脊髓內功能電激勵提供了一種恢復脊髓損傷患者運動功能的途徑。本研究的目標是在大鼠脊髓上確定誘發后肢不同動作的區域，對支配相應動作的區域進行歸一化描述，并驗證脊髓內功能電激勵能夠用于后肢運動功能恢復。實驗中利用了三維掃描式功能電激勵技術對大鼠脊髓腰骶段進行刺激。結果表明，對腰骶段脊髓腹側進行電刺激能夠產生單關節或多關節的協調運動，合理選擇刺激位點能夠誘發后肢多種不同動作，且后肢運動向量圖覆蓋后肢運動的矢狀平面的各個方向。本文繪制了大鼠脊髓運動功能圖譜，對相關動作的控制區域進行歸一化描述，為后續實驗中電極植入位點的確定提供指導。
引用本文： 沈曉燕, 王志功, 馬磊, 呂曉迎, 杜薇, 陳軼, 陶春伶. 基于脊髓內功能電激勵的大鼠后肢運動選擇性控制. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(6): 860-863. doi: 10.7507/1001-5515.201703030 復制
引言
脊髓損傷嚴重影響了患者的健康與生活質量，是迫切需要解決的醫學難題。隨著電子科學與神經科學不斷交叉融合，利用功能性電刺激恢復損傷脊髓功能成為當今康復醫學研究的熱點[1]。對此，很多學者做出了不同的嘗試。Holinski 等[2]利用椎管內微刺激技術實現麻醉狀態下貓的地面行走。Li 等[3]將采集到的腦初級運動皮層信號通過自制脊髓橋接系統刺激大鼠脊髓，實現了脊髓損傷大鼠伸腿運動。Gerasimenko 等[4-5]對去大腦和脊髓橫斷的貓進行硬膜外電刺激，成功誘發了后肢的步進運動。Musienko 等[6]結合硬膜外電刺激與藥理學刺激極大地改善了橫斷脊髓大鼠的運動功能。
目前，脊髓內功能電激勵開始受到關注，它存在以下幾個方面的優勢。首先，電極植入到離運動肌肉相對較遠的脊髓中，降低了電極移位的可能性。其次，脊髓腰骶部結構緊湊，支配后肢的運動神經元群集中在相對較小的區域，避免了脊髓大面積手術，有望成為脊髓損傷患者運動功能恢復的有效途徑。更為重要的是，功能電刺激脊髓腰骶段相應的運動神經元群能選擇性激活對應肌肉或肌肉群[7-8]。因此，本研究以 SD 大鼠為模型，尋找脊髓上誘發后肢產生各種動作的區域，并繪制與大鼠后肢運動相關的脊髓運動功能圖。同時，對支配相應動作的區域進行歸一化處理以提高脊髓運動功能圖的普遍適用性。
1 材料與方法
1.1 動物手術及電極植入
成年雄性 SD 大鼠 3 只，對其進行標記，分別為大鼠 1、大鼠 2、大鼠 3，體重 250 g 左右，由南通大學實驗動物中心提供。腹腔注射水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，對其右后肢及背部進行剃毛，去除脊髓 L4-S3 節段棘突及全椎板至椎弓根部，暴露脊髓。用游標卡尺測量脊髓各個節段的橫徑 D 及暴露脊髓的長度 L 以便歸一化處理[9]。在大鼠右后肢六塊肌肉（腓腸肌外側、脛骨前肌、股外側肌、半膜肌、股二頭肌、髂腰肌）中植入雙極電極。大鼠置于加熱墊上，體溫維持在 37℃ 左右。
1.2 刺激電極及刺激參數
刺激電極為美國 MicroProbes 公司生產的鎢絲單電極（WE30030.5A3）。刺激信號為串脈沖序列，由 Master 9 產生。由 40 個負脈沖組成，脈寬 200 μs，頻率 33 Hz，每隔 4 s 重復一次，實驗中使用電流刺激。
1.3 實驗方法
控制大鼠后肢運動的脊髓節段位于腰骶部，對脊髓腰骶部的某一橫截面進行電刺激，刺激位點如圖 1 所示，參考電極植入鄰近的脊旁肌。以脊髓的后正中溝為坐標原點，橫徑方向為 X 軸，背腹方向為 Y 軸，脊髓頭尾方向為 Z 軸（坐標 Z 為刺激位點所在橫截面與脊髓 L4 節段頭側所在橫截面的距離）。刺激位點在 X 軸上的間距為 200 μm，為了避開血管，第一列點的 X 值為 300 μm，Y 軸方向刺激位點的間距為 300 μm，刺激范圍為脊髓灰質及其鄰近位置。暴露脊髓頭尾方向即 Z 軸以 500 μm 的間隔執行類似操作，確定誘發不同種類動作的區域。調節刺激電流的大小，確定能誘發動作的閾值電流，與此同時觀察并記錄電流變化時誘發動作的差異，記錄運動時相關肌群的肌電信號。肌電信號由 PowerLab 數據采集分析系統（ML870，美國 ADI 公司）采集而得，采樣率 2 kHz，差分放大，帶通濾波 20～1 000 Hz。
圖1
脊髓運動功能定位示意圖
Figure1.
