均有明顯收縮；隨著燒結溫度從 1 000～1 150℃，支架的體積逐漸減少；而當溫度從 1 150～1 200℃ 時，支架的體積又有所增大，這說明燒結溫度的不同會導致材料內部晶粒之間的孔隙不同，從而影響支架的體積。
圖2
不同燒結溫度制備的支架宏觀照片
Figure2.
Image of scaffolds with different sintering temperature
如圖 3 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架的 SEM 圖。干燥后未燒結的支架，其微觀形貌顯示晶粒細小密集；當燒結溫度為 1 000℃ 時制備的支架，其中部分晶粒已經出現粘結，顆粒之間氣孔較大；當燒結溫度升高到 1 050℃ 和 1 100℃ 時，晶粒長大，晶界移動使相鄰的晶粒粘結，晶粒之間的氣孔逐漸減小；當燒結溫度升高到 1 150℃ 時，晶粒完全長大，晶粒之間幾乎沒有氣孔；當溫度升高到 1 200℃ 時，晶粒之間的氣孔反而比 1 150℃ 多。
圖3
不同燒結溫度制備的支架 SEM 圖
Figure3.
SEM images of scaffolds with different sintering temperature
在燒結溫度達到 400℃ 時，材料中的有機物都已被完全去除，所以在燒結溫度高于 1 000℃ 時，只是 β-TCP 晶粒長大和晶體移動的過程[7]。在這個過程中，晶粒生長和晶界移動使晶粒發生粘結，導致氣孔率下降；在 1 150℃ 時晶粒得到最大生長，晶粒之間的氣孔最小，當燒結溫度從 1 150℃ 升高到 1 200℃，大晶粒會二次結晶，吞并周圍的小晶粒生長，使得氣孔被包裹在晶粒內部，導致支架的氣孔率增加[16]。
2.3 燒結溫度對支架質量和體積收縮率的影響
生物陶瓷的燒結過程會伴隨其質量和體積的收縮。如圖 4 左圖所示，燒結溫度從 1 000～1 200℃，質量收縮率的范圍在 18.8% ± 0.9%～20.74% ± 1.7% 之間，支架質量的收縮是支架中水分和有機物的去除所致，差異不具有統計學意義（P > 0.05）。如圖 4 右圖所示，燒結溫度從 1 000～1 200℃，體積收縮率的范圍在 16.41% ± 0.86%～55.06% ± 0.38% 之間。燒結溫度從 1 000～1 150℃，支架的體積收縮率逐漸升高，差異具有統計學意義（P < 0.05）；而當燒結溫度從 1 150～1 200℃ 時，支架的體積收縮率有所下降，差異不具有統計學意義（P > 0.05）。
圖4
不同燒結溫度制備的支架質量和體積收縮率（*P < 0.05）
Figure4.
The mass and volume shrinkage of scaffolds with different sintering temperature (*P < 0.05)
2.4 燒結溫度對支架孔隙率的影響
如圖 5 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架的孔隙率。燒結溫度為 1 000℃ 時孔隙率最大，為 74.07% ± 0.55%；當燒結溫度升高到 1 150℃ 時，孔隙率最小，為 54.94% ± 0.79%；在燒結溫度從 1 000～1 150℃ 的溫度區間，支架的孔隙率呈遞減趨勢，差異具有統計學意義（P < 0.05），而燒結溫度為 1 150℃ 和 1 200℃ 的支架孔隙率差異不具有統計學意義（P > 0.05）。燒結過程中支架的體積收縮是材料晶粒之間氣孔的變化所致，支架孔隙率的差異是支架體積收縮率的變化所致，所以支架在 1 150℃ 時體積收縮率最大，為 55.06% ± 0.38%；孔隙率最小，為 54.94% ± 0.79%。而文獻報道，人體松質骨孔隙率在 30%～90% 范圍之內[17]，因此本文制備支架可滿足此指標范圍。
圖5
不同燒結溫度制備的支架的孔隙率（*P < 0.05）
Figure5.
