本文旨在探究三氧化二砷（As2O3）對肝癌細胞 HepG2 作用的最佳濃度，以及此濃度 As2O3 對 HepG2 細胞遷移、侵襲和凋亡的影響。本研究采用 CCK-8 法檢驗 0、1、2、4、8、16、32 μmol/L As2O3 處理后 HepG2 細胞活力，計算半抑制濃度（IC50），并且觀察 IC50 濃度 As2O3 作用 12、24、48 h 后 HepG2 細胞形態變化。通過傷口愈合實驗和 Transwell 侵襲實驗驗證 As2O3 對細胞遷移侵襲能力的影響。Western blot 和 qRT-PCR 實驗檢測 As2O3 對細胞遷移、侵襲及凋亡相關蛋白和基因表達水平的影響。結果顯示，與對照組相比，HepG2 細胞活力隨 As2O3 處理濃度的升高而降低，呈現劑量依懶性，其 IC50 為 7.3 μmol/L；8 μmol/L As2O3 處理 24 h 后，HepG2 細胞發生明顯凋亡，且其遷移和侵襲能力顯著降低；此外，細胞中 RhoA、Cdc42、Rac1、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）蛋白表達水平下調，抑凋亡基因 Bcl-2 的蛋白和 mRNA 表達水平顯著下調，而促凋亡基因 Bax、Caspase-3 的蛋白和 mRNA 表達水平顯著上調。以上結果說明一定濃度的 As2O3 能夠抑制肝癌細胞遷移和侵襲，促進肝癌細胞凋亡。
引用本文： 何佳, 許博聞, 高文博, 蘇冠月, 余泓池, 沈陽, 劉肖珩. 三氧化二砷對肝癌細胞HepG2遷移、侵襲和凋亡的影響. 生物醫學工程學雜志, 2020, 37(1): 105-111. doi: 10.7507/1001-5515.201907044 復制
引言
原發性肝癌是一種嚴重威脅人們健康并造成大量死亡的惡性腫瘤，具有發展快、預后差、易復發和病死率高等特點[1-2]。據統計數據顯示，在我國，每年有 40 多萬人死于肝癌，其病死率僅次于肺癌和胃癌[3-4]。由于肝癌細胞極易發生遷移和侵襲，手術切除、介入治療、局部消融及肝移植等目前常見的肝癌治療方法，其治療效果差且術后易復發[5-6]。因此，抑制肝癌侵襲轉移是當前肝癌治療的主攻方向之一。
腫瘤治療最大的障礙就是腫瘤細胞容易發生侵襲轉移[7]。腫瘤細胞侵襲轉移的發生是一個非常復雜的過程，是多基因、多因素、多步驟的生物學行為。在腫瘤細胞發生浸潤侵襲的過程中，其胞外基底膜的降解是一個重要環節[8]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一組含 Zn2+的能降解細胞外基質的蛋白酶，在正常組織中，MMPs 表達極少，在損傷和各種癌變組織中變得活躍[9]。研究表明，在多種具有侵襲性和高轉移性的腫瘤中都觀察到基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達增高，其通過參與腫瘤黏附、血管侵入等過程促進腫瘤細胞發生侵襲[10]。在腫瘤細胞發生轉移的過程中，其細胞骨架的重構發揮重要作用[11]。研究表明，Rho GTPases（Rac1、RhoA、Cdc42）蛋白通過誘導局部肌動蛋白聚集從而分別促進應力纖維、板狀偽足和絲狀偽足的形成，進而調控細胞的遷移行為[12]。其中，Rac1 促進板狀偽足和膜皺褶的形成，給細胞提供一個向前的牽引力；RhoA 主要通過調控細胞尾部應力纖維的形成和黏著斑的解聚，促進細胞收縮從而促進細胞遷移；Cdc42 則與絲狀偽足的形成密切相關，進而調控細胞極性和遷移方向[11, 13]。故而抑制金屬蛋白酶和 Rho GTPases 能有效降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，從而能夠有效抑制腫瘤細胞的轉移，控制腫瘤的進展。
三氧化二砷（As2O3）是一種有效的白血病及其他實體瘤的治療藥物，具有廣泛的抗腫瘤效應[14]。有研究表明，As2O3 可以通過改變腫瘤細胞活性氧生成以及抑制腫瘤血管生成等途徑誘導肺癌、胃癌、骨肉瘤等腫瘤細胞的凋亡，并抑制乳腺癌、淋巴瘤等腫瘤細胞的增殖[15-17]。肝臟作為有毒物質的代謝場所，亦是As2O3甲基化代謝的主要場所[18]，故而 As2O3 對肝癌是否有抑制作用及其相關的分子機制是一個值得深入探索的問題。已有大量研究表明 As2O3 可促進肝癌細胞凋亡[19]，但鮮少有 As2O3 對肝癌細胞遷移、侵襲及其相關分子機制的研究探索。本文全面探討了 As2O3 對肝癌 HepG2 細胞遷移、侵襲和凋亡的影響并進一步探索了其可能的分子機制，以期為臨床肝癌的治療和聯合用藥提供新的更為有效的方法。
1 材料與方法
1.1 材料
人肝細胞肝癌細胞株 HepG2 購自中科院生物化學與細胞生物學研究所；RPMI 1640 培養基和胰蛋白酶購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自上海復蒙生物科技有限公司；As2O3 購自美國 Sigma 公司；CCK-8 細胞活性檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和熒光定量 PCR 試劑盒購自日本 Takara 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒和超敏 ECL 化學發光試劑盒購自碧云天生物技術研究所。Cdc42、Rac1、RhoA、MMP-9 和 Caspase-3 兔單克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司；Bcl-2 和 Bax 兔單克隆抗體購自美國 Abcam 公司；GAPDH 鼠單克隆抗體購自北京中杉金橋有限公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
