肝星狀細胞的細胞收縮力在肝臟損傷、炎癥和纖維化的過程中起著非常重要的作用。本文提出了一種基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄微柱陣列測量人肝星狀細胞系 LX-2 細胞收縮力的方法，以實現亞細胞級的細胞收縮力大小、方向、分布及其動態變化的測量。首先，運用二次鑄模工藝制備了以玻底培養皿為基底的滿足 100 倍物鏡成像工作距離的薄微柱陣列，并對微柱表面進行親水、壓印蛋白處理，再在其上接種細胞。然后，將細胞培養在無胎牛血清（FBS）培養基中以使細胞處于靜息態，再通過加入 FBS 的方法使細胞轉變為激活態。通過圖像處理技術得到不同時刻微柱頂端發生的位移，結合微柱力學仿真結果，計算得到作用在微柱上的細胞收縮力，并對細胞狀態激活前后微柱的受力情況進行了分析。本研究的實驗結果表明，靜息態時，細胞收縮力最大為 20 nN；加入 FBS 激活細胞后，細胞收縮力最大增強至 110 nN。本文所述方法可測量單個 LX-2 細胞在靜息態和激活態時的收縮力，對肝纖維化引發的慢性肝病的病理研究、藥物篩選具有重要的意義。
引用本文： 王春苒, 張帆, 單寶娟, 劉佳琪, 祝連慶. 人肝星狀細胞系LX-2激活過程細胞收縮力的實時測量. 生物醫學工程學雜志, 2019, 36(5): 841-849. doi: 10.7507/1001-5515.201810048 復制
引言
肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）位于肝竇竇周間隙內，是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的主要來源[1]。在體內的正常情況下，肝星狀細胞處于靜息狀態，不產生收縮力[2]。當肝臟發生炎癥或者受到機械性刺激時，肝星狀細胞將被激活并增殖，其表型由靜止型轉變為激活型，激活態的肝星狀細胞還可進一步轉變為肌成纖維細胞。肝星狀細胞激活后其收縮性增強，肝竇內壓隨之升高，周圍的細胞質外基質逐漸增生，繼而引發肝纖維化、肝硬化等疾病[3-4]。因此，實時的測量肝星狀細胞收縮力的大小，可以直接判斷細胞是否被激活以及激活的程度，對肝臟疾病及藥理學的研究有十分重要的意義。
傳統的測量肝星狀細胞收縮力的方法主要包括薄膜褶皺法[5-6]和膠原凝膠法[7-8]。薄膜褶皺法是將細胞培養到硅油薄膜上，在細胞收縮力的作用下，細胞底面下的薄膜會產生褶皺。通過薄膜褶皺的大小和方向，在顯微鏡下可以直觀地觀察細胞收縮力的大小和方向。例如，Liu 等[9]利用薄膜褶皺法對肝星狀細胞的收縮行為進行了研究，激活的肝星狀細胞使硅油薄膜產生了褶皺。該方法的局限性在于只能定性地判斷細胞收縮力的變化，不能量化單個細胞收縮力的大小。而膠原凝膠法是指，將細胞培養到膠原溶液中，待溶液成凝膠狀時，細胞收縮會使凝膠的面積發生變化，計算收縮前后凝膠的直徑和面積并進行統計學分析，可得到大量細胞在某一方向上的細胞收縮力矢量和。例如，張軍等[10]將濃度為 0.5 × 106個/mL 的肝星狀細胞溶液吸取 1 mL 加入凝膠晶格平皿中，根據膠原凝膠的面積變化以間接判斷細胞的收縮程度。Thimgan 等[11]將大約 5 × 105個肝星狀細胞培養在膠原凝膠中，將其與力學傳感器相連，通過測量整塊凝膠的應力變化，得到胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）刺激下所有肝星狀細胞產生的收縮力總和。雖然與薄膜褶皺法相比，膠原凝膠法可以量化收縮力，但是需要連接力學傳感器，測量技術復雜，對儀器的依賴程度大，并且得到的只是大量細胞的收縮力總和，對于單個細胞的收縮力只能進行平均計算，測量誤差大。針對這兩種方法的局限性，有必要開發一種新的測量單個肝星狀細胞收縮力的方法。
2003 年 Tan 等[12]提出了基于懸臂梁原理的微柱陣列，并在微柱陣列上培養牛肺動脈平滑肌細胞和小鼠成纖維細胞，以探究細胞鋪展面積與細胞收縮力之間的關系。自此，很多研究人員開始利用微柱陣列展開測量單個細胞收縮力的研究。2006 年 Zhao 等[13]利用微柱陣列進行了成年大鼠心肌細胞的細胞收縮力、收縮頻率以及在腎上腺素刺激下的細胞收縮力測量；2013 年 Cheng 等[14]利用微柱陣列測量血管平滑肌細胞的細胞收縮力；2014 年 Rodriguez 等[15]利用微柱陣列測量經誘導由多能干細胞分化而來的心肌細胞的細胞收縮力大小和頻率。利用微柱陣列測量細胞收縮力時，只需要將細胞培養到微柱陣列上，細胞對微柱施加作用力會使微柱發生納米量級或微米量級的變形，通過測量微柱變形量和變形方向可以得出細胞收縮力的大小和方向[16-17]。微柱陣列以其較好的生物兼容性、較高的測量效率和精度以及簡易靈活的結構成為了測量細胞收縮力的主流方法，但將其應用于肝星狀細胞收縮力的研究尚未見報導。
目前關于肝星狀細胞收縮力的研究大多是針對原代肝星狀細胞進行的。原代肝星狀細胞由人體的肝臟組織分離得到，由于肝臟組織難以獲得，并且分離出的原代肝星狀細胞在制備過程中細胞活性和生理狀態存在很大差異，所以，不同批次間原代肝星狀細胞的測量結果不便進行橫向比較。永生化的 LX-2 細胞作為人肝星狀細胞系，保留了原代肝星狀細胞的關鍵特征，還提供了穩定同源的人肝星狀細胞來源，成為了肝病研究中十分有價值的新工具[18]。
針對現有細胞收縮力測量方法的不足，本文提出了一種基于聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）薄微柱陣列測量單個 LX-2 細胞收縮力的方法，通過設計并制備以玻底培養皿為基底的 PDMS 薄微柱陣列，并利用細胞顯微圖像結合圖像處理技術，測量靜息態和激活態下細胞收縮力的大小和分布。本研究通過詳細介紹薄微柱陣列表面處理方法以及 LX-2 細胞的細胞收縮力測量方法，并對微柱制備工藝以及 FBS 對細胞收縮力的影響進行討論，以期為肝纖維化等慢性肝病的研究提供細胞力學層面的研究手段；此外，所獲得的單個 LX-2 細胞收縮力的測量結果，或可為相關疾病的病理研究和藥物篩選提供一定參考。
