聲致成孔通過超聲介導微泡的空化作用使得細胞膜產生暫態孔隙，可以提高藥物和基因的過膜轉運效率。目前常見聲致成孔中單個微泡在超聲場中的動力學和單個微泡對細胞作用力學的研究，但是未見存在兩個微泡相鄰時對細胞產生聲孔的可能性的研究分析。本文分析超聲場中兩個微泡相鄰情況下的一種聲致成孔的情況，即建立微泡受到鄰近另一微泡的次 Bjerknes 力作用時的動力學模型，及其對細胞的力學作用。本文根據實際可能的參數設置，通過數值模擬研究了：（1）超聲和微泡等參數對次 Bjerknes 力值的影響；（2）在相鄰穩態振動微泡給予的次 Bjerknes 力作用下，微泡對細胞膜的作用力；（3）當微泡給予細胞作用力超過細胞膜耐受剪切力閾值時產生聲致成孔的可能性。通過模擬分析，本文給出了兩個相鄰微泡穩態振動時，可能產生聲孔的超聲照射和微泡參數，并首次發現相對于超聲照射參數來說，微泡參數對次 Bjerknes 力的影響較大。
引用本文： 徐良, 林鐘石, 沈圓圓, 余皓. 超聲介導微泡對細胞的聲致成孔作用中次Bjerknes力的影響. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(6): 864-869. doi: 10.7507/1001-5515.201801017 復制
引言
超聲介導微泡的空化效應使細胞膜破裂產生可逆孔隙，被稱為聲致成孔（sonoporation）[1]。被細胞膜攔截的大分子藥物/基因可通過聲孔進入細胞，并且細胞可在藥物/基因進入后短時間內自行修復細胞膜上的聲孔[2]。由于聲致成孔提高了藥物/基因的過膜轉運效率，并且沒有其他轉運技術的各類缺陷，因此，目前對超聲介導微泡促進藥物/基因轉運的效果和機制展開了大量的研究[3-5]。
Lentacker 等[6]總結超聲介導微泡對細胞產生聲致成孔的機制中指出：在穩態空化時，微泡直接對細胞膜產生推拉作用，微泡在細胞膜邊穩態振動產生聲微流；在瞬態空化時，微泡劇烈膨脹后坍塌產生激波，微泡受附近細胞膜影響變形產生微射流。微泡產生的聲微流和微射流都可能會使細胞膜產生孔隙，從而促進細胞膜攔截的藥物或基因從細胞外通過孔隙直接進入細胞內。
然而以往對聲致成孔的機制研究集中于單一微泡的動力學及其對細胞邊界的作用力[7-8]。這種僅對聲致成孔中單個微泡的研究并不全面，因為這樣忽略了對實際細胞實驗中很可能存在的兩個相鄰微泡之間以及它們對細胞邊界作用力的研究。在超聲場中的微泡穩態振動或瞬態坍塌，會引起該微泡和相鄰另一微泡之間產生相互的吸引力和排斥力，該力被稱為次 Bjerknes 力，這種力在單個微泡的情況下是不存在的。也就是說，當附近有另一微泡時，微泡會受另一微泡的次 Bjerknes 力的作用[9-11]。此外，微泡還會受到超聲場梯度產生的能夠使單個微泡向波節或波腹不斷靠近或遠離的主 Bjerknes 力，在本文中不做考慮。
因此，本文首次分析了兩個相鄰穩態振動的微泡可能產生聲致成孔的作用效果。本文采用建立數學模型和數值模擬的方法，分析了在穩態空化時微泡受到的相鄰微泡的次 Bjerknes 力，并討論了不同參數條件下微泡受到的次 Bjerknes 力對細胞產生聲孔的可能性。
1 數學模型及其方法
1.1 模型及其簡化假設
微泡與細胞的相互位置關系如圖 1a 所示，貼壁細胞面朝下，在連續的細胞膜界面上，存在相鄰兩個微泡。在 Y 軸方向上，由于微泡受到的浮力 Fbuoy 和細胞給予的壓力 Fpy 始終保持平衡，因此錨合在細胞上的兩個微泡被固定在貼壁細胞的附近。在 X 軸方向上，當微泡 1 附近有另一個振動微泡 2 時，微泡 1 受到微泡 2 振動產生的次 Bjerknes 力（FB）。在受到 FB 作用的過程中，錨合到細胞上的微泡 1 受到細胞通過配體—受體給予其的反向拉力 Fpx。如果微泡 1 因為受到微泡 2 的 FB 作用過大從而脫離細胞，那么浮游的微泡 1 將受到環境液體給予的粘滯阻力 Fvis，和貼于細胞膜時細胞膜給予的動摩擦力 Ff。兩個微泡的受力如圖 1b 所示。
圖1
貼壁細胞和微泡的相互位置簡化圖
a. 由于浮力和細胞通過配體-受體給予的壓力之間的平衡，兩個微泡被固定在貼壁細胞的附近；b. 微泡受到的作用力的分解示意圖
