血液、干細胞等在臨床上的需求量很大，其玻璃化保存面臨著要提高降溫速率就難以實現高通量這一矛盾問題。本文設計并制作了帶容器式收集裝置的微滴噴射玻璃化系統，開展了對人肝癌細胞（HepG2) 進行高通量玻璃化保存的研究。首先，比較容器式收集與薄片式接收兩種方式對微滴噴射玻璃化保存效果的差異，結果表明容器式收集玻璃化組細胞的存活率和 24 h 貼壁率明顯高于薄片式接收玻璃化組。其次，增加微滴噴射的 HepG2 細胞密度，發現細胞密度成倍增加時，微滴噴射玻璃化保存效果沒有顯著變化。最后，將微滴噴射容器式收集玻璃化與慢速冷凍法作比較，容器式收集玻璃化組的細胞處理量增大，且細胞存活率和 24 h 貼壁率明顯高于慢速冷凍組。研究結果表明，本文設計的帶容器式收集裝置的微滴噴射玻璃化系統不僅能實現細胞的玻璃化保存，而且具有高通量的特點，這對小體積細胞的大體量保存具有重要意義。
引用本文： 喻梓瑄, 張宵敏, 周新麗. 微滴噴射高通量玻璃化細胞保存的實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(5): 850-855, 861. doi: 10.7507/1001-5515.201812017 復制
引言
臨床上存在著多種需要大體量保存的細胞系統，如血液、干細胞等。舉例來說，在急性失血、手術期輸血及慢性貧血狀況下，常需進行紅細胞輸血，比如當發生孕婦妊娠后的失血量大于血容量的 20%（1 000 mL）時，應輸注紅細胞，最終使患者血紅蛋白濃度提高到 80～100 g/L[1]。又比如，血小板在止血和凝血過程中發揮重要作用，輸注血小板可達到快速止血的目的。當在進行腦部手術、輸尿管修復手術時，需將血小板濃度提高到 100 × 109 個/L。在自然災害、軍事沖突和臨床環境中，成人單次需要的輸血量一般達到 200～400 mL[1]。而干細胞作為一種尚未充分分化、有很大潛能的細胞，具有可再生各種組織器官、進行骨髓移植、抗衰老、輔助藥物篩選、進行干細胞治療等多種用途。當進行造血干細胞移植時，單次造血干細胞懸浮液的需求量是 50～100 mL[2]。諸如此類的細胞還有很多，因此普遍面臨著臨床需求量大、細胞嚴重短缺、保存期有限、需大批量保存等問題。目前，需要大體量保存的細胞系統，常采用的低溫保存技術是慢速冷凍法。比如紅細胞與血小板的低溫保存技術都是采用程序降溫的方法，將 200～400 mL 的紅細胞或血小板懸浮液慢速降溫至? 80℃ 后，保存在? 80℃ 冰箱中[3]。而造血干細胞常用的冷凍技術也為慢速冷凍法，將 50 mL 造血干細胞懸液放入? 80℃ 低溫冰箱慢速降溫至? 80℃ 后存儲在液氮中[4]。但慢速冷凍法存在著一些缺點：一方面，在降溫和復溫過程中易形成冰晶，冰晶會對細胞造成損傷，細胞回收率不高；另一方面，復溫后的細胞需要洗脫低溫保護劑后方能使用，程序較繁瑣。如紅細胞與血小板復溫后的細胞回收率只有 70%，且紅細胞在洗脫保護劑過程中容易產生溶血率高的現象[3]；造血干細胞復溫后的存活率也僅為 80%[4]。
另一種細胞低溫保存技術是玻璃化法，玻璃化法是以極快的降溫速率將液體在短時間內直接轉化為非晶態的固體。玻璃化法與慢速冷凍法相比需要更高的降溫速率（約 105 ℃/min）和更高的保護劑濃度（6～8 mol/L）[5]。在合理地控制降溫速率和適宜的保護劑濃度下，采用玻璃化法可以有效避免胞內外冰晶的形成，低溫保存效果良好。提高保護劑濃度以及提高冷卻速率都可有效實現玻璃化，但細胞會因為高濃度的保護劑而造成不可逆的毒性損傷和滲透損傷，單純靠提高保護劑濃度的方法進行細胞低溫保存有較大的局限性[5]。而提高降溫速率一般采用兩種方法：一是提高傳熱系數，例如優化載體的傳熱特性或是將微滴直接噴入液氮中[6]，即可達到提高傳熱系數的目的；二是降低微滴體積，有研究顯示，當微滴尺寸縮小到約為 0.1 μL 時，通過調控其從微滴表面到微滴中心的降溫速率都超過 105 ℃/min 時，即可成功實現玻璃化[7-9]。目前，玻璃化法保存多用于卵母細胞、胚胎等單個生物樣本的保存，如需將其應用于大體量細胞系統的保存，尚面臨著一系列挑戰，尤其是在提高降溫速率與實現高通量之間存在一定的矛盾。