人肝癌細胞株 HepG2 細胞，用 5 mL 含 10% 胎牛血清的 1640 培養基于 37℃、飽和濕度、5% CO2 的恒溫細胞培養箱中培養，細胞呈單層貼壁生長，取狀態良好的對數期細胞進行后續實驗。
1.2.2 CCK-8 法檢測 As2O3 對 HepG2 半抑制濃度（IC50）
將對數生長期的 HepG2 細胞制成細胞懸液（1 × 106個/mL），以每孔 200 μL 加入 96 孔板中，在 37℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養 24 h 后，棄去培養液，每孔分別加入終濃度為 0、1、2、4、8、16、32 μmol/L As2O3 的 1640 完全培養基，并設置陰性對照組和只加培養基的空白對照組，每組設置 6 個平行孔，培養 24 h 后每孔加入 10 μL CCK-8 試劑，震蕩 10 min 后于細胞培養箱中繼續培養 2 h，酶標儀檢測 450 nm 波長處各孔 OD 值，并按以下公式計算 IC50：IC50 =（實驗組 ? 空白對照組）/（陰性對照組 ? 空白對照組）× 100%。根據 IC50 計算所得結果，我們選取 8 μmol/L As2O3 濃度進行后續實驗。
1.2.3 As2O3 作用不同時間對細胞形態學影響
以 1 × 106個/孔接種 HepG2 細胞于 6 孔板中，于 37℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養 24 h 后，棄去培養液，各孔加入 2 mL 終濃度為 8 μmol/L As2O3 的 1640 完全培養基，分別培養 12、24、48 h 后，置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍照。
1.2.4 劃痕實驗檢測遷移能力
接種 HepG2 細胞于六孔板中，加入 1640 完全培養基培養，待細胞融合度達 90% 時，對照組換成無血清 1640 培養基，實驗組更換成含終濃度為 8 μmol/L As2O3 的無血清 1640 培養基分別培養 24 h。用黃槍尖在單層細胞上劃出一個垂直損傷區，PBS 漂洗 3 次，洗掉刮下的細胞，將培養基更換成新鮮無血清 1640 培養基。分別于 0 h 和 48 h 在倒置相差顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照。
1.2.5 Transwell 檢測侵襲能力
取對數生長期 HepG2 細胞饑餓過夜，分別用無血清 1640 培養基和含 As2O3 的無血清 1640 培養基重懸制成單細胞懸液，各取 200 μL 單細胞懸液加入已鋪基底膜基質的 Transwell 上室中，下室加入 600 μL 含 10% 胎牛血清的 1640 完全培養基。37℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養 24 h 后，取出 Transwell 小室，PBS 漂洗 3 次后，加入 4% 多聚甲醛固定 10 min，用 1% 結晶紫染色 30 min。用棉簽輕輕擦去小室內部殘留細胞，倒置相差顯微鏡下拍照，隨機選取 5 個視野拍照，計數小室底面細胞個數。實驗重復 3 次。
1.2.6 Western blot 檢測細遷移、侵襲和凋亡相關蛋白表達
取對數生長期 HepG2 細胞，使用含終濃度為 8 μmol/L As2O3 的完全培養基培養 24 h，PBS 洗 3 次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的 RIPA 細胞裂解液，收集裂解液并置于冰上 30 min 使其充分裂解，12 000 g 冷凍離心 10 min，吸取上清于干凈的 EP 管中。BCA 法測定蛋白質濃度，后加入 Loading buffer 煮沸 8 min 使其充分變性。取等量蛋白（30 μg）加入上樣孔，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，電泳結束后將蛋白轉印到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂牛奶封閉 2 h 后孵育一抗，4℃ 過夜。TBST 洗 3 次，室溫孵育二抗 2 h，TBST 洗 3 次后 ECL 顯色，灰度分析處理并進行統計分析。
1.2.7 qRT-PCR 檢測細侵襲和凋亡相關基因表達
取對數生長期 HepG2 細胞，用含終濃度 8 μmol/L As2O3 的完全培養基培養 24 h，PBS 清洗 3 次后，按照試劑盒的操作步驟，提取細胞總 RNA，將其反轉錄為 cDNA（37℃ 15 min，85℃ 5 s）后完成 PCR 熒光定量（Step 1：95℃ 30 s；Step 2：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環；Step 3：溶解曲線）。所用引物序列見表 1。
表1
qRT-PCR 所用引物信息
Table1.