Figure1. The simplified graph of the mutual location between an adherent cell and microbubblesa. because of the balance between buoyancy and the pressure administered by cell through receptor-ligand interaction, two adjacent microbubbles are fixed on the cell membrane; b. the decomposition diagram of forces received by a microbubble
為了建立合理的數學模型，我們還對細胞、微泡和超聲場做了以下假設：① 微泡 1 附近有且僅有另一個微泡 2；② 微泡在細胞邊界的穩態振動始終保持球形；③ 由于細胞邊界一般高度不超過數個微米，因此假設微泡 1 和微泡 2 在一水平面上，即微泡之間的次 Bjerknes 力僅在 X 軸上，微泡如果脫離細胞產生運動，它受到的環境液體粘滯阻力、細胞反向拉力、細胞膜動摩擦力等也僅在 X 軸上；④ 細胞在高頻低壓超聲作用下類似一個粘性耗散系統，即細胞在高頻低壓超聲作用下的振動可忽略，反射超聲波可忽略，因此細胞邊界不會給予微泡次 Bjerknes 力；⑤ 由于細胞直徑、微泡直徑和相鄰微泡距離都僅為微米級，因此假設超聲場在很小范圍內是均勻的，即微泡受到的聲輻射力為零，且細胞邊界的超聲場僅隨發射聲場變化而變化。
1.2 微泡動力學模型的建立
定義
、
和
是微泡的瞬時半徑及其一次時間導數和二次時間導數。定義 x、
和
是微泡 1 的瞬時 X 軸位置及其一次時間導數和二次時間導數。凡是下標 2 均為表示微泡 2 的參數。
首先考慮在 Y 軸方向上微泡 1 受到的作用力。微泡 1 的凈浮力 Fbuoy（微泡包膜內氣體產生的浮力減掉微泡包膜所受的重力）及其與細胞給微泡 1 的壓力 Fpy 之間的平衡方程分別為：
 |
 |
式中，R 為微泡的瞬時半徑，
為微泡包膜的厚度，ρ 和 ρsh 分別為微泡環境液體的密度和微泡包膜的密度。
然后考慮在 X 軸方向上微泡 1 受到的作用力。如 1.1 節中所述，需要區分微泡 1 被配體—受體錨合在細胞上和微泡 1 脫離細胞后浮游這兩種情況分析其受力。對于錨合的微泡 1，當其受到附近振動微泡 2 的 FB 后，細胞通過配體—受體對其產生與之對抗的拉力 Fpx、錨合的微泡 1 受到的 FB，以及細胞提供的反向拉力 Fpx 與之平衡的方程分別為：
 |
 |
式中，Sign 表示取符號函數，Abs 表示取絕對值函數，x2–x 表示微泡 2 和微泡 1 的中心距，其他參數同前。
如果細胞膜能夠提供足夠的反向拉力 Fpx 與 FB 平衡，則微泡 1 能錨合在細胞上。在通常情況下，細胞和配體、配體和受體、受體和微泡之間連接非常緊密，當 Fpx 不能與 FB 抗衡時，細胞膜就容易破裂形成聲孔，而微泡 1 就會脫離細胞成為浮游的微泡。浮游的微泡 1 受到附近振動微泡 2 的 FB 作用后，會在 X 軸向上產生朝向或背離微泡 2 的運動。在微泡 1 的浮游運動過程中，微泡 1 會受到環境液體的粘滯阻力 Fvis。另外，由于浮游的微泡 1 受浮力作用擠壓在細胞上，其運動過程中，微泡 1 還會受到細胞膜給予的動摩擦力 Ff。
 |
 |
式中，
為環境溶液的粘滯系數，
為細胞膜的摩擦因子，其他參數同前。
最后，列出微泡 1 的 Keller-Miksis 方程[12]。在多個微泡環境中，微泡 1 的運動包括平移運動和徑向振動。微泡 1 受到附近微泡 2 的平移振動影響及其徑向振動影響，分別如下：
 |
 |
 |
式中 c 為聲速，Pex 為液體中微泡表面壓強，P0 是微泡初始內部壓力，Pa 是微泡受到的超聲聲壓幅度，其他參數同前。這里假設微泡受到的超聲聲壓為一正弦信號。微泡表面壓強 Pex 的表達式由微泡內壓強、環境液體粘滯度、修正的微泡包膜表面張力[13]和微泡包膜粘滯度[14]等參數給出，如下式示：
 |
式中，R0 為微泡初始半徑，
為微泡內氣體的氣體多方指數，
為平衡狀態下微泡包膜的表面張力，
為微泡包膜表面張力的修正系數，
表示微泡包膜厚度，
表示微泡包膜的粘滯性系數，其他參數同前。
同樣對于微泡 2，考慮到附近僅存在振動的微泡，因此微泡 2 所受的 X 軸方向和 Y 軸方向的受力方程，以及微泡 2 的平移運動和徑向振動方程同描述微泡 1 的方程（1）～（9）類似。當微泡錨合在細胞上時，微泡不存在平移運動，僅存在徑向振動，錨合微泡給予細胞的作用力即為 Y 軸上的 Fbuoy 和 X 軸向上的 FB。我們通過聯立微泡 1 和微泡 2 的上述方程組，數值求解微泡 1 和微泡 2 的平移運動和徑向振動，從而數值求解微泡 1 給予細胞的作用力。