微滴噴射玻璃化保存，是利用噴嘴裝置將細胞懸浮液離散成微滴后直接噴入液氮中實現玻璃化保存。Demirci 等[10-13]曾提出一種微滴噴射裝置，該裝置利用聲學驅動微機械噴射器可產生尺寸極小的微滴，但噴射液體濃度過大時，噴嘴極易堵塞無法實現高通量。Rami 等[14]提出了一種單噴嘴共流微滴噴射玻璃化保存系統，并將此系統應用于紅細胞的保存。該系統由氮氣輸送噴嘴、細胞懸浮液注射裝置、聚乙烯薄片收集裝置三部分組成。進行噴射時，氮氣輸送噴嘴輸出氮氣流，并與細胞懸浮液形成共流，氮氣流將細胞懸浮液離散成微滴并直接噴射至直徑為 8.5 cm 的聚乙烯薄片上，薄片用鑷子夾取后立即放入液氮中進行玻璃化。然而，該系統尚存在不足處，其缺陷在于直徑為 8.5 cm 的薄片每次僅能接收 80 μL 加載有冷凍保護劑（cryoprotectant, CPA）的紅細胞懸浮液，其中紅細胞密度約為 5 × 1012 個/L。若長時間接收，微滴極易堆積造成體積增大，不利于玻璃化保存，因此保存量也非常有限。Samot 等[15]對此系統進行優化，提出了多噴嘴共流微滴噴射玻璃化保存系統，該系統改單噴嘴為多噴嘴陣列，有限地提高了單次細胞的保存量。但該系統無法控制噴嘴陣列噴射的同時性和噴射的具體范圍，并且仍采用薄片式接收方式會存在操作繁瑣、細胞污染與丟失等問題。與此對應的，Zhang 等[16]利用微滴噴射玻璃化系統對卵母細胞進行保存時，就出現了細胞極易丟失的問題。
本文針對小體積細胞系統的大體量玻璃化保存問題，將微滴收集裝置調整為容器式收集裝置，首先，比較容器式收集裝置與薄片式接收方式接收微滴噴射的玻璃化保存效果；其次，增加懸浮液中的細胞密度，研究細胞密度對微滴噴射容器式收集玻璃化保存效果的影響；最后，將微滴噴射玻璃化法保存與慢速冷凍法進行比較，對細胞回收率及細胞活性進行統計，驗證微滴噴射高通量玻璃化保存系統的有效性。微滴噴射高通量玻璃化保存有望解決小體積細胞的大體量保存問題。該技術方法可以廣泛用于保存其他細胞類型，包括外周血干細胞、天然殺傷細胞、淋巴細胞、成纖維細胞，肝細胞，心肌細胞等，在基于細胞的癌癥治療、再生和移植醫學方面都有廣闊的應用前景。
1 材料與方法
1.1 材料與設備
本文所用材料包括：人肝癌細胞（human hepatocellular carcinomas, HepG2）（上海賽百慷生物技術股份有限公司）；胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)（Biosera 公司，法國）；杜氏改良伊格爾培養基 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM)（HyClone 公司，美國）；胰酶（Sigma 公司，美國）；D-hanks 平衡鹽緩沖液（上海勵瑞生物科技有限公司）；臺盼藍染色液（2×）（碧云天生物技術公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）（AppliChem 公司，德國）；海藻糖（Sigma 公司，美國）。
本文所用設備包括：二氧化碳培養箱（MCO-18AC，松下醫療器械有限公司，日本）；程序降溫盒（5100-0001，Thermo Fisher 公司，美國)；液氮罐（YDS-50B-125，成都金鳳有限公司，中國）；超低溫冰箱（DW-8GL388A，青島海爾特種電器有限公司，中國）；光學顯微鏡（CFI60，尼康，日本）。
1.2 微滴噴射玻璃化系統
微滴噴射玻璃化系統主要由氮氣流輸送裝置、細胞懸浮液注射裝置、噴嘴、容器式收集裝置共 4 部分組成。如圖1 所示，氮氣流輸送裝置包括氮氣瓶、雙表頭減壓閥和流量計，氮氣瓶提供氮氣流，流量計調節氮氣流速，通過流量計出口端的氮氣輸出管將氮氣輸送至噴嘴敞口端；細胞懸浮液注射裝置主要由微注射泵和微注射器組成，微注射泵推動微注射器，細胞懸浮液通過微注射器出口針頭所連接的懸浮液輸送管輸送至插入噴嘴的不銹鋼針管；噴嘴由 200 μL 的移液器槍頭和 25 G/30 G 尖口針頭制作而成。將移液槍槍頭頂端切除 2 mm，取下針頭的不銹鋼針管，將針管從距槍頭尖端 2 cm 處側面插入，直至針管露出槍頭尖端 2 mm，將噴嘴固定于鐵架臺上。
圖1
微滴噴射玻璃化保存系統圖
Figure1.
Schematic diagram of micro-droplet spray vitrification system
如圖2 所示，為容器式收集裝置示意圖，它由兩部分組成，一部分是用于盛液氮的 350 mL 不銹鋼杯，另一部分是用于收集細胞的篩網裝置，細胞篩網尺寸與不銹鋼杯尺寸相匹配，可貼壁放入不銹鋼杯內。細胞篩網是將雙層 500 目的尼龍網固定于塑料框架上。一般來說，目數 500 目的篩網，孔徑約 28 μm，篩網用雙層尼龍網制作而成，所以篩網孔徑約 15 μm，這可保證篩網孔徑比細胞直徑小，從而起到過濾、收集細胞的作用。
圖2
容器式收集裝置構成示意圖
Figure2.