Oligonucleotide primers used in qRT-PCR
1.3 統計學處理
實驗所有數據以均數 ± 標準差表示，采用 SSPS17.0 和 Graphpad prism 5 軟件進行統計學分析，P < 0.05 則認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 As2O3 對 HepG2 細胞 IC50 測定
我們采用 CCK-8 細胞活力實驗檢測細胞活力變化，結果如圖 1 所示。隨著 As2O3 濃度升高，細胞活力逐步下降，As2O3 對 HepG2 細胞活力的影響呈現劑量依賴性，其 IC50 為 7.3 μmol/L。根據本實驗結果，我們選取 8 μmol/L As2O3 進行后續實驗。
圖1
As2O3 對 HepG2 細胞活力的影響
Figure1.
Effect of As2O3 on HepG2 cell activity
2.2 As2O3 對 HepG2 細胞凋亡的影響
用含終濃度 8 μmol/L As2O3 的完全培養基分別培養 HepG2 細胞 12、24、48 h 后，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。如圖 2 所示，隨著 As2O3 作用時間的延長，細胞的凋亡程度也逐漸增強，呈現一定的時間依賴性。HepG2 細胞的存活數目與對照組相比明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.05）。24 h 時 HepG2 細胞出現顯著凋亡；在 48 h 時細胞基本完全凋亡。據此，我們采用 8 μmol/L As2O3 作用 24 h 進行后續實驗，探索 As2O3 對肝癌細胞 HepG2 遷移和侵襲的影響。
圖2
As2O3 不同作用時間對 HepG2 細胞凋亡的影響（* P < 0.05）
Figure2.
Effect of As2O3 on HepG2 cell apoptosis (* P < 0.05)
2.3 As2O3 對 HepG2 細胞遷移能力的影響
利用細胞劃痕實驗檢測 As2O3 對 HepG2 細胞遷移能力的影響。如圖 3 所示，與對照組相比，使用 8 μmol/L As2O3 提前處理 HepG2 細胞，48 h 后，其遷移距離與對照組相比明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.05），說明一定濃度的 As2O3 可以抑制肝癌細胞 HepG2 遷移。為了進一步驗證 As2O3 對于肝癌細胞遷移能力的影響。我們采用 Western blot 實驗檢測了遷移相關蛋白的表達。如圖 4 所示，使用 8 μmol/L As2O3 作用 24 h 后，與對照組相比，HepG2 細胞中遷移相關蛋白 Cdc42、RhoA、Rac1 的表達水平均顯著下調（P < 0.05），進一步說明 As2O3 可以抑制肝癌細胞遷移。
圖3
As2O3 抑制 HepG2 細胞遷移（* P < 0.05）
Figure3.
Inhibition of HepG2 cell migration by As2O3 (* P < 0.05)
圖4
As2O3 抑制 Cdc42、RhoA、Rac1 蛋白表達（* P < 0.05）
Figure4.
Inhibition of Cdc42, RhoA and Rac1 protein expression by As2O3 (* P < 0.05)
2.4 As2O3 對 HepG2 細胞侵襲能力的影響
我們分別采用 Western blot 實驗和 qRT-PCR 實驗檢測了各組細胞中侵襲相關蛋白 MMP-9 的蛋白和基因表達。結果如圖 5 顯示，與對照組相比，MMP-9 蛋白和 mRNA 表達水平均顯著下調（P < 0.05）。利用 Transwell 實驗檢測 As2O3 對 HepG2 細胞侵襲能力的影響。結果如圖 6 所示，8 μmol/L As2O3 作用 24 h 后，HepG2 細胞的侵襲數目與對照組相比明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.05），說明一定濃度的 As2O3 可以抑制肝癌細胞 HepG2 的侵襲能力。
圖5
As2O3 抑制 MMP-9 蛋白和 mRNA 表達量（* P < 0.05）
Figure5.
