采用共價接枝將 CD34 抗體接枝到聚乙二醇修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子上，構建具有 CD34 抗體與 PEG 共同修飾的功能型磁性納米粒子。通過紅外檢測（FT-IR）、納米粒子粒徑分析（動態光散射和透射電子顯微鏡）等方法對修飾后的磁性納米粒子進行檢測，并將其與內皮祖細胞（EPCs）共混培養，評價納米粒子的細胞相容性以及對 EPCs 短時間的結合效果，然后在動態外加磁場的作用下評價修飾后磁性納米粒子對 EPCs 的定向引導效果。結果表明，CD34 抗體成功修飾到磁性納米粒子表面，修飾后的納米粒子在一定的濃度范圍內有較好的細胞相容性，短時間對 EPCs 具有較好的識別結合作用，并且能在外加磁場作用下初步實現在動態環境下對 EPCs 的定向引導。
引用本文： 范儀, 杜澤煜, 黃楠. 靶向捕獲內皮祖細胞磁性納米粒子的生物學修飾及其細胞相容性評價. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(6): 900-904, 913. doi: 10.7507/1001-5515.201611060 復制
引言
磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）在生物學領域因其獨特的磁響應性、良好的生物相容性、體內可降解性等，引起了研究者們的廣泛關注，具有廣闊的應用前景[1]。近年來，以磁性納米粒子為載體的特異性靶向已被廣泛運用到心血管疾病的治療和內皮損傷重建上[2-5]。研究表明，通過在納米粒子表面固定識別分子，可以實現對細胞的特異性捕獲。Landázuri 等[6]將聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾的超順磁性納米顆粒（superparamagnetism nanoparticles，SPIONs）有效負載在人源間充質干細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）上，發現對加載了 SPIONs 的 hMSCs 應用適當的磁場梯度，將有可能在特定的血管網絡組織中定位 hMSCs。Vosen 等[7]可以在外加磁場作用下將納米粒子磁化后的細胞靶向到小鼠頸動脈受損部位從而促進受損部位內皮重組。
在本研究中，通過共價接枝的方法將 CD34 抗體接枝到 PEG 修飾的 Fe3O4 磁性納米粒子上，構建一種可以特異性靶向內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的功能型納米粒子，并對其穩定性及細胞相容性進行了評價，為后期開展更為深入的應用研究進行初步探索。
1 實驗部分
1.1 實驗試劑
1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、結晶紫/PB 染色劑、CCK-8 指示劑購自美國 Sigma 公司；末端雙羧基 PEG 修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子（Fe3O4-PEG）購自北京萬德高科技發展有限公司；Rat CD34 抗體購自美國 Gene Tax 公司；α-MEM 培養基購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司。
傅里葉紅外光譜儀購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司，動態激光散射儀購自英國馬爾文公司，電子顯微鏡購自日本 Jeol 公司，酶標儀購自美國 Bio-tek instrument 公司，光學顯微鏡購自荷蘭 OLYMPUS 公司，PD-10 交換柱購自美國 GE 公司。
1.2 納米粒子制備
利用羧基和氨基官能團的縮合反應實現生物分子 CD34 抗體與雙羧基 PEG 修飾 Fe3O4-PEG 納米粒子的結合。具體操作步驟如下：首先將 2 mg Fe3O4-PEG 納米粒子分散到 PBS 溶液（pH = 7.4）中，再依次加入 1.25 mg 的 EDC 和 NHS。室溫下反應 1 h 后，采用 PD-10 交換柱對活化后的 Fe3O4-PEG 進行清洗。然后無菌條件下加入 15 μg CD34 抗體，在 37℃ 搖床上以 80 r·min–1的速度反應 4 h 后進行磁傾析。用 PBS 溶液清洗 3 遍后，重新分散到 PBS 中，即得到 CD34 抗體修飾的磁性納米粒子（Fe3O4-PEG@CD34）。