Schematic diagram of the container collection device
整個系統的工作原理是：由輸出的氮氣流和已加載好保護劑的細胞懸浮液構成共流，利用氮氣流將含有細胞的懸浮液離散成微滴并直接噴入盛有液氮的容器式收集裝置。因產生的微滴體積足夠小，降溫速率會明顯提升，微滴與液氮直接接觸實現玻璃化。待噴射完畢，將篩網取出，直接放入 37 ℃ DMEM 培養基中進行復溫。
氮氣流量、懸浮液注射速度、針頭型號、接收位置距噴嘴距離等因素對微滴噴射效果都有很大影響，本課題組張宵敏[17]通過噴射液滴大小、噴射后細胞的損傷程度等對微滴噴射參數進行了優化。基于張宵敏[17]的研究結果，本文采用的優化噴射參數為：氮氣流量為 3.2 L/min，懸浮液注射速度為 200 μL/min，30 G 針頭作噴嘴，接收位置為距噴嘴 6 cm 處。
1.3 細胞存活率及 24 h 貼壁率測定方法
本文采用臺盼藍染色法測定細胞存活率，其原理在于：臺盼藍染料可以穿過損傷或死亡細胞的細胞膜，并與已解體的 DNA 結合使其上色，但卻無法進入活細胞內染色。具體操作方法是：吸取 100 μL 重懸的細胞到離心管內，加入 100 μL 臺盼藍染色液 (2×)，混合均勻，染色 3 min。再吸取 10 μL 經過染色后的細胞懸液，用細胞計數板計數藍色細胞數和細胞總數，如式（1）所示計算細胞存活率。
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24 h 貼壁率的測定方法是：將細胞培養瓶放入 CO2 培養箱培養 24 h 后，用離心管收集上清液，并用 2 mL 的 D-hanks 液清洗細胞兩次，清洗液也收集至離心管中，離心，棄上清，加 1 mL DMEM 培養基重懸細胞，此時未貼壁細胞位于 DMEM 培養基重懸液中，等待計數。而貼壁細胞仍在細胞培養瓶中呈貼壁狀態，將其用胰酶消化后，移入離心管中，離心，去上清，將細胞沉淀重懸至 1 mL，等待計數。接下來，用細胞計數板分別數出貼壁細胞數及未貼壁細胞數。同時觀察細胞的生長情況和形態變化，如式（2）所示計算細胞 24 h 貼壁率。
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1.4 不同接收方式對微滴噴射玻璃化的影響
本文采用微滴噴射玻璃化系統對 3 mL HepG2 細胞懸液進行噴射實驗，以 5% DMSO + 0.3 mol/L 海藻糖作為低溫保護劑，分別采用薄片接收和容器式收集裝置接收的方式實現微滴噴射玻璃化保存細胞。
實驗分為 3 組，分別是：① 對照組，HepG2 細胞僅用 DMEM 培養基培養，其余不做任何操作，檢測細胞存活率及 24 h 貼壁率。② 薄片接收組，噴射實驗產生的微滴用直徑 9 cm 的聚乙烯薄片正反面接收，薄片單面接收時間為 5 s。然后將薄片迅速浸入液氮玻璃化。37 ℃ DMEM 培養基中復溫，并用 DMEM 培養基將薄片上的細胞洗脫下來，離心管收集洗脫液。離心棄上清，重懸細胞，檢測細胞存活率及 24 h 貼壁率。③ 容器式收集裝置接收組，噴射實驗產生的微滴直接噴入容器式收集裝置，實現玻璃化，且細胞均落在篩網上。噴射完畢，取出篩網，將其浸入 37 ℃ 培養基中復溫，并用 DMEM 培養基洗脫細胞，離心管收集細胞懸液。離心棄上清，重懸細胞，檢測細胞存活率及 24 h 貼壁率。
1.5 細胞密度對微滴噴射玻璃化的影響
將新鮮的 HepG2 細胞懸液的密度調整為 2.0×106 個/mL，然后依次稀釋為 1.0×106個/mL、0.5 × 106 個/mL。以 5% DMSO + 0.3 mol/L 海藻糖作為低溫保護劑，采用微滴噴射玻璃化系統對不同密度的 HepG2 細胞懸液進行噴射。噴射完畢，取出篩網，將其浸入 37 ℃ 培養基中復溫，并用 DMEM 培養基洗脫細胞，離心管收集細胞懸液，離心棄上清，重懸細胞，檢測細胞存活率及 24 h 貼壁率。
1.6 微滴噴射高通量玻璃化與慢速冷凍法保存效果比較
采用接收方式為容器式收集裝置的微滴噴射玻璃化系統對 30 mL HepG2 細胞懸液進行玻璃化保存，并與常規慢速冷凍法的保存效果進行比較，比較內容包括凍存細胞量、細胞回收率、細胞存活率及 24 h 貼壁率。具體操作如下：
（1）慢速冷凍法：取含 10% DMSO 低溫保護劑的細胞懸液 1 mL 放入凍存管中，凍存前測細胞密度。在? 80 ℃ 低溫冰箱中凍存一周后，37 ℃ 水浴快速復溫。離心去上清，再加入 DMEM 培養基重懸細胞至 1 mL，檢測復溫后的細胞密度，然后如式（3）所示計算細胞回收率。
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（2）微滴噴射玻璃化：取含 5% DMSO + 0.3 mol/L 海藻糖作為低溫保護劑的細胞懸液 30 mL，噴射前測定細胞密度。放置 5 min，進行噴射實驗，并用盛滿液氮的容器式收集裝置接收微滴，實現細胞的玻璃化。待 30 mL 懸浮液噴射完后，將篩網從液氮容器中取出，放入盛有約 350 mL 37℃ 培養基的燒杯中復溫。離心管收集篩網中的細胞懸液，離心去上清。用 DMEM 培養基重懸細胞，測定重懸的細胞密度。如式（4）所示計算玻璃化保存的細胞回收率。
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1.7 數據分析
采用統計產品與服務解決方案軟件 SPSS Statistics 19.0 進行統計學分析，實驗數據用平均值 ± 標準差的形式表示，兩組間比較采用 t 檢驗，P < 0.05 為差異具有統計學意義。每組實驗需重復 3 次以上。
2 結果與討論
2.1 不同接收方式對微滴噴射玻璃化的影響結果
采用薄片式接收與容器式收集裝置接收噴射實驗產生的微滴，經玻璃化保存后的細胞存活率及 24 h 貼壁率的結果如表1 所示，采用容器式收集裝置接收微滴時，細胞的存活率和 24 h 貼壁率均高于薄片式接收組，提示該種接收方式下細胞活性明顯高于薄片式接收組，組間差異具有統計學意義。由此可見，采用容器式收集裝置接收微滴時，玻璃化保存的細胞活性更高，保存效果更理想。分析原因可總結如下：一方面，采用容器式收集裝置接收微滴，微滴與液氮直接接觸，傳熱系數增加，降溫速率明顯提升，有助于實現玻璃化；另一方面，微滴直接噴入液氮玻璃化，相對于薄片式接收，避免了薄片對細胞造成的沖擊力損傷。
表1
不同接收方式對微滴噴射玻璃化的影響
Table1.