Inhibition of MMP-9 protein and mRNA expression by As2O3 (* P < 0.05)
圖6
As2O3 抑制 HepG2 細胞侵襲（* P < 0.05）
Figure6.
Inhibition of HepG2 cell invasion by As2O3 (* P < 0.05)
2.5 As2O3 對 HepG2 細胞凋亡相關蛋白和 mRNA 表達的影響
根據前述實驗結果，我們已知 As2O3 可以誘導肝癌細胞發生凋亡。為進一步驗證該結論，我們采用 qRT-PCR 和 Western blot 實驗分別檢測了 As2O3 作用前后肝癌細胞中凋亡相關基因和蛋白表達水平的變化情況。如圖 7 所示，用 8 μmol/L As2O3 處理 24 h 后，與對照組比，HepG2 細胞中促凋亡基因 Caspase-3、Bax 的 mRNA 表達水平均顯著上調（P < 0.05），而抑凋亡基因 Bcl-2 的 mRNA 表達水平則出現顯著下調（P < 0.05）。圖 8 是 HepG2 細胞中 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表達水平及統計圖，其結果與 mRNA 表達水平一致，說明 As2O3 可以促進肝癌細胞 HepG2 發生凋亡。
圖7
As2O3 抑制 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的 mRNA 表達水平 （*P < 0.05）
Figure7.
Inhibition of Caspase-3, Bax and Bcl-2 mRNA expression levels by As2O3 (* P < 0.05)
圖8
As2O3 抑制 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表達水平（* P < 0.05）
Figure8.
Inhibition of Caspase-3, Bax and Bcl-2 protein expression levels by As2O3 (* P < 0.05)
3 討論
腫瘤的發生發展是一個極其復雜的過程，單就基因或者信號傳遞的角度去理解和治療腫瘤相對比較困難，故而本研究側重于關注天然藥物對腫瘤的抑制和治療作用。眾所周知，腫瘤治療中的最大障礙在于腫瘤細胞容易發生侵襲和轉移[20-21]。腫瘤細胞的遷移、侵襲、轉移是一個非常復雜的多步驟的生物學過程，受到多基因、多因素、多行為的調控，而降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力則能夠有效抑制腫瘤細胞的轉移，進而控制腫瘤的進展。
近年來研究表明，As2O3 不僅對白血病療效顯著，對肺癌、胃癌、骨肉瘤等亦有明顯療效[14-16, 22]。肝臟作為有毒物質的代謝場所，亦是 As2O3 甲基化代謝的主要場所，故而 As2O3 對肝癌是否有抑制作用及其相關的分子機制是我們深入探索的問題。本研究中，我們發現 As2O3 能夠顯著降低 HepG2 細胞的遷移能力（見圖 3），且下調 HepG2 細胞中 Rac1、RhoA 及 Cdc42 的蛋白表達水平（見圖 4），說明 As2O3 有利于抑制肝癌細胞 HepG2 的遷移。而 Lu 等[23]研究認為 As2O3 是通過抑制 RhoC 蛋白的表達抑制肝癌細胞 HepG2 的遷移，而 RhoA 和 RhoC 同屬于 Rho GTP 酶超家族中的 Rho 亞家族，具有序列同源性，因此我們結論具有相似性，認為 As2O3 可能是通過抑制 Rho GTPases 表達從而抑制細胞遷移。細胞外基質的改變是腫瘤細胞發生浸潤和侵襲的重要環節，而基質金屬蛋白酶在該過程中發揮至關重要的作用。本研究結果發現 As2O3 處理后，肝癌細胞中侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶家族成員 MMP-9 的基因和蛋白表達水平均出現明顯下調（見圖 5），且 Transwell 實驗中侵襲細胞數量明顯減少（見圖 6），說明 As2O3 可以抑制肝癌細胞 HepG2 發生侵襲，而 Zheng 等[24]的文章中也提到 MMP-9 下調導致肝癌細胞 SMMC-7721 遷移侵襲能力降低。在細胞凋亡過程中，其主要信號通路均與 Caspase-3 的激活相關[25]。此外，Bcl-2 和 Bax 也是調節細胞凋亡的重要基因，正常情況下，促凋亡蛋白 Bax 與抑凋亡蛋白 Bcl-2 可形成同源或者異源二聚體并處于一個平衡狀態，若由于各類刺激因素打破此平衡，機體細胞凋亡就發生了。本研究中，我們發現 As2O3 使 Caspase-3 和 Bax 的蛋白和 mRNA 表達上調，同時也使 Bcl-2 蛋白和 mRNA 表達下調，此結果表明 As2O3 可誘導 HepG2 細胞凋亡（見圖 7、圖 8）。
綜上所述，本研究發現一定濃度的 As2O3 可以抑制肝癌細胞 HepG2 的遷移和侵襲，并促進其發生凋亡，其可見機制如圖 9 所示，有望為肝癌的藥物治療以及聯合用藥提供一定的指導意義。
圖9
As2O3 抑制遷移侵襲并誘導凋亡示意圖
Figure9.