1.3 數值模擬方法
將微泡 1 和微泡 2 的式（1）～（9）聯立，在 1stOpt 軟件環境（北京七維高科有限公司）下進行數值模擬。以下為設置的模擬參數：假設環境液體為水，其物理參數為
kPa，
kg/m3，
N/m，μ = 0.001 Pa?s。超聲場在細胞邊界的物理參數為
MHz，Pa = 1 MPa，c = 1 480 m/s。微泡 1 和微泡 2 的初始物理參數為
μm，
μm，
，x2–x = 10 μm，
，
= 1 Pa?s，
，
N/m。細胞的物理參數為
= 0.9 Pa?s。為簡化計算，在模擬過程中，我們設定兩個微泡的參數是一致的。對于數值模擬，計算到微泡徑向振動穩定即結束。本文中細胞膜破裂的閾值采用文獻中紅細胞膜破裂的受力閾值約 12 nN[15]。
2 數值分析
鄰近穩態振動的微泡 2 對微泡 1 產生的 FB 始終隨超聲場變化。由于本文目的是分析微泡 1 對細胞作用發生聲致成孔的可能性，因此在本節的數值分析過程中，僅分析微泡 2 穩態振動時對相鄰微泡 1 產生的 FB 的瞬間最大值。
2.1 細胞所受微泡的壓力和動摩擦力
以 1.3 節中的初始條件進行數值模擬，可以得到細胞 Y 軸受力即微泡 1 的浮力為 2.0 × 10–4 nN。從式（1）可知，微泡 1 給予細胞的 Y 軸作用力即為微泡 1 的浮力 Fbuoy，主要受到微泡 1 瞬時半徑 R 的影響；然后從式（7）～（9）可知，微泡 1 瞬時半徑主要由微泡特性和超聲照射參數所確定。但即使超聲照射使得微泡 1 膨脹達到初始半徑的 10 倍而仍未破裂，由微泡 1 的浮力給予細胞 Y 軸的受力也僅為 0.3 nN，遠小于閾值 12 nN。
如果微泡 1 通過配體-受體連接被錨定在細胞膜上，微泡 1 將不會對細胞膜產生動摩擦力。如果微泡 1 脫離細胞成為浮游微泡，那么細胞膜會受到浮游的微泡 1 在平移過程中給予的動摩擦力，如式（5）所示，其數值比微泡浮力還要小。因此不論是微泡的初始狀態還是穩態振動，只要超聲場驅動微泡穩態振動，則細胞膜所受的在 Y 軸方向上的微泡 1 浮力和在 X 軸方向上的微泡 1 浮游時給予的動摩擦力都遠不足以造成細胞膜破裂。
2.2 細胞所受錨合微泡的次 Bjerknes 力
當相鄰兩個微泡錨合在細胞上時，錨合在細胞上的微泡 1 在 X 軸上僅受到附近振動微泡 2 的 FB。當細胞通過配體—受體連接給予微泡 1 的反向拉力 Fpx 可以抵抗 FB 力時，微泡 1 能夠被配體-受體連接穩定在細胞上來回移動。但是當細胞膜不能提供微泡 1 穩定在細胞上的力時，微泡 1 就會通過配體-受體連接將細胞膜撕破而脫離細胞，從而使細胞產生瞬間的聲孔。
分析次 Bjerknes 力，首先需要通過微分方程（7）～（9）求解在不同條件下微泡 1、2 的瞬時半徑及其時間導數，然后通過公式（3）～（4）即可求解 FB。從公式可知，影響 FB 大小即聲孔發生的因素主要是兩個相鄰微泡間距、微泡的瞬時半徑及其時間導數，而微泡的瞬間半徑及其時間導數則是由微泡初始條件和外加的超聲場等參數所決定。
2.2.1 微泡初始半徑和間距
初始條件如 1.3 節數值模擬方法所示，其中需要探討的是微泡的初始半徑和兩個微泡的間距這兩個參數。根據實際情況，微泡 1、2 初始半徑設定為 1～4 μm，它們之間的中心間距設定為 5～50 μm。通過模擬得到次 Bjerknes 力的數值范圍和變化趨勢如圖 2a 所示。從圖中可知，微泡 2 的初始半徑越小，鄰近的微泡 1 受到的 FB 就越小；兩個相鄰微泡 1、2 的中心距越大，微泡 1 受到的 FB 就越小。在 2.25 MHz、1 MPa 的超聲照射下，初始半徑為 1 μm 的兩個微泡即使其間距只有 5 μm，也不能產生超過 12 nN 的力使得細胞膜破裂。但是隨著初始半徑的增大或者兩個微泡間距離的減少，FB 劇烈地增加。從圖 2a 可見，即使微泡 1、2 之間有 50 μm 的距離，初始半徑為 3～4 μm 的微泡仍然可以產生足夠的次 Bjerknes 力使得細胞膜破裂，從而導致聲致成孔。
圖2
各參數對次 Bjerknes 力的影響
a. 改變兩個微泡的初始半徑和間距；b. 改變微泡包膜的粘滯度和厚度；c. 改變超聲照射的頻率和聲壓