1 實驗材料及方法
1.1 實驗材料及儀器
主要材料及試劑：PDMS 購自美國 Dow Corning 公司；SU-8 光刻膠購自美國 Microchem 公司；1H，1H，2H，2H-全氟辛基-三氯硅烷（以下簡稱硅烷）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；肝星狀細胞系 LX-2 細胞、纖連蛋白（fibronectin）購自德國 Merck 公司；FBS 購自德國 PAN 公司；青、鏈霉素（雙抗）、達爾伯克改良伊格爾培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）購自美國 Gibco 公司。本研究中使用的三種細胞培養基的名稱及成分分別是：
（1）基礎培養基：10%FBS、90%DMEM、1% 雙抗；
（2）低濃度 FBS 培養基：2%FBS、98%DMEM、1% 雙抗；
（3）無 FBS 培養基：99%DMEM、1% 雙抗。
主要儀器設備：真空干燥箱（DZF-6020，上海一恒科技儀器有限公司，中國）；紫外臭氧清洗機（LXY-PL16，SEN Inc.，日本）；超聲波清洗機（JP-010S，深圳市潔盟清洗設備有限公司，中國）；顯微鏡用活細胞培養裝置（WELSX，Tokai Hit Inc.，日本）；倒置顯微鏡（Eclipse Ti，Nikon Instruments Inc.，美國）；60 倍油浸物鏡（MRD01605，Nikon Instruments Inc.，美國）；100 倍油浸物鏡（MRD01905，Nikon Instruments Inc.，美國）；環境掃描電子顯微鏡（以下簡稱電鏡）（Quanta200，FEI Inc.，荷蘭）。
1.2 薄微柱陣列制備
制備薄微柱陣列選用的材料是 PDMS。為了滿足高倍物鏡焦距短的成像要求，使用二次鑄模工藝加工 PDMS，得到以玻底培養皿為基底且滿足 100 倍物鏡成像工作距離的 PDMS 薄微柱陣列，其工藝流程圖如圖 1 所示，為便于理解，微柱尺寸比例進行了夸大處理。
圖1
PDMS 薄微柱陣列制備工藝流程
Figure1.
Fabrication of arrays of PDMS thin micropillars
在制備薄微柱陣列時，首先根據設計好的圖案制作光刻掩膜版，對旋涂在硅片上的 SU-8 光刻膠通過光刻掩膜版進行紫外曝光、顯影后，直徑 3 μm、高度 9 μm、中心間距 9 μm 的 SU-8 光刻膠垂直懸臂梁陣列豎立在硅片上。然后對硅片模具進行 12 h 的硅烷化處理，在微柱表面形成一層硅烷薄膜，以便于一次脫模，延長硅片模具的使用壽命。再將 PDMS 預聚物與固化劑按照 10∶1 的比例混合均勻，置于真空干燥箱中抽氣，除去其中的氣泡。將抽氣后的 PDMS 混合物澆鑄在硅模具表面，在 110℃ 下固化 30 min，脫模后得到 PDMS 微洞模具（陰模）。對陰模也進行硅烷化處理，使 PDMS 陰模表面形成硅烷薄膜，避免二次鑄模時 PDMS 之間的鍵合，保證后續脫模成功。然后，通過切割得到邊長約為 5 mm 的 PDMS 陰模，在其表面均勻涂覆 20 μL 的 PDMS 混合物，置于真空干燥箱中除氣，再將其倒扣在經紫外臭氧清洗機活化了 30 min 的玻底培養皿（底面孔直徑 10 mm）內的蓋玻片表面，輕輕按壓陰模，擠出多余的 PDMS 混合物。最后，將玻底培養皿放入真空干燥箱中，65℃ 下加熱 40 h 后取出、脫模，得到以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列。
1.3 薄微柱陣列表面處理
由于 PDMS 是高度疏水的材料，所以在接種細胞前，需要對薄微柱陣列進行親水處理。同時為了保證接種細胞時，細胞只黏附在薄微柱陣列頂端，需要在微柱頂端壓印纖連蛋白，以引導細胞的黏附行為。壓印纖連蛋白需制備 PDMS 印章，具體操作過程如下：
（1）將 PDMS 預聚物與固化劑按照 20：1 的比例混合均勻，倒入培養皿中，厚度約為 0.7 cm，放入真空干燥箱中除氣后，65℃ 加熱 2 h。
（2）將加熱后的 PDMS 切成合適大小的印章，確保印章的尺寸能夠完全覆蓋薄微柱陣列，同時又不超出玻底培養皿底部蓋玻片的范圍，以保證壓印過程中形成有效的接觸轉移。
（3）對切下來的印章進行清洗，先將其放入無水乙醇中用超聲波清洗機處理 3 min，再以 75% 乙醇消毒，使用去離子水清洗 3 次后吹干，將 50 μg/mL 的纖連蛋白溶液滴在印章表面，浸泡 1 h。
（4）將微柱樣品放在紫外臭氧清洗機中 7 min，進行親水處理。
（5）將浸泡好的印章用去離子水清洗，吹干表面后，將吸附纖連蛋白的一面小心置于薄微柱陣列上并輕輕按壓 15 s，使微柱頂端與印章表面完全接觸，保證纖連蛋白充分壓印到微柱頂端，壓印過纖連蛋白的微柱保存在 PBS 溶液中，待接種細胞使用。
1.4 薄微柱陣列上的細胞接種與培養
本文選用人肝星狀細胞系 LX-2 細胞進行實驗。LX-2 細胞是對原代人肝星狀細胞進行永生化得到的，它保留了原代肝星狀細胞的關鍵特征，克服了培養變異性的問題。