Schematic diagram of inhibition of migration and invasion and induction of apoptosis by As2O3
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
原發性肝癌是一種嚴重威脅人們健康并造成大量死亡的惡性腫瘤，具有發展快、預后差、易復發和病死率高等特點[1-2]。據統計數據顯示，在我國，每年有 40 多萬人死于肝癌，其病死率僅次于肺癌和胃癌[3-4]。由于肝癌細胞極易發生遷移和侵襲，手術切除、介入治療、局部消融及肝移植等目前常見的肝癌治療方法，其治療效果差且術后易復發[5-6]。因此，抑制肝癌侵襲轉移是當前肝癌治療的主攻方向之一。
腫瘤治療最大的障礙就是腫瘤細胞容易發生侵襲轉移[7]。腫瘤細胞侵襲轉移的發生是一個非常復雜的過程，是多基因、多因素、多步驟的生物學行為。在腫瘤細胞發生浸潤侵襲的過程中，其胞外基底膜的降解是一個重要環節[8]。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是一組含 Zn2+的能降解細胞外基質的蛋白酶，在正常組織中，MMPs 表達極少，在損傷和各種癌變組織中變得活躍[9]。研究表明，在多種具有侵襲性和高轉移性的腫瘤中都觀察到基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的表達增高，其通過參與腫瘤黏附、血管侵入等過程促進腫瘤細胞發生侵襲[10]。在腫瘤細胞發生轉移的過程中，其細胞骨架的重構發揮重要作用[11]。研究表明，Rho GTPases（Rac1、RhoA、Cdc42）蛋白通過誘導局部肌動蛋白聚集從而分別促進應力纖維、板狀偽足和絲狀偽足的形成，進而調控細胞的遷移行為[12]。其中，Rac1 促進板狀偽足和膜皺褶的形成，給細胞提供一個向前的牽引力；RhoA 主要通過調控細胞尾部應力纖維的形成和黏著斑的解聚，促進細胞收縮從而促進細胞遷移；Cdc42 則與絲狀偽足的形成密切相關，進而調控細胞極性和遷移方向[11, 13]。故而抑制金屬蛋白酶和 Rho GTPases 能有效降低腫瘤細胞的侵襲和遷移能力，從而能夠有效抑制腫瘤細胞的轉移，控制腫瘤的進展。
三氧化二砷（As2O3）是一種有效的白血病及其他實體瘤的治療藥物，具有廣泛的抗腫瘤效應[14]。有研究表明，As2O3 可以通過改變腫瘤細胞活性氧生成以及抑制腫瘤血管生成等途徑誘導肺癌、胃癌、骨肉瘤等腫瘤細胞的凋亡，并抑制乳腺癌、淋巴瘤等腫瘤細胞的增殖[15-17]。肝臟作為有毒物質的代謝場所，亦是As2O3甲基化代謝的主要場所[18]，故而 As2O3 對肝癌是否有抑制作用及其相關的分子機制是一個值得深入探索的問題。已有大量研究表明 As2O3 可促進肝癌細胞凋亡[19]，但鮮少有 As2O3 對肝癌細胞遷移、侵襲及其相關分子機制的研究探索。本文全面探討了 As2O3 對肝癌 HepG2 細胞遷移、侵襲和凋亡的影響并進一步探索了其可能的分子機制，以期為臨床肝癌的治療和聯合用藥提供新的更為有效的方法。
1 材料與方法
1.1 材料
人肝細胞肝癌細胞株 HepG2 購自中科院生物化學與細胞生物學研究所；RPMI 1640 培養基和胰蛋白酶購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自上海復蒙生物科技有限公司；As2O3 購自美國 Sigma 公司；CCK-8 細胞活性檢測試劑盒購自北京全式金生物技術有限公司；RNA 提取試劑盒、逆轉錄試劑盒和熒光定量 PCR 試劑盒購自日本 Takara 公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒和超敏 ECL 化學發光試劑盒購自碧云天生物技術研究所。Cdc42、Rac1、RhoA、MMP-9 和 Caspase-3 兔單克隆抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司；Bcl-2 和 Bax 兔單克隆抗體購自美國 Abcam 公司；GAPDH 鼠單克隆抗體購自北京中杉金橋有限公司。
1.2 方法
1.2.1 細胞培養
人肝癌細胞株 HepG2 細胞，用 5 mL 含 10% 胎牛血清的 1640 培養基于 37℃、飽和濕度、5% CO2 的恒溫細胞培養箱中培養，細胞呈單層貼壁生長，取狀態良好的對數期細胞進行后續實驗。
1.2.2 CCK-8 法檢測 As2O3 對 HepG2 半抑制濃度（IC50）