Figure2. The secondary Bjerknes force in different conditionsa. changing microbubbles’ initial radius and gap; b. changing microbubble envelope’s viscosity and thickness; c. changing ultrasonic pressure and frequency
2.2.2 微泡初始條件
同 2.2.1 節類似，在其他初始條件都如 1.3 節數值模擬中的初始值時，我們分析了改變微泡包膜的粘滯度和厚度對 FB 的影響。從圖 2b 中可以看出，仍然在 2.25 MHz、1 MPa 的超聲照射下，微泡 2 包膜的粘滯度最大為 1 Pa·s，而且微泡包膜最厚為 0.6 μm 時，是不能對鄰近的微泡 1 產生超過 12 nN 的力使得細胞膜破裂的。但是隨著微泡 2 包膜的粘滯度減少或者隨著微泡厚度減少，FB 劇烈地增加。當微泡 2 包膜的粘滯度小于 1 Pa?s 且微泡包膜的厚度小于 0.4 μm 時，在兩個微泡間距為 10 μm 的情況下，就可以產生足夠的力使得細胞膜破裂，從而導致聲致成孔。
2.2.3 超聲照射參數
也同 2.2.1 節類似，在其他初始條件都如 1.3 節數值模擬中的初始值時，我們分析了改變超聲照射參數對 FB 的影響。我們選擇了可能的數種醫用超聲的參數條件，分析結果如圖 2c 所示。可以看到，隨著超聲照射的頻率和聲壓的增加，FB 均有所增加。當超聲照射的頻率超過 2.25 MHz 并且聲壓超過 1 MPa 時，FB 能夠超過 12 nN，可以產生足夠的力使得細胞膜破裂，從而產生聲孔。但是對比圖 2a、2b 和 2c，我們可以看到超聲照射參數對 FB 的影響比較小。
3 結果分析和討論
本文首次分析了在超聲場中兩個相鄰穩態振動的微泡及其受到次 Bjerknes 力時可能產生聲孔的情況。我們在本文中建立了兩個相鄰穩態振動微泡之間的力學方程，包括微泡的徑向和水平方向的受力方程；并對微泡對細胞的作用力進行了數值分析，包括由微泡所受浮力而給予細胞的 Y 軸向上的壓力作用、微泡通過配體—受體連接給予細胞 X 軸向上的次 Bjerknes 力，以及微泡脫離細胞浮游時，移動時給予細胞 X 軸向上的動摩擦力。通過數值分析，獲得錨合微泡受到附近振動微泡的次 Bjerknes 作用力，模擬并計算了在不同微泡的初始半徑、微泡間距、微泡包膜的粘滯性和厚度、照射超聲的幅度和頻率等條件下的次 Bjerknes 力的大小。
但是必須要注意的是，本文的分析仍然忽略了其他幾種情況：
（1）本文僅分析了附近另一微泡穩態振動時的次 Bjerknes 力的情況。但是在其他過程特別是微泡的瞬態空化效應過程中，微泡的坍塌和潰滅都會產生遠比穩態空化強烈的輻射聲壓，從而對較遠距離的微泡都能產生很大的次 Bjerknes 力作用，顯然更容易產生聲孔。但是這種情況很容易對細胞產生不可逆的損傷從而導致細胞死亡。
（2）在受到附近另一個微泡的次 Bjerknes 力時，微泡的振動特性、散射聲場和平均散射功率等都與單個微泡時有所不同[16]，即微泡動力學行為也將不同，導致其對附近的細胞的作用力和聲孔效果也需要在我們對單個微泡研究[17]的基礎上進行修正。
（3）本文在數值分析微泡穩態振動時對鄰近微泡的次 Bjerknes 力通過配體-受體結合作用到細胞上，從而造成細胞膜上聲致成孔時，僅用了紅細胞膜破裂的剪切受力閾值約 12 nN 這種情況進行分析。應該注意的是由于細胞結構特別是細胞骨架的不同，細胞膜破裂的剪切力閾值是不同的。
盡管忽略了上述情況，我們根據實際設置參數和數值分析，發現在微泡穩態振動時對附近微泡產生的次 Bjerknes 力從而產生聲孔的情況中，微泡的特性對次 Bjerknes 力的影響較大，而超聲照射參數對次 Bjerknes 力的影響較小。從圖 2 的結果中我們也可以直觀地看出，只要微泡的半徑稍微大一些，微泡包膜的粘滯性和厚度稍微小一些，就有可能對附近的微泡甚至于數十微米外相鄰的微泡，產生足夠的次 Bjerknes 力使得細胞膜破裂，從而產生聲孔。這是因為從式（3）中可得出，次 Bjerknes 力與微泡半徑振動的速度和加速度相關，而這正是由微泡的半徑、包膜粘滯性和厚度等主要特性所決定的。