The schematic of stimulation sites in a spinal cord
2 實驗結果
2.1 脊髓運動功能圖譜
實驗首先對誘發 1 號大鼠后肢運動的脊髓位點進行了記錄，繪制出其腰骶段脊髓右半側的運動功能圖譜，如圖 2 所示。圖 2 左側的豎線對應脊髓后正中溝，其右側部分對應脊髓右半側，虛線近似地標注了脊髓 L4、L5、L6、S1、S2 節段尾側邊緣。其中一種顏色圈出的區域為一類動作，并用字母與之對應。脊髓腰骶段能誘發后肢多種動作，不僅包括屈髖伸膝、伸膝屈踝、伸髖伸踝等正常步態中關節或肌肉的活動，還包含關節旋轉、收展等運動。刺激位點旁括號內的數據為閾值電流最小刺激點的深度值。綜合刺激位點的坐標值可以發現，能用于后肢運動功能恢復的刺激位點主要位于脊髓腹側。觀察圖譜頭尾方向可以發現，脊髓腰骶段前部分主要誘發屈髖、伸膝、屈踝等動作，而后部分誘發伸髖、屈膝、伸踝等動作。由于實驗中只發現個別位點能誘發屈膝的動作，所以并未在圖譜上體現。
圖2
脊髓腰骶段運動功能圖譜
Figure2.
Motor function map of the lumbosacral enlargement
2.2 刺激位點的歸一化描述
由于大鼠個體的差異性，對本實驗的結果采用歸一化的處理方式，使本次實驗結果能更加科學有效地用于不同的實驗個體中。對刺激位點的坐標（X，Y，Z）做如下處理：坐標 X、Y 采用相對于脊髓橫徑 D 的歸一化方法，X 以 D/2 進行歸一化處理，Y 以 D 進行歸一化處理。對 Y 采用相對于脊髓橫徑的方法歸一化是為了避免測量背腹徑而造成脊髓更大的損傷。由于暴露的脊髓長度較長，脊髓橫徑在頭尾方向的差異不可忽略，所以歸一化時采用對應脊髓節段的橫徑。對 Z 采用相對于暴露脊髓總長度 L 的方法進行歸一化。由于 L4～S3 脊髓節段誘發的動作比較多，現對步進運動中起重要作用的幾個動作的數據進行處理。后續實驗將以少量的電極完成運動功能的恢復，所以必須首先確定誘發某一動作的合適的刺激范圍。采用與 1 號大鼠同樣的實驗方式在 2 號及 3 號大鼠上進行實驗，將三只大鼠的實驗數據進行歸一化處理，分析得到如表 1 所示的動作范圍。后續實驗將參照上述范圍進行定位，在選擇合適位點后需要給予電刺激確定是否誘發相應動作，否則需要再進行調整，直到電極植入的位點能夠誘發相應的用于運動功能恢復的動作。
表1
動作的歸一化范圍
Table1.