將對數生長期的 HepG2 細胞制成細胞懸液（1 × 106個/mL），以每孔 200 μL 加入 96 孔板中，在 37℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養 24 h 后，棄去培養液，每孔分別加入終濃度為 0、1、2、4、8、16、32 μmol/L As2O3 的 1640 完全培養基，并設置陰性對照組和只加培養基的空白對照組，每組設置 6 個平行孔，培養 24 h 后每孔加入 10 μL CCK-8 試劑，震蕩 10 min 后于細胞培養箱中繼續培養 2 h，酶標儀檢測 450 nm 波長處各孔 OD 值，并按以下公式計算 IC50：IC50 =（實驗組 ? 空白對照組）/（陰性對照組 ? 空白對照組）× 100%。根據 IC50 計算所得結果，我們選取 8 μmol/L As2O3 濃度進行后續實驗。
1.2.3 As2O3 作用不同時間對細胞形態學影響
以 1 × 106個/孔接種 HepG2 細胞于 6 孔板中，于 37℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養 24 h 后，棄去培養液，各孔加入 2 mL 終濃度為 8 μmol/L As2O3 的 1640 完全培養基，分別培養 12、24、48 h 后，置于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化并拍照。
1.2.4 劃痕實驗檢測遷移能力
接種 HepG2 細胞于六孔板中，加入 1640 完全培養基培養，待細胞融合度達 90% 時，對照組換成無血清 1640 培養基，實驗組更換成含終濃度為 8 μmol/L As2O3 的無血清 1640 培養基分別培養 24 h。用黃槍尖在單層細胞上劃出一個垂直損傷區，PBS 漂洗 3 次，洗掉刮下的細胞，將培養基更換成新鮮無血清 1640 培養基。分別于 0 h 和 48 h 在倒置相差顯微鏡下觀察劃痕愈合情況并拍照。
1.2.5 Transwell 檢測侵襲能力
取對數生長期 HepG2 細胞饑餓過夜，分別用無血清 1640 培養基和含 As2O3 的無血清 1640 培養基重懸制成單細胞懸液，各取 200 μL 單細胞懸液加入已鋪基底膜基質的 Transwell 上室中，下室加入 600 μL 含 10% 胎牛血清的 1640 完全培養基。37℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養 24 h 后，取出 Transwell 小室，PBS 漂洗 3 次后，加入 4% 多聚甲醛固定 10 min，用 1% 結晶紫染色 30 min。用棉簽輕輕擦去小室內部殘留細胞，倒置相差顯微鏡下拍照，隨機選取 5 個視野拍照，計數小室底面細胞個數。實驗重復 3 次。
1.2.6 Western blot 檢測細遷移、侵襲和凋亡相關蛋白表達
取對數生長期 HepG2 細胞，使用含終濃度為 8 μmol/L As2O3 的完全培養基培養 24 h，PBS 洗 3 次，加入含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的 RIPA 細胞裂解液，收集裂解液并置于冰上 30 min 使其充分裂解，12 000 g 冷凍離心 10 min，吸取上清于干凈的 EP 管中。BCA 法測定蛋白質濃度，后加入 Loading buffer 煮沸 8 min 使其充分變性。取等量蛋白（30 μg）加入上樣孔，SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質，電泳結束后將蛋白轉印到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂牛奶封閉 2 h 后孵育一抗，4℃ 過夜。TBST 洗 3 次，室溫孵育二抗 2 h，TBST 洗 3 次后 ECL 顯色，灰度分析處理并進行統計分析。
1.2.7 qRT-PCR 檢測細侵襲和凋亡相關基因表達
取對數生長期 HepG2 細胞，用含終濃度 8 μmol/L As2O3 的完全培養基培養 24 h，PBS 清洗 3 次后，按照試劑盒的操作步驟，提取細胞總 RNA，將其反轉錄為 cDNA（37℃ 15 min，85℃ 5 s）后完成 PCR 熒光定量（Step 1：95℃ 30 s；Step 2：95℃ 5 s，60℃ 30 s，40 個循環；Step 3：溶解曲線）。所用引物序列見表 1。
表1
qRT-PCR 所用引物信息
Table1.