本文對相鄰兩個穩態振動微泡之間的次 Bjerknes 力產生聲孔效果的可能性進行了分析。但是由于體外細胞的實驗難度，本文并沒有給出細胞實驗對比結果，因此建立相應的體外細胞實驗也是今后需要研究的重要問題之一。雖然本文僅提供了聲致成孔效應中的一種情況的理論模型和分析結果，遠不能夠指導聲致成孔對藥物/基因過膜轉運的臨床化應用，但是本文通過數值模擬分析發現如果制作半徑較大且包膜粘滯性和厚度較小的微泡，則更容易在微泡穩態振動時對附近微泡產生足夠使細胞膜破裂的次 Bjerknes 力，從而更容易產生聲孔。這為今后選擇更為合理的超聲微泡參數，從而提高藥物/基因轉運效果提供了理論基礎。
引言
超聲介導微泡的空化效應使細胞膜破裂產生可逆孔隙，被稱為聲致成孔（sonoporation）[1]。被細胞膜攔截的大分子藥物/基因可通過聲孔進入細胞，并且細胞可在藥物/基因進入后短時間內自行修復細胞膜上的聲孔[2]。由于聲致成孔提高了藥物/基因的過膜轉運效率，并且沒有其他轉運技術的各類缺陷，因此，目前對超聲介導微泡促進藥物/基因轉運的效果和機制展開了大量的研究[3-5]。
Lentacker 等[6]總結超聲介導微泡對細胞產生聲致成孔的機制中指出：在穩態空化時，微泡直接對細胞膜產生推拉作用，微泡在細胞膜邊穩態振動產生聲微流；在瞬態空化時，微泡劇烈膨脹后坍塌產生激波，微泡受附近細胞膜影響變形產生微射流。微泡產生的聲微流和微射流都可能會使細胞膜產生孔隙，從而促進細胞膜攔截的藥物或基因從細胞外通過孔隙直接進入細胞內。
然而以往對聲致成孔的機制研究集中于單一微泡的動力學及其對細胞邊界的作用力[7-8]。這種僅對聲致成孔中單個微泡的研究并不全面，因為這樣忽略了對實際細胞實驗中很可能存在的兩個相鄰微泡之間以及它們對細胞邊界作用力的研究。在超聲場中的微泡穩態振動或瞬態坍塌，會引起該微泡和相鄰另一微泡之間產生相互的吸引力和排斥力，該力被稱為次 Bjerknes 力，這種力在單個微泡的情況下是不存在的。也就是說，當附近有另一微泡時，微泡會受另一微泡的次 Bjerknes 力的作用[9-11]。此外，微泡還會受到超聲場梯度產生的能夠使單個微泡向波節或波腹不斷靠近或遠離的主 Bjerknes 力，在本文中不做考慮。
因此，本文首次分析了兩個相鄰穩態振動的微泡可能產生聲致成孔的作用效果。本文采用建立數學模型和數值模擬的方法，分析了在穩態空化時微泡受到的相鄰微泡的次 Bjerknes 力，并討論了不同參數條件下微泡受到的次 Bjerknes 力對細胞產生聲孔的可能性。
1 數學模型及其方法
1.1 模型及其簡化假設
微泡與細胞的相互位置關系如圖 1a 所示，貼壁細胞面朝下，在連續的細胞膜界面上，存在相鄰兩個微泡。在 Y 軸方向上，由于微泡受到的浮力 Fbuoy 和細胞給予的壓力 Fpy 始終保持平衡，因此錨合在細胞上的兩個微泡被固定在貼壁細胞的附近。在 X 軸方向上，當微泡 1 附近有另一個振動微泡 2 時，微泡 1 受到微泡 2 振動產生的次 Bjerknes 力（FB）。在受到 FB 作用的過程中，錨合到細胞上的微泡 1 受到細胞通過配體—受體給予其的反向拉力 Fpx。如果微泡 1 因為受到微泡 2 的 FB 作用過大從而脫離細胞，那么浮游的微泡 1 將受到環境液體給予的粘滯阻力 Fvis，和貼于細胞膜時細胞膜給予的動摩擦力 Ff。兩個微泡的受力如圖 1b 所示。
圖1
貼壁細胞和微泡的相互位置簡化圖
a. 由于浮力和細胞通過配體-受體給予的壓力之間的平衡，兩個微泡被固定在貼壁細胞的附近；b. 微泡受到的作用力的分解示意圖
Figure1. The simplified graph of the mutual location between an adherent cell and microbubblesa. because of the balance between buoyancy and the pressure administered by cell through receptor-ligand interaction, two adjacent microbubbles are fixed on the cell membrane; b. the decomposition diagram of forces received by a microbubble
為了建立合理的數學模型，我們還對細胞、微泡和超聲場做了以下假設：① 微泡 1 附近有且僅有另一個微泡 2；② 微泡在細胞邊界的穩態振動始終保持球形；③ 由于細胞邊界一般高度不超過數個微米，因此假設微泡 1 和微泡 2 在一水平面上，即微泡之間的次 Bjerknes 力僅在 X 軸上，微泡如果脫離細胞產生運動，它受到的環境液體粘滯阻力、細胞反向拉力、細胞膜動摩擦力等也僅在 X 軸上；④ 細胞在高頻低壓超聲作用下類似一個粘性耗散系統，即細胞在高頻低壓超聲作用下的振動可忽略，反射超聲波可忽略，因此細胞邊界不會給予微泡次 Bjerknes 力；⑤ 由于細胞直徑、微泡直徑和相鄰微泡距離都僅為微米級，因此假設超聲場在很小范圍內是均勻的，即微泡受到的聲輻射力為零，且細胞邊界的超聲場僅隨發射聲場變化而變化。