Normalized ranges of several behaviors
2.3 后肢運動的描述
為了驗證功能電激勵能用于后肢運動功能的恢復，圖 3 繪制了 3 號大鼠麻醉狀態時脊髓內功能電激勵誘發的后肢運動向量圖，從極坐標中心點向外輻射的向量代表了電刺激時跖趾關節從自然下垂狀態到極限位置的位移。圖 3 主要繪制了后肢在髖關節所在的矢狀平面中的運動向量，并未繪制出后肢外展、內收等動作。由圖中可以看出脊髓內功能電激勵能誘發后肢產生向上、向下、向前、向后的動作，能滿足運動功能恢復過程中基本動作的需求。
圖3
后肢運動向量圖
Figure3.
Hindlimb movement vectors
3 分析與討論
綜合 3 只大鼠的實驗情況，圖 4 描繪了脊髓橫截面上刺激位點在給予電刺激時的規律。虛線以上三角形標注的位置能產生協調的單關節或多關節的控制后肢伸或屈的運動，虛線以下黑色實心點標注的區域只能誘發屈的動作，或沒有產生動作，并未發現能產生負重運動即伸運動的刺激位點。此外，實驗中發現個別刺激位點能產生雙側運動，刺激位點能誘發同側的后肢產生協調的動作以及異側踝關節、腳趾運動。如 2.1 節所述，腰骶段脊髓頭尾方向也存在一定規律，暴露的脊髓前部主要誘發屈髖、伸膝、屈踝等動作，而后部主要誘發伸髖、屈膝、伸踝等動作。以上幾個動作在步進過程中起主導作用，腰骶部脊髓還能誘發其他動作，如內收髖關節、關節旋轉等。同一位點刺激電流的大小對誘發的動作有明顯影響，當刺激電流從閾值開始以一定的斜率增加時，運動時募集到的肌纖維數量會增加，動作的幅度與力度會增強。當電流增加到一個等級后動作也會發生變化，因為電流增大時其傳播范圍也會增大。
圖4
運動功能恢復的刺激位點圖
Figure4.
Stimulation sites for restoration of movement function
4 結論
本文對刺激大鼠腰骶段脊髓產生的一系列動作的區域進行了描述，繪制了大鼠腰骶段脊髓運動功能圖譜，并得出以下結論：在脊髓兩側合適位點植入盡量少的電極，對兩側的電極以一定的時相進行交叉控制，能夠產生簡單的步進運動。電刺激過程中組織的疲勞是很重要的問題，有實驗表明，大鼠脊髓內功能電激勵能優先募集耐疲勞的肌纖維并產生較平緩的肌力[10]。在合適的刺激電流下微絲電極只會激活其周圍少量的運動神經元及中間神經元。后續實驗可以參照此次研究成果以少量的電極完成后肢運動功能的恢復。在以后的實驗中可以結合其他方式促進后肢運動功能的恢復，如跑臺訓練和藥理學刺激。本文提供的急性動物實驗數據將為后續的慢性實驗提供對比和參考。
引言
脊髓損傷嚴重影響了患者的健康與生活質量，是迫切需要解決的醫學難題。隨著電子科學與神經科學不斷交叉融合，利用功能性電刺激恢復損傷脊髓功能成為當今康復醫學研究的熱點[1]。對此，很多學者做出了不同的嘗試。Holinski 等[2]利用椎管內微刺激技術實現麻醉狀態下貓的地面行走。Li 等[3]將采集到的腦初級運動皮層信號通過自制脊髓橋接系統刺激大鼠脊髓，實現了脊髓損傷大鼠伸腿運動。Gerasimenko 等[4-5]對去大腦和脊髓橫斷的貓進行硬膜外電刺激，成功誘發了后肢的步進運動。Musienko 等[6]結合硬膜外電刺激與藥理學刺激極大地改善了橫斷脊髓大鼠的運動功能。