Oligonucleotide primers used in qRT-PCR
1.3 統計學處理
實驗所有數據以均數 ± 標準差表示，采用 SSPS17.0 和 Graphpad prism 5 軟件進行統計學分析，P < 0.05 則認為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 As2O3 對 HepG2 細胞 IC50 測定
我們采用 CCK-8 細胞活力實驗檢測細胞活力變化，結果如圖 1 所示。隨著 As2O3 濃度升高，細胞活力逐步下降，As2O3 對 HepG2 細胞活力的影響呈現劑量依賴性，其 IC50 為 7.3 μmol/L。根據本實驗結果，我們選取 8 μmol/L As2O3 進行后續實驗。
圖1
As2O3 對 HepG2 細胞活力的影響
Figure1.
Effect of As2O3 on HepG2 cell activity
2.2 As2O3 對 HepG2 細胞凋亡的影響
用含終濃度 8 μmol/L As2O3 的完全培養基分別培養 HepG2 細胞 12、24、48 h 后，采用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態學變化。如圖 2 所示，隨著 As2O3 作用時間的延長，細胞的凋亡程度也逐漸增強，呈現一定的時間依賴性。HepG2 細胞的存活數目與對照組相比明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.05）。24 h 時 HepG2 細胞出現顯著凋亡；在 48 h 時細胞基本完全凋亡。據此，我們采用 8 μmol/L As2O3 作用 24 h 進行后續實驗，探索 As2O3 對肝癌細胞 HepG2 遷移和侵襲的影響。
圖2
As2O3 不同作用時間對 HepG2 細胞凋亡的影響（* P < 0.05）
Figure2.
Effect of As2O3 on HepG2 cell apoptosis (* P < 0.05)
2.3 As2O3 對 HepG2 細胞遷移能力的影響
利用細胞劃痕實驗檢測 As2O3 對 HepG2 細胞遷移能力的影響。如圖 3 所示，與對照組相比，使用 8 μmol/L As2O3 提前處理 HepG2 細胞，48 h 后，其遷移距離與對照組相比明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.05），說明一定濃度的 As2O3 可以抑制肝癌細胞 HepG2 遷移。為了進一步驗證 As2O3 對于肝癌細胞遷移能力的影響。我們采用 Western blot 實驗檢測了遷移相關蛋白的表達。如圖 4 所示，使用 8 μmol/L As2O3 作用 24 h 后，與對照組相比，HepG2 細胞中遷移相關蛋白 Cdc42、RhoA、Rac1 的表達水平均顯著下調（P < 0.05），進一步說明 As2O3 可以抑制肝癌細胞遷移。
圖3
As2O3 抑制 HepG2 細胞遷移（* P < 0.05）
Figure3.
Inhibition of HepG2 cell migration by As2O3 (* P < 0.05)
圖4
As2O3 抑制 Cdc42、RhoA、Rac1 蛋白表達（* P < 0.05）
Figure4.
Inhibition of Cdc42, RhoA and Rac1 protein expression by As2O3 (* P < 0.05)
2.4 As2O3 對 HepG2 細胞侵襲能力的影響
我們分別采用 Western blot 實驗和 qRT-PCR 實驗檢測了各組細胞中侵襲相關蛋白 MMP-9 的蛋白和基因表達。結果如圖 5 顯示，與對照組相比，MMP-9 蛋白和 mRNA 表達水平均顯著下調（P < 0.05）。利用 Transwell 實驗檢測 As2O3 對 HepG2 細胞侵襲能力的影響。結果如圖 6 所示，8 μmol/L As2O3 作用 24 h 后，HepG2 細胞的侵襲數目與對照組相比明顯降低，差異具有統計學意義（P < 0.05），說明一定濃度的 As2O3 可以抑制肝癌細胞 HepG2 的侵襲能力。
圖5
As2O3 抑制 MMP-9 蛋白和 mRNA 表達量（* P < 0.05）
Figure5.
Inhibition of MMP-9 protein and mRNA expression by As2O3 (* P < 0.05)
圖6
As2O3 抑制 HepG2 細胞侵襲（* P < 0.05）
Figure6.