本文以基礎培養基復蘇 LX-2 細胞后，將其培養在 T25 培養瓶中，置于 CO2 培養箱中培養。待 LX-2 細胞在培養瓶中形成貼壁生長后，將培養瓶從 CO2 培養箱中移出，吸去瓶內的基礎培養基，用溫熱的無菌 PBS 溶液沖洗兩次，以洗去殘余培養基。向瓶內加入濃度為 0.25% 的胰蛋白酶溶液 1 mL，置于 CO2 培養箱中消化 3 min 后，加入 2 mL 低濃度 FBS 培養基終止消化。輕輕吹打細胞，制成細胞懸液。將細胞懸液分裝在 3 個滅菌離心管中，在轉速 1 200 r/min 下離心 3 min。離心后，小心吸去上清液，加入 1 mL 低濃度 FBS 培養基，輕輕吹打使成團的細胞重新分散成均勻的細胞懸液，備用接種。
將細胞接種至薄微柱陣列之前，先吸去玻底培養皿中的 PBS 溶液，加入 2 mL 低濃度 FBS 培養基。取上述制備的細胞懸液 0.2 mL 均勻滴在薄微柱陣列上方，制得培養在薄微柱陣列上的細胞樣品，細胞密度約為 104 個/cm2。
1.5 肝星狀細胞細胞收縮力測量方法
待接種在薄微柱陣列上的細胞樣品培養 24 h 后，將低濃度 FBS 培養基置換為 2 mL 無 FBS 培養基培養 10 h，使細胞恢復到靜息狀態[18]。然后將細胞樣品置于顯微鏡用活細胞培養裝置的培養箱中，通入含 5%CO2 的混合氣體，設定溫度為 37℃，保證細胞正常的生長環境。在倒置顯微鏡下用 60 倍油浸物鏡進行觀察，將焦平面調節到微柱頂端的細胞上，對完全鋪展在薄微柱陣列上的 LX-2 細胞以靜息狀態拍照后，加入 0.2 mL FBS，設置顯微鏡攝像機每間隔 3 s 拍照一次，拍攝時間 2 min，實時觀察在無 FBS 培養基中恢復靜息態的 LX-2 細胞加入 FBS 后的變化趨勢及 PDMS 微柱頂端的位移情況。
使用數學軟件 MATLAB（MathWorks Inc.，美國）對獲得的一系列圖像進行基本的灰度變化、濾波、二值化等處理后，利用形態學函數 regionprops 計算各微柱頂端的質心坐標。將沒有被細胞黏附的不發生偏轉的微柱質心坐標建立為參考坐標，而經細胞黏附的微柱頂端質心坐標與參考坐標做差，可以獲得微柱的位移矢量。每個微柱的實際位移量乘以微柱的剛度，可以計算出單根微柱受到的作用力大小。
如前文薄微柱陣列制備中所述，本實驗中設置的 PDMS 薄微柱陣列的固化參數為：固化溫度 65℃，固化時間 40 h，參考文獻[19]，得到 PDMS 的楊氏模量約 2.63 MPa，使用多物理場仿真軟件 COMSOL Multiphysics（COMSOL Inc.，瑞典）建模，由固體力學仿真得出微柱的偏轉位移及剛度，如圖 2 所示。在微柱頂端水平方向加載 100 nN 的作用力，通過微柱變形的仿真結果，可以看到微柱的底端無偏轉，最大偏轉發生在微柱的頂端，約為 2.4 μm。在微柱頂端水平方向加載 0～150 nN 的作用力時，通過仿真，可以得到微柱頂端受到的作用力 F 與微柱位移的關系圖，線性度良好，所以能夠計算得到直徑 3 μm、高度 9 μm 的微柱的剛度約為 42.23 nN/μm。
圖2
COMSOL Multiphysics 仿真結果
Figure2.
COMSOL Multiphysics simulation results
2 結果
2.1 薄微柱制備結果
通過以上方法制備得到的以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列，樣品邊長約 5 mm，如圖 3 所示。在活細胞的收縮力測量實驗中，為了清晰地觀察生長在微柱上的細胞形態，通常使用 60 倍及以上的高倍物鏡。由于物鏡倍數越高，工作距離越小，因此，需要制備薄微柱陣列以滿足高倍物鏡成像工作距離的要求。
圖3
PDMS 微柱樣品
Figure3.
PDMS micropillars
使用電鏡拍攝 PDMS 薄微柱陣列的截面照片，其中 PDMS 微柱高度為 8.79 μm，PDMS 基底厚度為 14.37 μm，玻底厚度為 163.55 μm。PDMS 微柱及 PDMS 基底的厚度之和約為 23 μm，實驗中使用的 100 倍油浸物鏡的工作距離為 0.13 mm，觀測時推薦使用 0.17 mm 左右厚度的玻片為樣品基底。由于 PDMS 樣品厚度（23 μm）小于 100 倍油浸物鏡的工作距離（0.13 mm），故上述方法制備的薄微柱陣列能夠滿足 100 倍物鏡成像的要求。對本文加工的薄微柱陣列樣品進行 100 倍油浸物鏡的顯微觀測，可以看到成像清晰，對比度良好。并且，從薄微柱陣列的電鏡照片可以看出，利用二次鑄模工藝制備的以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列，微柱排列均勻、大小均一。
2.2 細胞力測量結果
如圖 4 所示，第一幅子圖為薄微柱陣列上 LX-2 細胞在無 FBS 培養基環境下的生長狀態，細胞沒有受到外界刺激，保持靜息狀態，在微柱頂面完全鋪展，呈星形放射狀。加入 FBS 后，細胞被激活，開始發生明顯收縮。圖 4 中第二至第六幅子圖分別為加入 FBS 后 3、30、60、90、120 s 時 LX-2 細胞產生的細胞收縮力分布圖，其中黃色箭頭表示細胞收縮力矢量，箭頭長短代表細胞收縮力的大小，箭頭方向代表細胞收縮力的方向。
圖4
不同時間 LX-2 細胞產生的細胞收縮力分布
Figure4.
Contractile forces distribution of LX-2 cells at different time
為了更清晰地看出單個 LX-2 細胞不同位置對應的收縮力變化趨勢，選取具有代表性的 1～5 號微柱（圖 4 第一幅子圖中白色標記處），分析其在 120 s 內受到的力隨時間的變化趨勢，結果如圖 5 所示。在細胞收縮的過程中，細胞始終黏附在 1、3、5 號微柱上，而建立在 2、4 號微柱上的黏著斑在細胞收縮力的作用下分別在 20、40 s 左右發生解離，即細胞從 2、4 號微柱上脫附。這兩種情況下，相應微柱受到的作用力有著不同的變化趨勢。
圖5
不同微柱上收縮力隨時間變化曲線
Figure5.