1.3 材料學表征
1.3.1 傅里葉變換紅外光譜學（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）
采用傅立葉變換紅外光譜儀檢測 CD34 抗體接枝前后納米粒子的化學基團變化，測量范圍設定為 4 000～400 cm–1。
1.3.2 動態光散射（dynamic light scattering，DLS）
采用動態激光散射儀分析 Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 兩種樣品的粒徑分布及電位變化。
1.3.3 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）
用透射電子顯微鏡觀察 Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 的尺寸和形貌變化。
1.4 細胞學評價
1.4.1 Fe3O4-PEG@CD34 對 EPCs 增殖能力影響
用 CCK-8 評價 CD34 抗體修飾后的納米粒子對 EPCs 增殖活性的影響。將 EPCs 與不同濃度 Fe3O4-PEG@CD34（0、50、100、150、200 μg·mL–1）共混培養 1 d 和 3 d。在測試時間點前 4 h 將培養基吸出，每孔加入含有 10% CCK-8 的 α-MEM 培養基 500 μL，置于 37℃、5% CO2 細胞培養箱中孵育 4 h。吸取 CCK-8 工作液于 96 孔板中，在波長 450 nm 處讀取吸光度值。
1.4.2 Fe3O4-PEG、Fe3O4-PEG@CD34 與 EPCs 的靜態結合
用 α-MEM 培養基分別將 Fe3O4-PEG、Fe3O4-PEG@CD34 稀釋至 100 μg·mL–1后加入 1 mL 至 12 孔板內，與培養了 24 h 的 EPCs 在 37℃、5% CO2 細胞培養箱中共同孵育 3 min，對照組只加入新鮮細胞培養基。棄去懸液，用生理鹽水反復清洗 5 次，10% 多聚甲醛溶液固定 20 min 后，加入普魯士藍與結晶紫染色劑分別對磁性納米粒子和細胞進行染色，用光學顯微鏡觀察。
1.4.3 外加磁場下磁性納米粒子對 EPCs 的定向引導
為了評價 Fe3O4-PEG@CD34 在磁場輔助下能否快速靶向 EPCs 并且聚集到磁場施加位置，分別評價了動態短期施加磁場（3 min）和長期施加磁場（6 h）下，Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 對 EPCs 的捕獲情況。具體操作如下：在 80 r·min–1動態情況下，將 Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34（100 μg·mL–1）分別與細胞密度為 5×104個/cm2的 EPCs 懸液共混后加入 1 mL 至 12 孔板內，在孔板底部施加磁場，磁場強度為 250 mT，一組在培養板底部動態連續施加磁場 3 min 后，棄上清，重新加入培養基后在 37℃、5% CO2 細胞培養箱里培養 6 h，另一組連續施加磁場培養 6 h。對照組只加入 EPCs 懸液，其余操作同上。生理鹽水清洗多次后，10% 多聚甲醛溶液固定 20 min，再用普魯士藍與結晶紫染色，觀察培養板上的細胞情況。采用 SPSS 軟件進行方差分析，檢驗水準 α = 0.05。
2 結果及分析
2.1 FT-IR
由圖 1 可見，PEG 修飾的 Fe3O4 磁性納米粒子在 599 cm–1處出現了納米粒子 Fe3O4 的 Fe-O 特征伸縮振動峰，2 877 cm–1和 1 150～1 060 cm–1處出現 PEG 的-CH2-CH2 伸縮振動峰和較強的-C-O 的伸縮振動峰。經 CD34 抗體修飾后的納米粒子分別在 1 542 cm–1和 1 400 cm–1處出現酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶吸收峰。酰胺峰位的出現表明 CD34 抗體成功修飾到原磁性納米粒子上。另外，Fe3O4-PEG 中在 1 000～750 cm–1處出現的明顯透過峰可能是羧基上的氫氧變形振動峰，當 PEG 上的羧基與 CD34 抗體上的氨基發生脫水縮合后，氫氧變形振動峰就消失了，所以這兩個峰在 Fe3O4-PEG@CD34 并未出現。
圖1
Fe3O4-PEG（a）和 Fe3O4-PEG@CD34（b）納米粒子的 紅外光譜圖
Figure1.