Effect of collection methods on microdroplet spray vitrification
2.2 細胞密度對微滴噴射玻璃化的影響結果
噴射細胞密度依次為 0.5 × 106、1.0 × 106、2.0 × 106 個/mL 的細胞懸液，經玻璃化保存后的細胞存活率及 24 h 貼壁率如表2 所示。由表2 可知，當懸浮液注射系統中細胞密度成倍增加時，細胞的存活率及 24 h 貼壁率并沒有明顯變化，結果顯示組間差異不具有統計學意義。說明當細胞密度在 0.5 × 106～2 × 106 個/mL 范圍內變化，微滴噴射玻璃化保存效果不隨細胞密度的改變而改變。且細胞活性均達到 92% 上，玻璃化保存效果良好。因此，可以通過適量增加細胞密度來提高玻璃化保存細胞的數量，這將有助于解決小體積細胞高通量保存問題。
表2
細胞密度對微滴噴射玻璃化的影響
Table2.
Effect of cell density on microdroplet spray vitrification
2.3 微滴噴射高通量玻璃化與慢速冷凍法保存效果比較結果
采用微滴噴射容器式收集裝置玻璃化保存方法，并與慢速冷凍法保存結果進行比較，結果如表3 所示。對細胞處理量進行分析，發現慢速冷凍法單次能夠保存處理的懸浮液體積為 1 mL，傳統的薄片式接收微滴噴射玻璃化保存系統單次能夠處理的懸浮液體積可達 30 mL，而本文提出的容器式收集微滴噴射玻璃化保存系統的單次處理量遠不止 30 mL，能夠繼續加大到 200 mL，達到臨床實用的體積量，說明該系統具有高通量的特點。同時，采用容器式收集裝置接收微滴時，細胞回收率達 89.70% ± 1.36%，盡管相對于慢速冷凍的回收率 98.15% ± 0.53%還有一定差距，但相對于 Rami 等[14]提出的薄片式接收方式，容器式收集裝置不易造成細胞丟失，細胞回收率較高。此外，對細胞活性進行分析發現，相較于慢速冷凍法，采用容器式收集裝置玻璃化保存細胞時細胞存活率和 24 h 貼壁率均明顯較高，說明容器式收集裝置玻璃化保存效果更好。且復溫后，無需去除低溫保護劑的步驟，程序簡單。
表3
微滴噴射高通量玻璃化與慢速冷凍法的比較
Table3.
Comparison of high-throughput vitrification by micro-droplet spray and slow freezing
3 討論與展望
本文提出的微滴噴射玻璃化裝置能有效實現細胞玻璃化保存。相對于薄片式接收，容器式收集裝置有以下幾點優勢：① 薄片式接收每次僅能接收 80 μL 細胞懸浮液，保存量非常有限，容器式收集裝置單次能夠處理的細胞量大，能夠達到臨床實用量。② 薄片式接收是平面收集，長時間接收會造成細胞的堆積或丟失問題，容器式收集裝置是立體容器式，細胞懸液噴進液氮中懸浮，細胞不會產生堆積且接收完全、無丟失。③ 薄片式接收是先在薄片上接收然后投入液氮中冷凍，增加了細胞與接收材料的接觸損傷，并且由于接收材料的熱傳遞系數低，降低了細胞的玻璃化程度。容器式收集是將細胞懸液噴進液氮中，沒有接觸損傷且以超高的冷卻速率實現了細胞的玻璃化保存。
高數目尼龍網在玻璃化冷凍保存技術中已有應用。例如 Nakashima 等[18]就曾用目數 300 目，孔徑約為 48 μm 的尼龍網進行人類胚胎的玻璃化保存；后又有 Yamanaka 等[19]將目數 270 目，孔徑約 57 μm 的尼龍網作為玻璃化載體，冷凍保存直徑為 101～150 μm 的大鼠胰島細胞。人類胚胎和大鼠胰島細胞都屬于體積較大的單個樣本保存，使用單層平面尼龍網就可以實現。紅細胞、血小板、干細胞和本文中所用的 HepG2 細胞體積很小且需要大體量保存。若采用單層 300 目或是 270 目尼龍網保存小體積細胞，極易造成細胞丟失現象，因此，本文采用 2 層 500 目尼龍網疊加使用，同時將尼龍網制成立體容器式結構，提高了細胞的處理量。