Time-force curve on different micropillars
3 討論
3.1 薄微柱陣列制備
制備 PDMS 微柱陣列最簡便的方法是一次鑄模法[14]，如圖 6 所示。在硅片上旋涂光刻正膠，使用圓孔透光的掩膜版，通過曝光、顯影，得到光刻正膠微洞模具。將 PDMS 混合物均勻地涂覆在模具表面，固化后脫模，得到全 PDMS 基底的微柱陣列，置于普通塑料培養皿中進行細胞接種、培養以及顯微觀測。使用倒置顯微鏡觀測時，為了清晰地觀察生長在微柱上的細胞的形態變化，通常使用 60 倍及以上的高倍物鏡進行實驗。高倍物鏡的工作距離通常較小，例如，本實驗中使用的 60 倍、100 倍油浸物鏡，其工作距離均為 0.13 mm。然而，利用一次鑄模法制備的 PDMS 微柱陣列的最小厚度大約為 0.6 mm，若樣品厚度小于 0.6 mm，在脫模時易發生微柱大面積倒塌、缺失，甚至撕裂。由于樣品厚度大于顯微物鏡的工作距離，因此這種方法得到的微柱陣列在高倍物鏡下無法成像，不適合開展活細胞收縮力的原位測量研究。
圖6
一次鑄模法
Figure6.
One-step casting
為了減小 PDMS 基底的厚度，在一次鑄模法的基礎上，發展了二次鑄模工藝制備以蓋玻片為基底的微柱陣列[20]。如圖 7 所示。在陰模上澆鑄 PDMS 混合物后，覆蓋上一個蓋玻片，蓋玻片受重力作用，會對沒有固化的 PDMS 施加壓力，PDMS 會向蓋玻片外圍流動，故而減少 PDMS 基底的厚度，經固化后脫模，得到以蓋玻片為基底的微柱陣列。這種方法雖然能得到厚度滿足物鏡工作距離要求的微柱陣列，但由于細胞生長在培養液環境中，在使用倒置顯微鏡進行活細胞觀察時，蓋玻片上的微柱陣列仍需要放在培養皿中，培養皿的厚度會增加物鏡到細胞表面的距離，并且蓋玻片與培養皿之間易發生相對運動，不利于成像。
圖7
以蓋玻片為基底的微柱陣列制備流程
Figure7.
Fabrication process of micropillar arrays based on cover glass
基于此，本文利用二次鑄模工藝設計并制備了以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列，其中，PDMS 微柱及微柱基底的厚度之和約為 23 μm，玻底厚度約為 0.17 mm。這種方法制備的薄微柱陣列，不僅能夠滿足 60 倍及以上高倍物鏡的工作距離（0.13 mm），而且在玻底培養皿中培養細胞十分方便，便于操作。除此之外，將微柱陣列直接制備到玻底培養皿上，二者相對位置關系固定，實驗過程中不會產生相對移動，便于成像。
3.2 薄微柱陣列表面處理
在對 PDMS 薄微柱陣列表面進行親水處理時，有兩大類處理方法：化學修飾法和物理修飾法[21]。
化學修飾法可分為濕法修飾和通過共價鍵結合的表面改性法。濕法修飾即直接使待修飾溶液接觸 PDMS 表面，使擬修飾到 PDMS 表面的組份通過物理吸附或經典作用力被吸附到 PDMS 表面。這種方法總體較簡單，但是由于 PDMS 表面與修飾層之間并非依靠共價化學鍵連接，所以修飾的穩定性欠佳。通過共價鍵結合的表面改性法是通過化學反應使修飾層以共價鍵鍵合于 PDMS 表面。這種方法的優點是修飾層穩定，改性后表面性質保持時間長。但是操作方法較復雜，耗時比較長。
物理修飾法采用高能物質作用于 PDMS 表面，以改變 PDMS 表面化學的組成性質，主要方法包括氧等離子體處理、紫外光照加臭氧處理等。這些方法操作簡單，能在 PDMS 表面生成羥基等親水基團，而使其親水性得到明顯的改善，不足之處是親水性會隨著放置時間的增長而退化。由于玻底培養皿主體部分屬于有機材料，不適用于氧等離子體處理，所以本實驗采用紫外臭氧清洗機處理玻底培養皿中的薄微柱樣品表面 7 min 后，需在 30 min 內完成后續實驗操作。
3.3 FBS 對細胞收縮力的影響
LX-2 細胞是永生化的人肝星狀細胞系，是原代肝星狀細胞通過在較低 FBS 濃度環境下培養和篩選實現永生化的。在體外培養 LX-2 細胞時，按照 LX-2 細胞系推薦的培養方法，使用低濃度 FBS 培養基。有研究表明，在無 FBS 培養基中，LX-2 細胞會恢復到靜息狀態，而基礎培養基中 10% 濃度的 FBS 可以激活 LX-2 細胞使其產生明顯的收縮[22]。
對不同時刻細胞的顯微圖像進行處理，觀察到未加入 FBS 時，部分被細胞黏附的微柱（如 1～5 號）頂端已經存在一定程度的位移，微柱受力平均值約為 12 nN，其中 4 號微柱上受到的力最大，最大值為 20 nN。表明 LX-2 細胞在經過無 FBS 培養基培養恢復到靜息狀態時，仍然會對基底施加作用力，這可能是細胞在黏附過程中產生的牽引力（cell traction force）。
加入 FBS 后，可以看到靜息態的 LX-2 細胞立即被激活，發生明顯的收縮現象。細胞收縮使微柱頂端發生位移，微柱頂端受到的力即為細胞的收縮力。可以看到細胞邊緣不同位置的收縮力都明顯增強，呈現穩定的上升趨勢。20～50 s 內，由于收縮力持續增大，細胞骨架內部牽引力超過了部分黏著斑脫附的臨界值，發生黏著斑解離現象，細胞偽足脫離黏附的微柱（例如 2、4 號），偏轉的微柱很快恢復到正常的豎直狀態，微柱上受到的力從其最大值迅速下降至 0。仍然被細胞黏附的微柱（1、3、5 號），受到的作用力逐漸增加至最大值，單個 LX-2 細胞在單根微柱上施加的細胞收縮力最大值約為 110 nN，達到最大值后逐漸穩定在最大值附近，且臨近的微柱（如 1、3、5 號）受到的最大收縮力的水平相當。
實驗表明，LX-2 細胞在高濃度 FBS 刺激下發生收縮的過程中，細胞骨架產生的力通過黏著斑作用到微柱上，并且同一細胞在不同區域的收縮力大小、方向不同，收縮力方向均指向細胞中心。不同區域黏著斑發生解離的收縮力臨界值、解離時間也各不相同。
4 結論
本文提出了一種基于 PDMS 薄微柱陣列測量單個 LX-2 細胞收縮力的方法，制備了以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列，研究了薄微柱陣列表面處理及接種、培養細胞的方法，展開了 LX-2 細胞靜息態和激活態下細胞收縮力測量的實驗研究。實驗得到了激活過程中細胞始終黏附和逐漸脫附的兩類微柱的典型受力曲線，并對比分析了不同微柱上受到的收縮力、黏著斑解離時間等。相比其他方法，本文提出的基于薄微柱陣列的測量方法不僅可以使用高倍物鏡實現細胞收縮力的實時觀測，還首次量化了單個 LX-2 細胞不同區域的收縮力，可為肝纖維化等慢性肝病的病理研究和藥物篩選提供細胞力學層面的參考，對未來肝臟疾病的預防和臨床治療有重要意義。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
引言
肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC）位于肝竇竇周間隙內，是細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的主要來源[1]。在體內的正常情況下，肝星狀細胞處于靜息狀態，不產生收縮力[2]。當肝臟發生炎癥或者受到機械性刺激時，肝星狀細胞將被激活并增殖，其表型由靜止型轉變為激活型，激活態的肝星狀細胞還可進一步轉變為肌成纖維細胞。肝星狀細胞激活后其收縮性增強，肝竇內壓隨之升高，周圍的細胞質外基質逐漸增生，繼而引發肝纖維化、肝硬化等疾病[3-4]。因此，實時的測量肝星狀細胞收縮力的大小，可以直接判斷細胞是否被激活以及激活的程度，對肝臟疾病及藥理學的研究有十分重要的意義。
傳統的測量肝星狀細胞收縮力的方法主要包括薄膜褶皺法[5-6]和膠原凝膠法[7-8]。薄膜褶皺法是將細胞培養到硅油薄膜上，在細胞收縮力的作用下，細胞底面下的薄膜會產生褶皺。通過薄膜褶皺的大小和方向，在顯微鏡下可以直觀地觀察細胞收縮力的大小和方向。例如，Liu 等[9]利用薄膜褶皺法對肝星狀細胞的收縮行為進行了研究，激活的肝星狀細胞使硅油薄膜產生了褶皺。該方法的局限性在于只能定性地判斷細胞收縮力的變化，不能量化單個細胞收縮力的大小。而膠原凝膠法是指，將細胞培養到膠原溶液中，待溶液成凝膠狀時，細胞收縮會使凝膠的面積發生變化，計算收縮前后凝膠的直徑和面積并進行統計學分析，可得到大量細胞在某一方向上的細胞收縮力矢量和。例如，張軍等[10]將濃度為 0.5 × 106個/mL 的肝星狀細胞溶液吸取 1 mL 加入凝膠晶格平皿中，根據膠原凝膠的面積變化以間接判斷細胞的收縮程度。Thimgan 等[11]將大約 5 × 105個肝星狀細胞培養在膠原凝膠中，將其與力學傳感器相連，通過測量整塊凝膠的應力變化，得到胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）刺激下所有肝星狀細胞產生的收縮力總和。雖然與薄膜褶皺法相比，膠原凝膠法可以量化收縮力，但是需要連接力學傳感器，測量技術復雜，對儀器的依賴程度大，并且得到的只是大量細胞的收縮力總和，對于單個細胞的收縮力只能進行平均計算，測量誤差大。針對這兩種方法的局限性，有必要開發一種新的測量單個肝星狀細胞收縮力的方法。
2003 年 Tan 等[12]提出了基于懸臂梁原理的微柱陣列，并在微柱陣列上培養牛肺動脈平滑肌細胞和小鼠成纖維細胞，以探究細胞鋪展面積與細胞收縮力之間的關系。自此，很多研究人員開始利用微柱陣列展開測量單個細胞收縮力的研究。2006 年 Zhao 等[13]利用微柱陣列進行了成年大鼠心肌細胞的細胞收縮力、收縮頻率以及在腎上腺素刺激下的細胞收縮力測量；2013 年 Cheng 等[14]利用微柱陣列測量血管平滑肌細胞的細胞收縮力；2014 年 Rodriguez 等[15]利用微柱陣列測量經誘導由多能干細胞分化而來的心肌細胞的細胞收縮力大小和頻率。利用微柱陣列測量細胞收縮力時，只需要將細胞培養到微柱陣列上，細胞對微柱施加作用力會使微柱發生納米量級或微米量級的變形，通過測量微柱變形量和變形方向可以得出細胞收縮力的大小和方向[16-17]。微柱陣列以其較好的生物兼容性、較高的測量效率和精度以及簡易靈活的結構成為了測量細胞收縮力的主流方法，但將其應用于肝星狀細胞收縮力的研究尚未見報導。
目前關于肝星狀細胞收縮力的研究大多是針對原代肝星狀細胞進行的。原代肝星狀細胞由人體的肝臟組織分離得到，由于肝臟組織難以獲得，并且分離出的原代肝星狀細胞在制備過程中細胞活性和生理狀態存在很大差異，所以，不同批次間原代肝星狀細胞的測量結果不便進行橫向比較。永生化的 LX-2 細胞作為人肝星狀細胞系，保留了原代肝星狀細胞的關鍵特征，還提供了穩定同源的人肝星狀細胞來源，成為了肝病研究中十分有價值的新工具[18]。
針對現有細胞收縮力測量方法的不足，本文提出了一種基于聚二甲基硅氧烷（polydimethylsiloxane，PDMS）薄微柱陣列測量單個 LX-2 細胞收縮力的方法，通過設計并制備以玻底培養皿為基底的 PDMS 薄微柱陣列，并利用細胞顯微圖像結合圖像處理技術，測量靜息態和激活態下細胞收縮力的大小和分布。本研究通過詳細介紹薄微柱陣列表面處理方法以及 LX-2 細胞的細胞收縮力測量方法，并對微柱制備工藝以及 FBS 對細胞收縮力的影響進行討論，以期為肝纖維化等慢性肝病的研究提供細胞力學層面的研究手段；此外，所獲得的單個 LX-2 細胞收縮力的測量結果，或可為相關疾病的病理研究和藥物篩選提供一定參考。
1 實驗材料及方法
1.1 實驗材料及儀器
主要材料及試劑：PDMS 購自美國 Dow Corning 公司；SU-8 光刻膠購自美國 Microchem 公司；1H，1H，2H，2H-全氟辛基-三氯硅烷（以下簡稱硅烷）購自美國 Sigma-Aldrich 公司；肝星狀細胞系 LX-2 細胞、纖連蛋白（fibronectin）購自德國 Merck 公司；FBS 購自德國 PAN 公司；青、鏈霉素（雙抗）、達爾伯克改良伊格爾培養基（dulbecco's modified eagle medium，DMEM）、胰蛋白酶、磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）購自美國 Gibco 公司。本研究中使用的三種細胞培養基的名稱及成分分別是：
（1）基礎培養基：10%FBS、90%DMEM、1% 雙抗；
（2）低濃度 FBS 培養基：2%FBS、98%DMEM、1% 雙抗；
（3）無 FBS 培養基：99%DMEM、1% 雙抗。
主要儀器設備：真空干燥箱（DZF-6020，上海一恒科技儀器有限公司，中國）；紫外臭氧清洗機（LXY-PL16，SEN Inc.，日本）；超聲波清洗機（JP-010S，深圳市潔盟清洗設備有限公司，中國）；顯微鏡用活細胞培養裝置（WELSX，Tokai Hit Inc.，日本）；倒置顯微鏡（Eclipse Ti，Nikon Instruments Inc.，美國）；60 倍油浸物鏡（MRD01605，Nikon Instruments Inc.，美國）；100 倍油浸物鏡（MRD01905，Nikon Instruments Inc.，美國）；環境掃描電子顯微鏡（以下簡稱電鏡）（Quanta200，FEI Inc.，荷蘭）。
1.2 薄微柱陣列制備
制備薄微柱陣列選用的材料是 PDMS。為了滿足高倍物鏡焦距短的成像要求，使用二次鑄模工藝加工 PDMS，得到以玻底培養皿為基底且滿足 100 倍物鏡成像工作距離的 PDMS 薄微柱陣列，其工藝流程圖如圖 1 所示，為便于理解，微柱尺寸比例進行了夸大處理。
圖1
PDMS 薄微柱陣列制備工藝流程
Figure1.