目前，脊髓內功能電激勵開始受到關注，它存在以下幾個方面的優勢。首先，電極植入到離運動肌肉相對較遠的脊髓中，降低了電極移位的可能性。其次，脊髓腰骶部結構緊湊，支配后肢的運動神經元群集中在相對較小的區域，避免了脊髓大面積手術，有望成為脊髓損傷患者運動功能恢復的有效途徑。更為重要的是，功能電刺激脊髓腰骶段相應的運動神經元群能選擇性激活對應肌肉或肌肉群[7-8]。因此，本研究以 SD 大鼠為模型，尋找脊髓上誘發后肢產生各種動作的區域，并繪制與大鼠后肢運動相關的脊髓運動功能圖。同時，對支配相應動作的區域進行歸一化處理以提高脊髓運動功能圖的普遍適用性。
1 材料與方法
1.1 動物手術及電極植入
成年雄性 SD 大鼠 3 只，對其進行標記，分別為大鼠 1、大鼠 2、大鼠 3，體重 250 g 左右，由南通大學實驗動物中心提供。腹腔注射水合氯醛（4 mL/kg）麻醉后，對其右后肢及背部進行剃毛，去除脊髓 L4-S3 節段棘突及全椎板至椎弓根部，暴露脊髓。用游標卡尺測量脊髓各個節段的橫徑 D 及暴露脊髓的長度 L 以便歸一化處理[9]。在大鼠右后肢六塊肌肉（腓腸肌外側、脛骨前肌、股外側肌、半膜肌、股二頭肌、髂腰肌）中植入雙極電極。大鼠置于加熱墊上，體溫維持在 37℃ 左右。
1.2 刺激電極及刺激參數
刺激電極為美國 MicroProbes 公司生產的鎢絲單電極（WE30030.5A3）。刺激信號為串脈沖序列，由 Master 9 產生。由 40 個負脈沖組成，脈寬 200 μs，頻率 33 Hz，每隔 4 s 重復一次，實驗中使用電流刺激。
1.3 實驗方法
控制大鼠后肢運動的脊髓節段位于腰骶部，對脊髓腰骶部的某一橫截面進行電刺激，刺激位點如圖 1 所示，參考電極植入鄰近的脊旁肌。以脊髓的后正中溝為坐標原點，橫徑方向為 X 軸，背腹方向為 Y 軸，脊髓頭尾方向為 Z 軸（坐標 Z 為刺激位點所在橫截面與脊髓 L4 節段頭側所在橫截面的距離）。刺激位點在 X 軸上的間距為 200 μm，為了避開血管，第一列點的 X 值為 300 μm，Y 軸方向刺激位點的間距為 300 μm，刺激范圍為脊髓灰質及其鄰近位置。暴露脊髓頭尾方向即 Z 軸以 500 μm 的間隔執行類似操作，確定誘發不同種類動作的區域。調節刺激電流的大小，確定能誘發動作的閾值電流，與此同時觀察并記錄電流變化時誘發動作的差異，記錄運動時相關肌群的肌電信號。肌電信號由 PowerLab 數據采集分析系統（ML870，美國 ADI 公司）采集而得，采樣率 2 kHz，差分放大，帶通濾波 20～1 000 Hz。
圖1
脊髓運動功能定位示意圖
Figure1.
The schematic of stimulation sites in a spinal cord
2 實驗結果
2.1 脊髓運動功能圖譜
實驗首先對誘發 1 號大鼠后肢運動的脊髓位點進行了記錄，繪制出其腰骶段脊髓右半側的運動功能圖譜，如圖 2 所示。圖 2 左側的豎線對應脊髓后正中溝，其右側部分對應脊髓右半側，虛線近似地標注了脊髓 L4、L5、L6、S1、S2 節段尾側邊緣。其中一種顏色圈出的區域為一類動作，并用字母與之對應。脊髓腰骶段能誘發后肢多種動作，不僅包括屈髖伸膝、伸膝屈踝、伸髖伸踝等正常步態中關節或肌肉的活動，還包含關節旋轉、收展等運動。刺激位點旁括號內的數據為閾值電流最小刺激點的深度值。綜合刺激位點的坐標值可以發現，能用于后肢運動功能恢復的刺激位點主要位于脊髓腹側。觀察圖譜頭尾方向可以發現，脊髓腰骶段前部分主要誘發屈髖、伸膝、屈踝等動作，而后部分誘發伸髖、屈膝、伸踝等動作。由于實驗中只發現個別位點能誘發屈膝的動作，所以并未在圖譜上體現。
圖2
脊髓腰骶段運動功能圖譜
Figure2.