相對于慢速冷凍法，本文提出的微滴噴射玻璃化保存系統所得細胞活性更高，且具有高通量的特點，有望解決小體積細胞的大體量保存問題。為了使該技術在大體量細胞凍存中更有效、便捷，還可以在以下幾個方面開展研究：① 是保護劑加載方式的優化，可采用微流控法加載低溫保護劑替代目前的一步法，減小玻璃化溶液對細胞造成的滲透損傷和毒性損傷；② 是采用仿生型低溫保護劑，降低 DMSO 的濃度或者代替 DMSO；③ 是采用封閉式的收集裝置，便于玻璃化凍存細胞的長期保存。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
臨床上存在著多種需要大體量保存的細胞系統，如血液、干細胞等。舉例來說，在急性失血、手術期輸血及慢性貧血狀況下，常需進行紅細胞輸血，比如當發生孕婦妊娠后的失血量大于血容量的 20%（1 000 mL）時，應輸注紅細胞，最終使患者血紅蛋白濃度提高到 80～100 g/L[1]。又比如，血小板在止血和凝血過程中發揮重要作用，輸注血小板可達到快速止血的目的。當在進行腦部手術、輸尿管修復手術時，需將血小板濃度提高到 100 × 109 個/L。在自然災害、軍事沖突和臨床環境中，成人單次需要的輸血量一般達到 200～400 mL[1]。而干細胞作為一種尚未充分分化、有很大潛能的細胞，具有可再生各種組織器官、進行骨髓移植、抗衰老、輔助藥物篩選、進行干細胞治療等多種用途。當進行造血干細胞移植時，單次造血干細胞懸浮液的需求量是 50～100 mL[2]。諸如此類的細胞還有很多，因此普遍面臨著臨床需求量大、細胞嚴重短缺、保存期有限、需大批量保存等問題。目前，需要大體量保存的細胞系統，常采用的低溫保存技術是慢速冷凍法。比如紅細胞與血小板的低溫保存技術都是采用程序降溫的方法，將 200～400 mL 的紅細胞或血小板懸浮液慢速降溫至? 80℃ 后，保存在? 80℃ 冰箱中[3]。而造血干細胞常用的冷凍技術也為慢速冷凍法，將 50 mL 造血干細胞懸液放入? 80℃ 低溫冰箱慢速降溫至? 80℃ 后存儲在液氮中[4]。但慢速冷凍法存在著一些缺點：一方面，在降溫和復溫過程中易形成冰晶，冰晶會對細胞造成損傷，細胞回收率不高；另一方面，復溫后的細胞需要洗脫低溫保護劑后方能使用，程序較繁瑣。如紅細胞與血小板復溫后的細胞回收率只有 70%，且紅細胞在洗脫保護劑過程中容易產生溶血率高的現象[3]；造血干細胞復溫后的存活率也僅為 80%[4]。
另一種細胞低溫保存技術是玻璃化法，玻璃化法是以極快的降溫速率將液體在短時間內直接轉化為非晶態的固體。玻璃化法與慢速冷凍法相比需要更高的降溫速率（約 105 ℃/min）和更高的保護劑濃度（6～8 mol/L）[5]。在合理地控制降溫速率和適宜的保護劑濃度下，采用玻璃化法可以有效避免胞內外冰晶的形成，低溫保存效果良好。提高保護劑濃度以及提高冷卻速率都可有效實現玻璃化，但細胞會因為高濃度的保護劑而造成不可逆的毒性損傷和滲透損傷，單純靠提高保護劑濃度的方法進行細胞低溫保存有較大的局限性[5]。而提高降溫速率一般采用兩種方法：一是提高傳熱系數，例如優化載體的傳熱特性或是將微滴直接噴入液氮中[6]，即可達到提高傳熱系數的目的；二是降低微滴體積，有研究顯示，當微滴尺寸縮小到約為 0.1 μL 時，通過調控其從微滴表面到微滴中心的降溫速率都超過 105 ℃/min 時，即可成功實現玻璃化[7-9]。目前，玻璃化法保存多用于卵母細胞、胚胎等單個生物樣本的保存，如需將其應用于大體量細胞系統的保存，尚面臨著一系列挑戰，尤其是在提高降溫速率與實現高通量之間存在一定的矛盾。
微滴噴射玻璃化保存，是利用噴嘴裝置將細胞懸浮液離散成微滴后直接噴入液氮中實現玻璃化保存。Demirci 等[10-13]曾提出一種微滴噴射裝置，該裝置利用聲學驅動微機械噴射器可產生尺寸極小的微滴，但噴射液體濃度過大時，噴嘴極易堵塞無法實現高通量。Rami 等[14]提出了一種單噴嘴共流微滴噴射玻璃化保存系統，并將此系統應用于紅細胞的保存。該系統由氮氣輸送噴嘴、細胞懸浮液注射裝置、聚乙烯薄片收集裝置三部分組成。進行噴射時，氮氣輸送噴嘴輸出氮氣流，并與細胞懸浮液形成共流，氮氣流將細胞懸浮液離散成微滴并直接噴射至直徑為 8.5 cm 的聚乙烯薄片上，薄片用鑷子夾取后立即放入液氮中進行玻璃化。然而，該系統尚存在不足處，其缺陷在于直徑為 8.5 cm 的薄片每次僅能接收 80 μL 加載有冷凍保護劑（cryoprotectant, CPA）的紅細胞懸浮液，其中紅細胞密度約為 5 × 1012 個/L。