Fabrication of arrays of PDMS thin micropillars
在制備薄微柱陣列時，首先根據設計好的圖案制作光刻掩膜版，對旋涂在硅片上的 SU-8 光刻膠通過光刻掩膜版進行紫外曝光、顯影后，直徑 3 μm、高度 9 μm、中心間距 9 μm 的 SU-8 光刻膠垂直懸臂梁陣列豎立在硅片上。然后對硅片模具進行 12 h 的硅烷化處理，在微柱表面形成一層硅烷薄膜，以便于一次脫模，延長硅片模具的使用壽命。再將 PDMS 預聚物與固化劑按照 10∶1 的比例混合均勻，置于真空干燥箱中抽氣，除去其中的氣泡。將抽氣后的 PDMS 混合物澆鑄在硅模具表面，在 110℃ 下固化 30 min，脫模后得到 PDMS 微洞模具（陰模）。對陰模也進行硅烷化處理，使 PDMS 陰模表面形成硅烷薄膜，避免二次鑄模時 PDMS 之間的鍵合，保證后續脫模成功。然后，通過切割得到邊長約為 5 mm 的 PDMS 陰模，在其表面均勻涂覆 20 μL 的 PDMS 混合物，置于真空干燥箱中除氣，再將其倒扣在經紫外臭氧清洗機活化了 30 min 的玻底培養皿（底面孔直徑 10 mm）內的蓋玻片表面，輕輕按壓陰模，擠出多余的 PDMS 混合物。最后，將玻底培養皿放入真空干燥箱中，65℃ 下加熱 40 h 后取出、脫模，得到以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列。
1.3 薄微柱陣列表面處理
由于 PDMS 是高度疏水的材料，所以在接種細胞前，需要對薄微柱陣列進行親水處理。同時為了保證接種細胞時，細胞只黏附在薄微柱陣列頂端，需要在微柱頂端壓印纖連蛋白，以引導細胞的黏附行為。壓印纖連蛋白需制備 PDMS 印章，具體操作過程如下：
（1）將 PDMS 預聚物與固化劑按照 20：1 的比例混合均勻，倒入培養皿中，厚度約為 0.7 cm，放入真空干燥箱中除氣后，65℃ 加熱 2 h。
（2）將加熱后的 PDMS 切成合適大小的印章，確保印章的尺寸能夠完全覆蓋薄微柱陣列，同時又不超出玻底培養皿底部蓋玻片的范圍，以保證壓印過程中形成有效的接觸轉移。
（3）對切下來的印章進行清洗，先將其放入無水乙醇中用超聲波清洗機處理 3 min，再以 75% 乙醇消毒，使用去離子水清洗 3 次后吹干，將 50 μg/mL 的纖連蛋白溶液滴在印章表面，浸泡 1 h。
（4）將微柱樣品放在紫外臭氧清洗機中 7 min，進行親水處理。
（5）將浸泡好的印章用去離子水清洗，吹干表面后，將吸附纖連蛋白的一面小心置于薄微柱陣列上并輕輕按壓 15 s，使微柱頂端與印章表面完全接觸，保證纖連蛋白充分壓印到微柱頂端，壓印過纖連蛋白的微柱保存在 PBS 溶液中，待接種細胞使用。
1.4 薄微柱陣列上的細胞接種與培養
本文選用人肝星狀細胞系 LX-2 細胞進行實驗。LX-2 細胞是對原代人肝星狀細胞進行永生化得到的，它保留了原代肝星狀細胞的關鍵特征，克服了培養變異性的問題。
本文以基礎培養基復蘇 LX-2 細胞后，將其培養在 T25 培養瓶中，置于 CO2 培養箱中培養。待 LX-2 細胞在培養瓶中形成貼壁生長后，將培養瓶從 CO2 培養箱中移出，吸去瓶內的基礎培養基，用溫熱的無菌 PBS 溶液沖洗兩次，以洗去殘余培養基。向瓶內加入濃度為 0.25% 的胰蛋白酶溶液 1 mL，置于 CO2 培養箱中消化 3 min 后，加入 2 mL 低濃度 FBS 培養基終止消化。輕輕吹打細胞，制成細胞懸液。將細胞懸液分裝在 3 個滅菌離心管中，在轉速 1 200 r/min 下離心 3 min。離心后，小心吸去上清液，加入 1 mL 低濃度 FBS 培養基，輕輕吹打使成團的細胞重新分散成均勻的細胞懸液，備用接種。
將細胞接種至薄微柱陣列之前，先吸去玻底培養皿中的 PBS 溶液，加入 2 mL 低濃度 FBS 培養基。取上述制備的細胞懸液 0.2 mL 均勻滴在薄微柱陣列上方，制得培養在薄微柱陣列上的細胞樣品，細胞密度約為 104 個/cm2。
1.5 肝星狀細胞細胞收縮力測量方法
待接種在薄微柱陣列上的細胞樣品培養 24 h 后，將低濃度 FBS 培養基置換為 2 mL 無 FBS 培養基培養 10 h，使細胞恢復到靜息狀態[18]。然后將細胞樣品置于顯微鏡用活細胞培養裝置的培養箱中，通入含 5%CO2 的混合氣體，設定溫度為 37℃，保證細胞正常的生長環境。在倒置顯微鏡下用 60 倍油浸物鏡進行觀察，將焦平面調節到微柱頂端的細胞上，對完全鋪展在薄微柱陣列上的 LX-2 細胞以靜息狀態拍照后，加入 0.2 mL FBS，設置顯微鏡攝像機每間隔 3 s 拍照一次，拍攝時間 2 min，實時觀察在無 FBS 培養基中恢復靜息態的 LX-2 細胞加入 FBS 后的變化趨勢及 PDMS 微柱頂端的位移情況。
使用數學軟件 MATLAB（MathWorks Inc.，美國）對獲得的一系列圖像進行基本的灰度變化、濾波、二值化等處理后，利用形態學函數 regionprops 計算各微柱頂端的質心坐標。將沒有被細胞黏附的不發生偏轉的微柱質心坐標建立為參考坐標，而經細胞黏附的微柱頂端質心坐標與參考坐標做差，可以獲得微柱的位移矢量。每個微柱的實際位移量乘以微柱的剛度，可以計算出單根微柱受到的作用力大小。