The porosity of scaffolds with different sintering tem perature (*P < 0.05)
2.5 燒結溫度對支架力學強度的影響
如圖 6 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架的抗壓強度和壓縮模量。抗壓強度和壓縮模量的變化與孔隙率的變化呈相反的趨勢，燒結溫度在 1 000～1 150℃ 之間時，隨著燒結溫度的升高，支架的抗壓強度和壓縮模量升高；而燒結溫度從 1 150～1 200℃ 變化時，支架的抗壓強度和壓縮模量下降。因此，燒結溫度為 1 150℃ 時力學性能達到最優，抗壓強度為（6.52 ± 0.84）MPa，相比于 1 000℃ 和 1 050℃ 提高了接近 2.5 倍，差異具有統計學意義（P < 0.05）；壓縮模量為（100.08 ± 18.6）MPa，這符合人體松質骨力學性能的要求（抗壓強度 2～12 MPa，壓縮模量 50～500 MPa）[17-18]。
圖6
不同燒結溫度制備的支架的力學性能（*P < 0.05）
Figure6.
Mechanical properties of scaffolds with different sintering temperature (*P < 0.05)
2.6 燒結溫度對支架降解性能的影響
研究表明，β-TCP 的生物降解主要有在體液中溶解和被破骨細胞吞噬消化這兩種途徑[19]。趙娜如等[20]研究 β-TCP 在模擬體液中的降解情況，結果表明 β-TCP 浸泡在模擬體液 20 d 后幾乎沒有溶解。由于植入區的組織液中含有一些酸性代謝產物（檸檬酸鹽、乳酸鹽等）會造成局部弱酸性的環境，陸華等[21]將材料浸泡在 37℃ 下 pH 值為 3.0 ± 0.2 的檸檬酸緩沖液中研究 β-TCP 的降解情況，結果表明 β-TCP 多孔生物陶瓷在體外能夠被降解，其降解的成分主要是鈣和磷。本研究將燒結溫度 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架浸泡在磷酸鹽緩沖液中，結果表明不同燒結溫度制備的 β-TCP 支架浸泡在磷酸鹽緩沖液 30 d 幾乎沒有降解，無法比較不同燒結溫度支架降解性能的差異；而后將材料浸泡在 pH 值為 3.0 ± 0.2 的檸檬酸緩沖液中，進一步探究不同燒結溫度的 β-TCP 支架的降解情況。
如圖 7 所示為燒結溫度從 1 000～1 200℃ 制備的 β-TCP 支架在 pH = 3.0 ± 0.2 的檸檬酸緩沖液中的降解情況。從圖中可以看出，燒結溫度為 1 000℃ 的支架降解相對最快，在第 3 d 時質量損失達到 49.65%；而燒結溫度為 1 150℃ 的支架降解相對最慢，第 3 d 時質量損失為 37.98%；在燒結溫度為 1 000～1 150℃ 的區間內，支架的降解速度隨溫度的升高而降低；相對于 1 150℃ 燒結的支架，1 200℃ 燒結的支架降解速度增快。結果表明，燒結溫度為 1 150℃ 的支架降解速度最慢，這是由于該燒結溫度的支架具有相對更小的體積、更低的孔隙率以及更優異的力學性能。
圖7
不同燒結溫度制備的支架的降解
Figure7.
The degradation of scaffolds with different sintering temperature
2.7 支架對 BMSCs 細胞活性的影響
如圖 8 所示是 BMSCs 在 β-TCP 支架上第 1、3、5 d 的形態分布圖。在第 1 d 時，有大量的活細胞黏附在支架上；到第 3 d，細胞生長旺盛，已有大量增殖；到第 5 d，細胞鋪滿整個支架表面，連成片狀，排列緊密，多層疊加。由此可見，燒結后的 3D 打印制備的 β-TCP 支架能夠支持 BMSCs 細胞黏附和快速生長，支架具有良好的生物相容性，可為細胞的生長和增殖提供一個 3D 平臺，這有利于植入體內后引導骨組織細胞的快速黏附和增殖。
圖8
BMSCs 在支架中形態分布
Figure8.
BMSCs cellular morphology on scaffolds
3 結論
本文通過 3D 打印制備了具有內部連通網格結構的 β-TCP 骨組織工程支架。為了提高支架的力學強度，本文對支架的燒結工藝展開詳細研究，首先通過熱重分析得到支架的預燒結溫度，而后采用兩段燒結的方法對其燒結，檢測不同燒結溫度下支架的表觀形貌、孔隙率、力學性能以及降解性能等，得出最佳的燒結溫度為 1 150℃。在該溫度下，材料的晶粒生長充分、氣孔最少，因此得到的支架具有致密的結構和優良的力學性能。此外，支架還能夠支持 BMSCs 細胞的黏附和快速生長，具有良好的生物相容性，有望在承重骨的修復中得到廣泛應用。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