若長時間接收，微滴極易堆積造成體積增大，不利于玻璃化保存，因此保存量也非常有限。Samot 等[15]對此系統進行優化，提出了多噴嘴共流微滴噴射玻璃化保存系統，該系統改單噴嘴為多噴嘴陣列，有限地提高了單次細胞的保存量。但該系統無法控制噴嘴陣列噴射的同時性和噴射的具體范圍，并且仍采用薄片式接收方式會存在操作繁瑣、細胞污染與丟失等問題。與此對應的，Zhang 等[16]利用微滴噴射玻璃化系統對卵母細胞進行保存時，就出現了細胞極易丟失的問題。
本文針對小體積細胞系統的大體量玻璃化保存問題，將微滴收集裝置調整為容器式收集裝置，首先，比較容器式收集裝置與薄片式接收方式接收微滴噴射的玻璃化保存效果；其次，增加懸浮液中的細胞密度，研究細胞密度對微滴噴射容器式收集玻璃化保存效果的影響；最后，將微滴噴射玻璃化法保存與慢速冷凍法進行比較，對細胞回收率及細胞活性進行統計，驗證微滴噴射高通量玻璃化保存系統的有效性。微滴噴射高通量玻璃化保存有望解決小體積細胞的大體量保存問題。該技術方法可以廣泛用于保存其他細胞類型，包括外周血干細胞、天然殺傷細胞、淋巴細胞、成纖維細胞，肝細胞，心肌細胞等，在基于細胞的癌癥治療、再生和移植醫學方面都有廣闊的應用前景。
1 材料與方法
1.1 材料與設備
本文所用材料包括：人肝癌細胞（human hepatocellular carcinomas, HepG2）（上海賽百慷生物技術股份有限公司）；胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS)（Biosera 公司，法國）；杜氏改良伊格爾培養基 (Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM)（HyClone 公司，美國）；胰酶（Sigma 公司，美國）；D-hanks 平衡鹽緩沖液（上海勵瑞生物科技有限公司）；臺盼藍染色液（2×）（碧云天生物技術公司）；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）（AppliChem 公司，德國）；海藻糖（Sigma 公司，美國）。
本文所用設備包括：二氧化碳培養箱（MCO-18AC，松下醫療器械有限公司，日本）；程序降溫盒（5100-0001，Thermo Fisher 公司，美國)；液氮罐（YDS-50B-125，成都金鳳有限公司，中國）；超低溫冰箱（DW-8GL388A，青島海爾特種電器有限公司，中國）；光學顯微鏡（CFI60，尼康，日本）。
1.2 微滴噴射玻璃化系統
微滴噴射玻璃化系統主要由氮氣流輸送裝置、細胞懸浮液注射裝置、噴嘴、容器式收集裝置共 4 部分組成。如圖1 所示，氮氣流輸送裝置包括氮氣瓶、雙表頭減壓閥和流量計，氮氣瓶提供氮氣流，流量計調節氮氣流速，通過流量計出口端的氮氣輸出管將氮氣輸送至噴嘴敞口端；細胞懸浮液注射裝置主要由微注射泵和微注射器組成，微注射泵推動微注射器，細胞懸浮液通過微注射器出口針頭所連接的懸浮液輸送管輸送至插入噴嘴的不銹鋼針管；噴嘴由 200 μL 的移液器槍頭和 25 G/30 G 尖口針頭制作而成。將移液槍槍頭頂端切除 2 mm，取下針頭的不銹鋼針管，將針管從距槍頭尖端 2 cm 處側面插入，直至針管露出槍頭尖端 2 mm，將噴嘴固定于鐵架臺上。
圖1
微滴噴射玻璃化保存系統圖
Figure1.
Schematic diagram of micro-droplet spray vitrification system
如圖2 所示，為容器式收集裝置示意圖，它由兩部分組成，一部分是用于盛液氮的 350 mL 不銹鋼杯，另一部分是用于收集細胞的篩網裝置，細胞篩網尺寸與不銹鋼杯尺寸相匹配，可貼壁放入不銹鋼杯內。細胞篩網是將雙層 500 目的尼龍網固定于塑料框架上。一般來說，目數 500 目的篩網，孔徑約 28 μm，篩網用雙層尼龍網制作而成，所以篩網孔徑約 15 μm，這可保證篩網孔徑比細胞直徑小，從而起到過濾、收集細胞的作用。
圖2
容器式收集裝置構成示意圖
Figure2.