Motor function map of the lumbosacral enlargement
2.2 刺激位點的歸一化描述
由于大鼠個體的差異性，對本實驗的結果采用歸一化的處理方式，使本次實驗結果能更加科學有效地用于不同的實驗個體中。對刺激位點的坐標（X，Y，Z）做如下處理：坐標 X、Y 采用相對于脊髓橫徑 D 的歸一化方法，X 以 D/2 進行歸一化處理，Y 以 D 進行歸一化處理。對 Y 采用相對于脊髓橫徑的方法歸一化是為了避免測量背腹徑而造成脊髓更大的損傷。由于暴露的脊髓長度較長，脊髓橫徑在頭尾方向的差異不可忽略，所以歸一化時采用對應脊髓節段的橫徑。對 Z 采用相對于暴露脊髓總長度 L 的方法進行歸一化。由于 L4～S3 脊髓節段誘發的動作比較多，現對步進運動中起重要作用的幾個動作的數據進行處理。后續實驗將以少量的電極完成運動功能的恢復，所以必須首先確定誘發某一動作的合適的刺激范圍。采用與 1 號大鼠同樣的實驗方式在 2 號及 3 號大鼠上進行實驗，將三只大鼠的實驗數據進行歸一化處理，分析得到如表 1 所示的動作范圍。后續實驗將參照上述范圍進行定位，在選擇合適位點后需要給予電刺激確定是否誘發相應動作，否則需要再進行調整，直到電極植入的位點能夠誘發相應的用于運動功能恢復的動作。
表1
動作的歸一化范圍
Table1.
Normalized ranges of several behaviors
2.3 后肢運動的描述
為了驗證功能電激勵能用于后肢運動功能的恢復，圖 3 繪制了 3 號大鼠麻醉狀態時脊髓內功能電激勵誘發的后肢運動向量圖，從極坐標中心點向外輻射的向量代表了電刺激時跖趾關節從自然下垂狀態到極限位置的位移。圖 3 主要繪制了后肢在髖關節所在的矢狀平面中的運動向量，并未繪制出后肢外展、內收等動作。由圖中可以看出脊髓內功能電激勵能誘發后肢產生向上、向下、向前、向后的動作，能滿足運動功能恢復過程中基本動作的需求。
圖3
后肢運動向量圖
Figure3.
Hindlimb movement vectors
3 分析與討論
綜合 3 只大鼠的實驗情況，圖 4 描繪了脊髓橫截面上刺激位點在給予電刺激時的規律。虛線以上三角形標注的位置能產生協調的單關節或多關節的控制后肢伸或屈的運動，虛線以下黑色實心點標注的區域只能誘發屈的動作，或沒有產生動作，并未發現能產生負重運動即伸運動的刺激位點。此外，實驗中發現個別刺激位點能產生雙側運動，刺激位點能誘發同側的后肢產生協調的動作以及異側踝關節、腳趾運動。如 2.1 節所述，腰骶段脊髓頭尾方向也存在一定規律，暴露的脊髓前部主要誘發屈髖、伸膝、屈踝等動作，而后部主要誘發伸髖、屈膝、伸踝等動作。以上幾個動作在步進過程中起主導作用，腰骶部脊髓還能誘發其他動作，如內收髖關節、關節旋轉等。同一位點刺激電流的大小對誘發的動作有明顯影響，當刺激電流從閾值開始以一定的斜率增加時，運動時募集到的肌纖維數量會增加，動作的幅度與力度會增強。當電流增加到一個等級后動作也會發生變化，因為電流增大時其傳播范圍也會增大。
圖4
運動功能恢復的刺激位點圖
Figure4.
Stimulation sites for restoration of movement function
4 結論
本文對刺激大鼠腰骶段脊髓產生的一系列動作的區域進行了描述，繪制了大鼠腰骶段脊髓運動功能圖譜，并得出以下結論：在脊髓兩側合適位點植入盡量少的電極，對兩側的電極以一定的時相進行交叉控制，能夠產生簡單的步進運動。電刺激過程中組織的疲勞是很重要的問題，有實驗表明，大鼠脊髓內功能電激勵能優先募集耐疲勞的肌纖維并產生較平緩的肌力[10]。在合適的刺激電流下微絲電極只會激活其周圍少量的運動神經元及中間神經元。后續實驗可以參照此次研究成果以少量的電極完成后肢運動功能的恢復。在以后的實驗中可以結合其他方式促進后肢運動功能的恢復，如跑臺訓練和藥理學刺激。本文提供的急性動物實驗數據將為后續的慢性實驗提供對比和參考。