1.2 微泡動力學模型的建立
定義
、
和
是微泡的瞬時半徑及其一次時間導數和二次時間導數。定義 x、
和
是微泡 1 的瞬時 X 軸位置及其一次時間導數和二次時間導數。凡是下標 2 均為表示微泡 2 的參數。
首先考慮在 Y 軸方向上微泡 1 受到的作用力。微泡 1 的凈浮力 Fbuoy（微泡包膜內氣體產生的浮力減掉微泡包膜所受的重力）及其與細胞給微泡 1 的壓力 Fpy 之間的平衡方程分別為：
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式中，R 為微泡的瞬時半徑，
為微泡包膜的厚度，ρ 和 ρsh 分別為微泡環境液體的密度和微泡包膜的密度。
然后考慮在 X 軸方向上微泡 1 受到的作用力。如 1.1 節中所述，需要區分微泡 1 被配體—受體錨合在細胞上和微泡 1 脫離細胞后浮游這兩種情況分析其受力。對于錨合的微泡 1，當其受到附近振動微泡 2 的 FB 后，細胞通過配體—受體對其產生與之對抗的拉力 Fpx、錨合的微泡 1 受到的 FB，以及細胞提供的反向拉力 Fpx 與之平衡的方程分別為：
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式中，Sign 表示取符號函數，Abs 表示取絕對值函數，x2–x 表示微泡 2 和微泡 1 的中心距，其他參數同前。
如果細胞膜能夠提供足夠的反向拉力 Fpx 與 FB 平衡，則微泡 1 能錨合在細胞上。在通常情況下，細胞和配體、配體和受體、受體和微泡之間連接非常緊密，當 Fpx 不能與 FB 抗衡時，細胞膜就容易破裂形成聲孔，而微泡 1 就會脫離細胞成為浮游的微泡。浮游的微泡 1 受到附近振動微泡 2 的 FB 作用后，會在 X 軸向上產生朝向或背離微泡 2 的運動。在微泡 1 的浮游運動過程中，微泡 1 會受到環境液體的粘滯阻力 Fvis。另外，由于浮游的微泡 1 受浮力作用擠壓在細胞上，其運動過程中，微泡 1 還會受到細胞膜給予的動摩擦力 Ff。
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式中，
為環境溶液的粘滯系數，
為細胞膜的摩擦因子，其他參數同前。
最后，列出微泡 1 的 Keller-Miksis 方程[12]。在多個微泡環境中，微泡 1 的運動包括平移運動和徑向振動。微泡 1 受到附近微泡 2 的平移振動影響及其徑向振動影響，分別如下：
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式中 c 為聲速，Pex 為液體中微泡表面壓強，P0 是微泡初始內部壓力，Pa 是微泡受到的超聲聲壓幅度，其他參數同前。這里假設微泡受到的超聲聲壓為一正弦信號。微泡表面壓強 Pex 的表達式由微泡內壓強、環境液體粘滯度、修正的微泡包膜表面張力[13]和微泡包膜粘滯度[14]等參數給出，如下式示：
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式中，R0 為微泡初始半徑，
為微泡內氣體的氣體多方指數，
為平衡狀態下微泡包膜的表面張力，
為微泡包膜表面張力的修正系數，
表示微泡包膜厚度，
表示微泡包膜的粘滯性系數，其他參數同前。
同樣對于微泡 2，考慮到附近僅存在振動的微泡，因此微泡 2 所受的 X 軸方向和 Y 軸方向的受力方程，以及微泡 2 的平移運動和徑向振動方程同描述微泡 1 的方程（1）～（9）類似。當微泡錨合在細胞上時，微泡不存在平移運動，僅存在徑向振動，錨合微泡給予細胞的作用力即為 Y 軸上的 Fbuoy 和 X 軸向上的 FB。我們通過聯立微泡 1 和微泡 2 的上述方程組，數值求解微泡 1 和微泡 2 的平移運動和徑向振動，從而數值求解微泡 1 給予細胞的作用力。
1.3 數值模擬方法
將微泡 1 和微泡 2 的式（1）～（9）聯立，在 1stOpt 軟件環境（北京七維高科有限公司）下進行數值模擬。以下為設置的模擬參數：假設環境液體為水，其物理參數為
kPa，
kg/m3，