Schematic diagram of the container collection device
整個系統的工作原理是：由輸出的氮氣流和已加載好保護劑的細胞懸浮液構成共流，利用氮氣流將含有細胞的懸浮液離散成微滴并直接噴入盛有液氮的容器式收集裝置。因產生的微滴體積足夠小，降溫速率會明顯提升，微滴與液氮直接接觸實現玻璃化。待噴射完畢，將篩網取出，直接放入 37 ℃ DMEM 培養基中進行復溫。
氮氣流量、懸浮液注射速度、針頭型號、接收位置距噴嘴距離等因素對微滴噴射效果都有很大影響，本課題組張宵敏[17]通過噴射液滴大小、噴射后細胞的損傷程度等對微滴噴射參數進行了優化。基于張宵敏[17]的研究結果，本文采用的優化噴射參數為：氮氣流量為 3.2 L/min，懸浮液注射速度為 200 μL/min，30 G 針頭作噴嘴，接收位置為距噴嘴 6 cm 處。
1.3 細胞存活率及 24 h 貼壁率測定方法
本文采用臺盼藍染色法測定細胞存活率，其原理在于：臺盼藍染料可以穿過損傷或死亡細胞的細胞膜，并與已解體的 DNA 結合使其上色，但卻無法進入活細胞內染色。具體操作方法是：吸取 100 μL 重懸的細胞到離心管內，加入 100 μL 臺盼藍染色液 (2×)，混合均勻，染色 3 min。再吸取 10 μL 經過染色后的細胞懸液，用細胞計數板計數藍色細胞數和細胞總數，如式（1）所示計算細胞存活率。
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24 h 貼壁率的測定方法是：將細胞培養瓶放入 CO2 培養箱培養 24 h 后，用離心管收集上清液，并用 2 mL 的 D-hanks 液清洗細胞兩次，清洗液也收集至離心管中，離心，棄上清，加 1 mL DMEM 培養基重懸細胞，此時未貼壁細胞位于 DMEM 培養基重懸液中，等待計數。而貼壁細胞仍在細胞培養瓶中呈貼壁狀態，將其用胰酶消化后，移入離心管中，離心，去上清，將細胞沉淀重懸至 1 mL，等待計數。接下來，用細胞計數板分別數出貼壁細胞數及未貼壁細胞數。同時觀察細胞的生長情況和形態變化，如式（2）所示計算細胞 24 h 貼壁率。
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1.4 不同接收方式對微滴噴射玻璃化的影響
本文采用微滴噴射玻璃化系統對 3 mL HepG2 細胞懸液進行噴射實驗，以 5% DMSO + 0.3 mol/L 海藻糖作為低溫保護劑，分別采用薄片接收和容器式收集裝置接收的方式實現微滴噴射玻璃化保存細胞。
實驗分為 3 組，分別是：① 對照組，HepG2 細胞僅用 DMEM 培養基培養，其余不做任何操作，檢測細胞存活率及 24 h 貼壁率。② 薄片接收組，噴射實驗產生的微滴用直徑 9 cm 的聚乙烯薄片正反面接收，薄片單面接收時間為 5 s。然后將薄片迅速浸入液氮玻璃化。37 ℃ DMEM 培養基中復溫，并用 DMEM 培養基將薄片上的細胞洗脫下來，離心管收集洗脫液。離心棄上清，重懸細胞，檢測細胞存活率及 24 h 貼壁率。③ 容器式收集裝置接收組，噴射實驗產生的微滴直接噴入容器式收集裝置，實現玻璃化，且細胞均落在篩網上。噴射完畢，取出篩網，將其浸入 37 ℃ 培養基中復溫，并用 DMEM 培養基洗脫細胞，離心管收集細胞懸液。離心棄上清，重懸細胞，檢測細胞存活率及 24 h 貼壁率。
1.5 細胞密度對微滴噴射玻璃化的影響
將新鮮的 HepG2 細胞懸液的密度調整為 2.0×106 個/mL，然后依次稀釋為 1.0×106個/mL、0.5 × 106 個/mL。以 5% DMSO + 0.3 mol/L 海藻糖作為低溫保護劑，采用微滴噴射玻璃化系統對不同密度的 HepG2 細胞懸液進行噴射。噴射完畢，取出篩網，將其浸入 37 ℃ 培養基中復溫，并用 DMEM 培養基洗脫細胞，離心管收集細胞懸液，離心棄上清，重懸細胞，檢測細胞存活率及 24 h 貼壁率。
1.6 微滴噴射高通量玻璃化與慢速冷凍法保存效果比較
采用接收方式為容器式收集裝置的微滴噴射玻璃化系統對 30 mL HepG2 細胞懸液進行玻璃化保存，并與常規慢速冷凍法的保存效果進行比較，比較內容包括凍存細胞量、細胞回收率、細胞存活率及 24 h 貼壁率。具體操作如下：
（1）慢速冷凍法：取含 10% DMSO 低溫保護劑的細胞懸液 1 mL 放入凍存管中，凍存前測細胞密度。在? 80 ℃ 低溫冰箱中凍存一周后，37 ℃ 水浴快速復溫。離心去上清，再加入 DMEM 培養基重懸細胞至 1 mL，檢測復溫后的細胞密度，然后如式（3）所示計算細胞回收率。
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（2）微滴噴射玻璃化：取含 5% DMSO + 0.3 mol/L 海藻糖作為低溫保護劑的細胞懸液 30 mL，噴射前測定細胞密度。放置 5 min，進行噴射實驗，并用盛滿液氮的容器式收集裝置接收微滴，實現細胞的玻璃化。待 30 mL 懸浮液噴射完后，將篩網從液氮容器中取出，放入盛有約 350 mL 37℃ 培養基的燒杯中復溫。離心管收集篩網中的細胞懸液，離心去上清。用 DMEM 培養基重懸細胞，測定重懸的細胞密度。如式（4）所示計算玻璃化保存的細胞回收率。
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1.7 數據分析
采用統計產品與服務解決方案軟件 SPSS Statistics 19.0 進行統計學分析，實驗數據用平均值 ± 標準差的形式表示，兩組間比較采用 t 檢驗，P < 0.05 為差異具有統計學意義。每組實驗需重復 3 次以上。
2 結果與討論
2.1 不同接收方式對微滴噴射玻璃化的影響結果
采用薄片式接收與容器式收集裝置接收噴射實驗產生的微滴，經玻璃化保存后的細胞存活率及 24 h 貼壁率的結果如表1 所示，采用容器式收集裝置接收微滴時，細胞的存活率和 24 h 貼壁率均高于薄片式接收組，提示該種接收方式下細胞活性明顯高于薄片式接收組，組間差異具有統計學意義。由此可見，采用容器式收集裝置接收微滴時，玻璃化保存的細胞活性更高，保存效果更理想。分析原因可總結如下：一方面，采用容器式收集裝置接收微滴，微滴與液氮直接接觸，傳熱系數增加，降溫速率明顯提升，有助于實現玻璃化；另一方面，微滴直接噴入液氮玻璃化，相對于薄片式接收，避免了薄片對細胞造成的沖擊力損傷。
表1
不同接收方式對微滴噴射玻璃化的影響
Table1.