如前文薄微柱陣列制備中所述，本實驗中設置的 PDMS 薄微柱陣列的固化參數為：固化溫度 65℃，固化時間 40 h，參考文獻[19]，得到 PDMS 的楊氏模量約 2.63 MPa，使用多物理場仿真軟件 COMSOL Multiphysics（COMSOL Inc.，瑞典）建模，由固體力學仿真得出微柱的偏轉位移及剛度，如圖 2 所示。在微柱頂端水平方向加載 100 nN 的作用力，通過微柱變形的仿真結果，可以看到微柱的底端無偏轉，最大偏轉發生在微柱的頂端，約為 2.4 μm。在微柱頂端水平方向加載 0～150 nN 的作用力時，通過仿真，可以得到微柱頂端受到的作用力 F 與微柱位移的關系圖，線性度良好，所以能夠計算得到直徑 3 μm、高度 9 μm 的微柱的剛度約為 42.23 nN/μm。
圖2
COMSOL Multiphysics 仿真結果
Figure2.
COMSOL Multiphysics simulation results
2 結果
2.1 薄微柱制備結果
通過以上方法制備得到的以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列，樣品邊長約 5 mm，如圖 3 所示。在活細胞的收縮力測量實驗中，為了清晰地觀察生長在微柱上的細胞形態，通常使用 60 倍及以上的高倍物鏡。由于物鏡倍數越高，工作距離越小，因此，需要制備薄微柱陣列以滿足高倍物鏡成像工作距離的要求。
圖3
PDMS 微柱樣品
Figure3.
PDMS micropillars
使用電鏡拍攝 PDMS 薄微柱陣列的截面照片，其中 PDMS 微柱高度為 8.79 μm，PDMS 基底厚度為 14.37 μm，玻底厚度為 163.55 μm。PDMS 微柱及 PDMS 基底的厚度之和約為 23 μm，實驗中使用的 100 倍油浸物鏡的工作距離為 0.13 mm，觀測時推薦使用 0.17 mm 左右厚度的玻片為樣品基底。由于 PDMS 樣品厚度（23 μm）小于 100 倍油浸物鏡的工作距離（0.13 mm），故上述方法制備的薄微柱陣列能夠滿足 100 倍物鏡成像的要求。對本文加工的薄微柱陣列樣品進行 100 倍油浸物鏡的顯微觀測，可以看到成像清晰，對比度良好。并且，從薄微柱陣列的電鏡照片可以看出，利用二次鑄模工藝制備的以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列，微柱排列均勻、大小均一。
2.2 細胞力測量結果
如圖 4 所示，第一幅子圖為薄微柱陣列上 LX-2 細胞在無 FBS 培養基環境下的生長狀態，細胞沒有受到外界刺激，保持靜息狀態，在微柱頂面完全鋪展，呈星形放射狀。加入 FBS 后，細胞被激活，開始發生明顯收縮。圖 4 中第二至第六幅子圖分別為加入 FBS 后 3、30、60、90、120 s 時 LX-2 細胞產生的細胞收縮力分布圖，其中黃色箭頭表示細胞收縮力矢量，箭頭長短代表細胞收縮力的大小，箭頭方向代表細胞收縮力的方向。
圖4
不同時間 LX-2 細胞產生的細胞收縮力分布
Figure4.
Contractile forces distribution of LX-2 cells at different time
為了更清晰地看出單個 LX-2 細胞不同位置對應的收縮力變化趨勢，選取具有代表性的 1～5 號微柱（圖 4 第一幅子圖中白色標記處），分析其在 120 s 內受到的力隨時間的變化趨勢，結果如圖 5 所示。在細胞收縮的過程中，細胞始終黏附在 1、3、5 號微柱上，而建立在 2、4 號微柱上的黏著斑在細胞收縮力的作用下分別在 20、40 s 左右發生解離，即細胞從 2、4 號微柱上脫附。這兩種情況下，相應微柱受到的作用力有著不同的變化趨勢。
圖5
不同微柱上收縮力隨時間變化曲線
Figure5.
Time-force curve on different micropillars
3 討論
3.1 薄微柱陣列制備
制備 PDMS 微柱陣列最簡便的方法是一次鑄模法[14]，如圖 6 所示。在硅片上旋涂光刻正膠，使用圓孔透光的掩膜版，通過曝光、顯影，得到光刻正膠微洞模具。將 PDMS 混合物均勻地涂覆在模具表面，固化后脫模，得到全 PDMS 基底的微柱陣列，置于普通塑料培養皿中進行細胞接種、培養以及顯微觀測。使用倒置顯微鏡觀測時，為了清晰地觀察生長在微柱上的細胞的形態變化，通常使用 60 倍及以上的高倍物鏡進行實驗。高倍物鏡的工作距離通常較小，例如，本實驗中使用的 60 倍、100 倍油浸物鏡，其工作距離均為 0.13 mm。然而，利用一次鑄模法制備的 PDMS 微柱陣列的最小厚度大約為 0.6 mm，若樣品厚度小于 0.6 mm，在脫模時易發生微柱大面積倒塌、缺失，甚至撕裂。由于樣品厚度大于顯微物鏡的工作距離，因此這種方法得到的微柱陣列在高倍物鏡下無法成像，不適合開展活細胞收縮力的原位測量研究。
圖6
一次鑄模法
Figure6.