N/m，μ = 0.001 Pa?s。超聲場在細胞邊界的物理參數為
MHz，Pa = 1 MPa，c = 1 480 m/s。微泡 1 和微泡 2 的初始物理參數為
μm，
μm，
，x2–x = 10 μm，
，
= 1 Pa?s，
，
N/m。細胞的物理參數為
= 0.9 Pa?s。為簡化計算，在模擬過程中，我們設定兩個微泡的參數是一致的。對于數值模擬，計算到微泡徑向振動穩定即結束。本文中細胞膜破裂的閾值采用文獻中紅細胞膜破裂的受力閾值約 12 nN[15]。
2 數值分析
鄰近穩態振動的微泡 2 對微泡 1 產生的 FB 始終隨超聲場變化。由于本文目的是分析微泡 1 對細胞作用發生聲致成孔的可能性，因此在本節的數值分析過程中，僅分析微泡 2 穩態振動時對相鄰微泡 1 產生的 FB 的瞬間最大值。
2.1 細胞所受微泡的壓力和動摩擦力
以 1.3 節中的初始條件進行數值模擬，可以得到細胞 Y 軸受力即微泡 1 的浮力為 2.0 × 10–4 nN。從式（1）可知，微泡 1 給予細胞的 Y 軸作用力即為微泡 1 的浮力 Fbuoy，主要受到微泡 1 瞬時半徑 R 的影響；然后從式（7）～（9）可知，微泡 1 瞬時半徑主要由微泡特性和超聲照射參數所確定。但即使超聲照射使得微泡 1 膨脹達到初始半徑的 10 倍而仍未破裂，由微泡 1 的浮力給予細胞 Y 軸的受力也僅為 0.3 nN，遠小于閾值 12 nN。
如果微泡 1 通過配體-受體連接被錨定在細胞膜上，微泡 1 將不會對細胞膜產生動摩擦力。如果微泡 1 脫離細胞成為浮游微泡，那么細胞膜會受到浮游的微泡 1 在平移過程中給予的動摩擦力，如式（5）所示，其數值比微泡浮力還要小。因此不論是微泡的初始狀態還是穩態振動，只要超聲場驅動微泡穩態振動，則細胞膜所受的在 Y 軸方向上的微泡 1 浮力和在 X 軸方向上的微泡 1 浮游時給予的動摩擦力都遠不足以造成細胞膜破裂。
2.2 細胞所受錨合微泡的次 Bjerknes 力
當相鄰兩個微泡錨合在細胞上時，錨合在細胞上的微泡 1 在 X 軸上僅受到附近振動微泡 2 的 FB。當細胞通過配體—受體連接給予微泡 1 的反向拉力 Fpx 可以抵抗 FB 力時，微泡 1 能夠被配體-受體連接穩定在細胞上來回移動。但是當細胞膜不能提供微泡 1 穩定在細胞上的力時，微泡 1 就會通過配體-受體連接將細胞膜撕破而脫離細胞，從而使細胞產生瞬間的聲孔。
分析次 Bjerknes 力，首先需要通過微分方程（7）～（9）求解在不同條件下微泡 1、2 的瞬時半徑及其時間導數，然后通過公式（3）～（4）即可求解 FB。從公式可知，影響 FB 大小即聲孔發生的因素主要是兩個相鄰微泡間距、微泡的瞬時半徑及其時間導數，而微泡的瞬間半徑及其時間導數則是由微泡初始條件和外加的超聲場等參數所決定。
2.2.1 微泡初始半徑和間距
初始條件如 1.3 節數值模擬方法所示，其中需要探討的是微泡的初始半徑和兩個微泡的間距這兩個參數。根據實際情況，微泡 1、2 初始半徑設定為 1～4 μm，它們之間的中心間距設定為 5～50 μm。通過模擬得到次 Bjerknes 力的數值范圍和變化趨勢如圖 2a 所示。從圖中可知，微泡 2 的初始半徑越小，鄰近的微泡 1 受到的 FB 就越小；兩個相鄰微泡 1、2 的中心距越大，微泡 1 受到的 FB 就越小。在 2.25 MHz、1 MPa 的超聲照射下，初始半徑為 1 μm 的兩個微泡即使其間距只有 5 μm，也不能產生超過 12 nN 的力使得細胞膜破裂。但是隨著初始半徑的增大或者兩個微泡間距離的減少，FB 劇烈地增加。從圖 2a 可見，即使微泡 1、2 之間有 50 μm 的距離，初始半徑為 3～4 μm 的微泡仍然可以產生足夠的次 Bjerknes 力使得細胞膜破裂，從而導致聲致成孔。
圖2
各參數對次 Bjerknes 力的影響
a. 改變兩個微泡的初始半徑和間距；b. 改變微泡包膜的粘滯度和厚度；c. 改變超聲照射的頻率和聲壓
Figure2. The secondary Bjerknes force in different conditionsa. changing microbubbles’ initial radius and gap; b. changing microbubble envelope’s viscosity and thickness; c. changing ultrasonic pressure and frequency
2.2.2 微泡初始條件