Effect of collection methods on microdroplet spray vitrification
2.2 細胞密度對微滴噴射玻璃化的影響結果
噴射細胞密度依次為 0.5 × 106、1.0 × 106、2.0 × 106 個/mL 的細胞懸液，經玻璃化保存后的細胞存活率及 24 h 貼壁率如表2 所示。由表2 可知，當懸浮液注射系統中細胞密度成倍增加時，細胞的存活率及 24 h 貼壁率并沒有明顯變化，結果顯示組間差異不具有統計學意義。說明當細胞密度在 0.5 × 106～2 × 106 個/mL 范圍內變化，微滴噴射玻璃化保存效果不隨細胞密度的改變而改變。且細胞活性均達到 92% 上，玻璃化保存效果良好。因此，可以通過適量增加細胞密度來提高玻璃化保存細胞的數量，這將有助于解決小體積細胞高通量保存問題。
表2
細胞密度對微滴噴射玻璃化的影響
Table2.
Effect of cell density on microdroplet spray vitrification
2.3 微滴噴射高通量玻璃化與慢速冷凍法保存效果比較結果
采用微滴噴射容器式收集裝置玻璃化保存方法，并與慢速冷凍法保存結果進行比較，結果如表3 所示。對細胞處理量進行分析，發現慢速冷凍法單次能夠保存處理的懸浮液體積為 1 mL，傳統的薄片式接收微滴噴射玻璃化保存系統單次能夠處理的懸浮液體積可達 30 mL，而本文提出的容器式收集微滴噴射玻璃化保存系統的單次處理量遠不止 30 mL，能夠繼續加大到 200 mL，達到臨床實用的體積量，說明該系統具有高通量的特點。同時，采用容器式收集裝置接收微滴時，細胞回收率達 89.70% ± 1.36%，盡管相對于慢速冷凍的回收率 98.15% ± 0.53%還有一定差距，但相對于 Rami 等[14]提出的薄片式接收方式，容器式收集裝置不易造成細胞丟失，細胞回收率較高。此外，對細胞活性進行分析發現，相較于慢速冷凍法，采用容器式收集裝置玻璃化保存細胞時細胞存活率和 24 h 貼壁率均明顯較高，說明容器式收集裝置玻璃化保存效果更好。且復溫后，無需去除低溫保護劑的步驟，程序簡單。
表3
微滴噴射高通量玻璃化與慢速冷凍法的比較
Table3.
Comparison of high-throughput vitrification by micro-droplet spray and slow freezing
3 討論與展望
本文提出的微滴噴射玻璃化裝置能有效實現細胞玻璃化保存。相對于薄片式接收，容器式收集裝置有以下幾點優勢：① 薄片式接收每次僅能接收 80 μL 細胞懸浮液，保存量非常有限，容器式收集裝置單次能夠處理的細胞量大，能夠達到臨床實用量。② 薄片式接收是平面收集，長時間接收會造成細胞的堆積或丟失問題，容器式收集裝置是立體容器式，細胞懸液噴進液氮中懸浮，細胞不會產生堆積且接收完全、無丟失。③ 薄片式接收是先在薄片上接收然后投入液氮中冷凍，增加了細胞與接收材料的接觸損傷，并且由于接收材料的熱傳遞系數低，降低了細胞的玻璃化程度。容器式收集是將細胞懸液噴進液氮中，沒有接觸損傷且以超高的冷卻速率實現了細胞的玻璃化保存。
高數目尼龍網在玻璃化冷凍保存技術中已有應用。例如 Nakashima 等[18]就曾用目數 300 目，孔徑約為 48 μm 的尼龍網進行人類胚胎的玻璃化保存；后又有 Yamanaka 等[19]將目數 270 目，孔徑約 57 μm 的尼龍網作為玻璃化載體，冷凍保存直徑為 101～150 μm 的大鼠胰島細胞。人類胚胎和大鼠胰島細胞都屬于體積較大的單個樣本保存，使用單層平面尼龍網就可以實現。紅細胞、血小板、干細胞和本文中所用的 HepG2 細胞體積很小且需要大體量保存。若采用單層 300 目或是 270 目尼龍網保存小體積細胞，極易造成細胞丟失現象，因此，本文采用 2 層 500 目尼龍網疊加使用，同時將尼龍網制成立體容器式結構，提高了細胞的處理量。
相對于慢速冷凍法，本文提出的微滴噴射玻璃化保存系統所得細胞活性更高，且具有高通量的特點，有望解決小體積細胞的大體量保存問題。為了使該技術在大體量細胞凍存中更有效、便捷，還可以在以下幾個方面開展研究：① 是保護劑加載方式的優化，可采用微流控法加載低溫保護劑替代目前的一步法，減小玻璃化溶液對細胞造成的滲透損傷和毒性損傷；② 是采用仿生型低溫保護劑，降低 DMSO 的濃度或者代替 DMSO；③ 是采用封閉式的收集裝置，便于玻璃化凍存細胞的長期保存。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