One-step casting
為了減小 PDMS 基底的厚度，在一次鑄模法的基礎上，發展了二次鑄模工藝制備以蓋玻片為基底的微柱陣列[20]。如圖 7 所示。在陰模上澆鑄 PDMS 混合物后，覆蓋上一個蓋玻片，蓋玻片受重力作用，會對沒有固化的 PDMS 施加壓力，PDMS 會向蓋玻片外圍流動，故而減少 PDMS 基底的厚度，經固化后脫模，得到以蓋玻片為基底的微柱陣列。這種方法雖然能得到厚度滿足物鏡工作距離要求的微柱陣列，但由于細胞生長在培養液環境中，在使用倒置顯微鏡進行活細胞觀察時，蓋玻片上的微柱陣列仍需要放在培養皿中，培養皿的厚度會增加物鏡到細胞表面的距離，并且蓋玻片與培養皿之間易發生相對運動，不利于成像。
圖7
以蓋玻片為基底的微柱陣列制備流程
Figure7.
Fabrication process of micropillar arrays based on cover glass
基于此，本文利用二次鑄模工藝設計并制備了以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列，其中，PDMS 微柱及微柱基底的厚度之和約為 23 μm，玻底厚度約為 0.17 mm。這種方法制備的薄微柱陣列，不僅能夠滿足 60 倍及以上高倍物鏡的工作距離（0.13 mm），而且在玻底培養皿中培養細胞十分方便，便于操作。除此之外，將微柱陣列直接制備到玻底培養皿上，二者相對位置關系固定，實驗過程中不會產生相對移動，便于成像。
3.2 薄微柱陣列表面處理
在對 PDMS 薄微柱陣列表面進行親水處理時，有兩大類處理方法：化學修飾法和物理修飾法[21]。
化學修飾法可分為濕法修飾和通過共價鍵結合的表面改性法。濕法修飾即直接使待修飾溶液接觸 PDMS 表面，使擬修飾到 PDMS 表面的組份通過物理吸附或經典作用力被吸附到 PDMS 表面。這種方法總體較簡單，但是由于 PDMS 表面與修飾層之間并非依靠共價化學鍵連接，所以修飾的穩定性欠佳。通過共價鍵結合的表面改性法是通過化學反應使修飾層以共價鍵鍵合于 PDMS 表面。這種方法的優點是修飾層穩定，改性后表面性質保持時間長。但是操作方法較復雜，耗時比較長。
物理修飾法采用高能物質作用于 PDMS 表面，以改變 PDMS 表面化學的組成性質，主要方法包括氧等離子體處理、紫外光照加臭氧處理等。這些方法操作簡單，能在 PDMS 表面生成羥基等親水基團，而使其親水性得到明顯的改善，不足之處是親水性會隨著放置時間的增長而退化。由于玻底培養皿主體部分屬于有機材料，不適用于氧等離子體處理，所以本實驗采用紫外臭氧清洗機處理玻底培養皿中的薄微柱樣品表面 7 min 后，需在 30 min 內完成后續實驗操作。
3.3 FBS 對細胞收縮力的影響
LX-2 細胞是永生化的人肝星狀細胞系，是原代肝星狀細胞通過在較低 FBS 濃度環境下培養和篩選實現永生化的。在體外培養 LX-2 細胞時，按照 LX-2 細胞系推薦的培養方法，使用低濃度 FBS 培養基。有研究表明，在無 FBS 培養基中，LX-2 細胞會恢復到靜息狀態，而基礎培養基中 10% 濃度的 FBS 可以激活 LX-2 細胞使其產生明顯的收縮[22]。
對不同時刻細胞的顯微圖像進行處理，觀察到未加入 FBS 時，部分被細胞黏附的微柱（如 1～5 號）頂端已經存在一定程度的位移，微柱受力平均值約為 12 nN，其中 4 號微柱上受到的力最大，最大值為 20 nN。表明 LX-2 細胞在經過無 FBS 培養基培養恢復到靜息狀態時，仍然會對基底施加作用力，這可能是細胞在黏附過程中產生的牽引力（cell traction force）。
加入 FBS 后，可以看到靜息態的 LX-2 細胞立即被激活，發生明顯的收縮現象。細胞收縮使微柱頂端發生位移，微柱頂端受到的力即為細胞的收縮力。可以看到細胞邊緣不同位置的收縮力都明顯增強，呈現穩定的上升趨勢。20～50 s 內，由于收縮力持續增大，細胞骨架內部牽引力超過了部分黏著斑脫附的臨界值，發生黏著斑解離現象，細胞偽足脫離黏附的微柱（例如 2、4 號），偏轉的微柱很快恢復到正常的豎直狀態，微柱上受到的力從其最大值迅速下降至 0。仍然被細胞黏附的微柱（1、3、5 號），受到的作用力逐漸增加至最大值，單個 LX-2 細胞在單根微柱上施加的細胞收縮力最大值約為 110 nN，達到最大值后逐漸穩定在最大值附近，且臨近的微柱（如 1、3、5 號）受到的最大收縮力的水平相當。
實驗表明，LX-2 細胞在高濃度 FBS 刺激下發生收縮的過程中，細胞骨架產生的力通過黏著斑作用到微柱上，并且同一細胞在不同區域的收縮力大小、方向不同，收縮力方向均指向細胞中心。不同區域黏著斑發生解離的收縮力臨界值、解離時間也各不相同。
4 結論
本文提出了一種基于 PDMS 薄微柱陣列測量單個 LX-2 細胞收縮力的方法，制備了以玻底培養皿為基底的薄微柱陣列，研究了薄微柱陣列表面處理及接種、培養細胞的方法，展開了 LX-2 細胞靜息態和激活態下細胞收縮力測量的實驗研究。實驗得到了激活過程中細胞始終黏附和逐漸脫附的兩類微柱的典型受力曲線，并對比分析了不同微柱上受到的收縮力、黏著斑解離時間等。相比其他方法，本文提出的基于薄微柱陣列的測量方法不僅可以使用高倍物鏡實現細胞收縮力的實時觀測，還首次量化了單個 LX-2 細胞不同區域的收縮力，可為肝纖維化等慢性肝病的病理研究和藥物篩選提供細胞力學層面的參考，對未來肝臟疾病的預防和臨床治療有重要意義。
利益沖突聲明：本文全體作者均聲明不存在利益沖突。