Inhibition of HepG2 cell invasion by As2O3 (* P < 0.05)
2.5 As2O3 對 HepG2 細胞凋亡相關蛋白和 mRNA 表達的影響
根據前述實驗結果，我們已知 As2O3 可以誘導肝癌細胞發生凋亡。為進一步驗證該結論，我們采用 qRT-PCR 和 Western blot 實驗分別檢測了 As2O3 作用前后肝癌細胞中凋亡相關基因和蛋白表達水平的變化情況。如圖 7 所示，用 8 μmol/L As2O3 處理 24 h 后，與對照組比，HepG2 細胞中促凋亡基因 Caspase-3、Bax 的 mRNA 表達水平均顯著上調（P < 0.05），而抑凋亡基因 Bcl-2 的 mRNA 表達水平則出現顯著下調（P < 0.05）。圖 8 是 HepG2 細胞中 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表達水平及統計圖，其結果與 mRNA 表達水平一致，說明 As2O3 可以促進肝癌細胞 HepG2 發生凋亡。
圖7
As2O3 抑制 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的 mRNA 表達水平 （*P < 0.05）
Figure7.
Inhibition of Caspase-3, Bax and Bcl-2 mRNA expression levels by As2O3 (* P < 0.05)
圖8
As2O3 抑制 Caspase-3、Bax、Bcl-2 的蛋白表達水平（* P < 0.05）
Figure8.
Inhibition of Caspase-3, Bax and Bcl-2 protein expression levels by As2O3 (* P < 0.05)
3 討論
腫瘤的發生發展是一個極其復雜的過程，單就基因或者信號傳遞的角度去理解和治療腫瘤相對比較困難，故而本研究側重于關注天然藥物對腫瘤的抑制和治療作用。眾所周知，腫瘤治療中的最大障礙在于腫瘤細胞容易發生侵襲和轉移[20-21]。腫瘤細胞的遷移、侵襲、轉移是一個非常復雜的多步驟的生物學過程，受到多基因、多因素、多行為的調控，而降低腫瘤細胞的遷移和侵襲能力則能夠有效抑制腫瘤細胞的轉移，進而控制腫瘤的進展。
近年來研究表明，As2O3 不僅對白血病療效顯著，對肺癌、胃癌、骨肉瘤等亦有明顯療效[14-16, 22]。肝臟作為有毒物質的代謝場所，亦是 As2O3 甲基化代謝的主要場所，故而 As2O3 對肝癌是否有抑制作用及其相關的分子機制是我們深入探索的問題。本研究中，我們發現 As2O3 能夠顯著降低 HepG2 細胞的遷移能力（見圖 3），且下調 HepG2 細胞中 Rac1、RhoA 及 Cdc42 的蛋白表達水平（見圖 4），說明 As2O3 有利于抑制肝癌細胞 HepG2 的遷移。而 Lu 等[23]研究認為 As2O3 是通過抑制 RhoC 蛋白的表達抑制肝癌細胞 HepG2 的遷移，而 RhoA 和 RhoC 同屬于 Rho GTP 酶超家族中的 Rho 亞家族，具有序列同源性，因此我們結論具有相似性，認為 As2O3 可能是通過抑制 Rho GTPases 表達從而抑制細胞遷移。細胞外基質的改變是腫瘤細胞發生浸潤和侵襲的重要環節，而基質金屬蛋白酶在該過程中發揮至關重要的作用。本研究結果發現 As2O3 處理后，肝癌細胞中侵襲相關蛋白基質金屬蛋白酶家族成員 MMP-9 的基因和蛋白表達水平均出現明顯下調（見圖 5），且 Transwell 實驗中侵襲細胞數量明顯減少（見圖 6），說明 As2O3 可以抑制肝癌細胞 HepG2 發生侵襲，而 Zheng 等[24]的文章中也提到 MMP-9 下調導致肝癌細胞 SMMC-7721 遷移侵襲能力降低。在細胞凋亡過程中，其主要信號通路均與 Caspase-3 的激活相關[25]。此外，Bcl-2 和 Bax 也是調節細胞凋亡的重要基因，正常情況下，促凋亡蛋白 Bax 與抑凋亡蛋白 Bcl-2 可形成同源或者異源二聚體并處于一個平衡狀態，若由于各類刺激因素打破此平衡，機體細胞凋亡就發生了。本研究中，我們發現 As2O3 使 Caspase-3 和 Bax 的蛋白和 mRNA 表達上調，同時也使 Bcl-2 蛋白和 mRNA 表達下調，此結果表明 As2O3 可誘導 HepG2 細胞凋亡（見圖 7、圖 8）。
綜上所述，本研究發現一定濃度的 As2O3 可以抑制肝癌細胞 HepG2 的遷移和侵襲，并促進其發生凋亡，其可見機制如圖 9 所示，有望為肝癌的藥物治療以及聯合用藥提供一定的指導意義。
圖9
As2O3 抑制遷移侵襲并誘導凋亡示意圖
Figure9.
Schematic diagram of inhibition of migration and invasion and induction of apoptosis by As2O3
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