同 2.2.1 節類似，在其他初始條件都如 1.3 節數值模擬中的初始值時，我們分析了改變微泡包膜的粘滯度和厚度對 FB 的影響。從圖 2b 中可以看出，仍然在 2.25 MHz、1 MPa 的超聲照射下，微泡 2 包膜的粘滯度最大為 1 Pa·s，而且微泡包膜最厚為 0.6 μm 時，是不能對鄰近的微泡 1 產生超過 12 nN 的力使得細胞膜破裂的。但是隨著微泡 2 包膜的粘滯度減少或者隨著微泡厚度減少，FB 劇烈地增加。當微泡 2 包膜的粘滯度小于 1 Pa?s 且微泡包膜的厚度小于 0.4 μm 時，在兩個微泡間距為 10 μm 的情況下，就可以產生足夠的力使得細胞膜破裂，從而導致聲致成孔。
2.2.3 超聲照射參數
也同 2.2.1 節類似，在其他初始條件都如 1.3 節數值模擬中的初始值時，我們分析了改變超聲照射參數對 FB 的影響。我們選擇了可能的數種醫用超聲的參數條件，分析結果如圖 2c 所示。可以看到，隨著超聲照射的頻率和聲壓的增加，FB 均有所增加。當超聲照射的頻率超過 2.25 MHz 并且聲壓超過 1 MPa 時，FB 能夠超過 12 nN，可以產生足夠的力使得細胞膜破裂，從而產生聲孔。但是對比圖 2a、2b 和 2c，我們可以看到超聲照射參數對 FB 的影響比較小。
3 結果分析和討論
本文首次分析了在超聲場中兩個相鄰穩態振動的微泡及其受到次 Bjerknes 力時可能產生聲孔的情況。我們在本文中建立了兩個相鄰穩態振動微泡之間的力學方程，包括微泡的徑向和水平方向的受力方程；并對微泡對細胞的作用力進行了數值分析，包括由微泡所受浮力而給予細胞的 Y 軸向上的壓力作用、微泡通過配體—受體連接給予細胞 X 軸向上的次 Bjerknes 力，以及微泡脫離細胞浮游時，移動時給予細胞 X 軸向上的動摩擦力。通過數值分析，獲得錨合微泡受到附近振動微泡的次 Bjerknes 作用力，模擬并計算了在不同微泡的初始半徑、微泡間距、微泡包膜的粘滯性和厚度、照射超聲的幅度和頻率等條件下的次 Bjerknes 力的大小。
但是必須要注意的是，本文的分析仍然忽略了其他幾種情況：
（1）本文僅分析了附近另一微泡穩態振動時的次 Bjerknes 力的情況。但是在其他過程特別是微泡的瞬態空化效應過程中，微泡的坍塌和潰滅都會產生遠比穩態空化強烈的輻射聲壓，從而對較遠距離的微泡都能產生很大的次 Bjerknes 力作用，顯然更容易產生聲孔。但是這種情況很容易對細胞產生不可逆的損傷從而導致細胞死亡。
（2）在受到附近另一個微泡的次 Bjerknes 力時，微泡的振動特性、散射聲場和平均散射功率等都與單個微泡時有所不同[16]，即微泡動力學行為也將不同，導致其對附近的細胞的作用力和聲孔效果也需要在我們對單個微泡研究[17]的基礎上進行修正。
（3）本文在數值分析微泡穩態振動時對鄰近微泡的次 Bjerknes 力通過配體-受體結合作用到細胞上，從而造成細胞膜上聲致成孔時，僅用了紅細胞膜破裂的剪切受力閾值約 12 nN 這種情況進行分析。應該注意的是由于細胞結構特別是細胞骨架的不同，細胞膜破裂的剪切力閾值是不同的。
盡管忽略了上述情況，我們根據實際設置參數和數值分析，發現在微泡穩態振動時對附近微泡產生的次 Bjerknes 力從而產生聲孔的情況中，微泡的特性對次 Bjerknes 力的影響較大，而超聲照射參數對次 Bjerknes 力的影響較小。從圖 2 的結果中我們也可以直觀地看出，只要微泡的半徑稍微大一些，微泡包膜的粘滯性和厚度稍微小一些，就有可能對附近的微泡甚至于數十微米外相鄰的微泡，產生足夠的次 Bjerknes 力使得細胞膜破裂，從而產生聲孔。這是因為從式（3）中可得出，次 Bjerknes 力與微泡半徑振動的速度和加速度相關，而這正是由微泡的半徑、包膜粘滯性和厚度等主要特性所決定的。
本文對相鄰兩個穩態振動微泡之間的次 Bjerknes 力產生聲孔效果的可能性進行了分析。但是由于體外細胞的實驗難度，本文并沒有給出細胞實驗對比結果，因此建立相應的體外細胞實驗也是今后需要研究的重要問題之一。雖然本文僅提供了聲致成孔效應中的一種情況的理論模型和分析結果，遠不能夠指導聲致成孔對藥物/基因過膜轉運的臨床化應用，但是本文通過數值模擬分析發現如果制作半徑較大且包膜粘滯性和厚度較小的微泡，則更容易在微泡穩態振動時對附近微泡產生足夠使細胞膜破裂的次 Bjerknes 力，從而更容易產生聲孔。這為今后選擇更為合理的超聲微泡參數，從而提高藥物/基因轉運效果提供了理論基礎。