FT-IR spectra of Fe3O4-PEG (a) and Fe3O4-PEG@CD34 (b) magnetic nanoparticles
2.2 納米粒子表征
通過 DLS 來測量 CD34 抗體修飾前后納米粒子的粒徑分布情況。由圖 2 可知，Fe3O4-PEG 在 PBS 溶液中粒徑主要分布在 30～100 nm，平均粒徑約 47 nm。Fe3O4-PEG@CD34 的粒徑主要分布在 100～200 nm，平均粒徑為 123 nm。30 d 后二者的平均粒徑分別變為 54 nm 和 210 nm。這可能是由于 CD34 抗體上的氨基很多，可能同時接在很多個納米粒子上，所以修飾后的納米粒子平均粒徑更大，粒徑分布范圍更廣。一般情況下，體內使用的納米粒子粒徑在 5～200 nm 之間，這樣既能避免納米粒子因粒徑過小而被腎臟清除，又能避免因其粒徑過大被脾臟過濾[8-9]。所以，本文所制備的納米粒子能用于體內。根據 TEM 顯示，Fe3O4-PEG 形貌規則，多為球形分布，粒徑為（12.1 ± 1.4）nm；而 CD34 修飾后的納米粒子形貌變得較不規則，粒徑增大到（14.2 ± 1.5）nm。這可能是由于 CD34 抗體表面的氨基官能團與 Fe3O4-PEG 納米粒子上的羧基官能團發生脫水縮合，使多個納米粒子交聯所致，也從側面反映了生物分子與納米粒子的結合。Fe3O4-PEG 納米粒子的 Zeta 電位為（–9.03 ± 0.57）mV，Fe3O4-PEG@CD34 的 Zeta 電位為（–13.67 ± 0.29）mV。水合粒徑和 Zeta 電位的變化可以間接表明 CD34 抗體成功修飾到 PEG 包裹的四氧化三鐵納米粒子上。
圖2
Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子的水合粒徑和透射電鏡分布圖
Figure2.
DLS and TEM of Fe3O4-PEG and Fe3O4-PEG@CD34 magnetic nanoparticles
2.3 細胞增殖活性
由圖 3 可知 EPCs 的活性隨著培養時間的延長而增強。共同培養 1 d，不同濃度 Fe3O4-PEG@CD34 之間的細胞活性存在一定的差異，100 μg·mL–1 濃度組具有相對較高的細胞活性。第 3 天細胞活性與第 1 天結果趨勢相同，但整體細胞活性相比第 1 天呈現顯著的增強，100 μg·mL–1 濃度組的細胞活性最高。
圖3
不同濃度 Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子與 EPCs 共同培 養的 CCK-8 結果（*P < 0.05，** P < 0.01）
Figure3.
The CCK-8 results of EPCs incubated with different concentrations of the magnetic nanoparticles (*P < 0.05, ** P < 0.01)
由 CCK-8 結果可知隨 Fe3O4-PEG@CD34 濃度的增加，細胞活性先呈現上升的趨勢，在濃度為 100 μg·mL–1時細胞的活性最強，隨后隨著 MNPs 的濃度增加，細胞活性呈現下降的趨勢。這可能是由于 CD34 抗體的引入可加強 Fe3O4-PEG@CD34 與細胞間的特異性結合作用，因而 Fe3O4-PEG@CD34 能改善細胞相容性，進而促進細胞的增殖；但隨著 Fe3O4-PEG@CD34 濃度的逐步增加，納米粒子的尺寸效應對細胞生長的抑制作用也逐漸凸顯，因而細胞活性有所下降。
2.4 磁性納米粒子與 EPCs 的靜態結合
將 Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34（100 μg·mL–1）分別與 EPCs 短時間孵育 3 min，并通過普魯士藍染液檢測鐵離子的存在。結果如圖 4 所示，Fe3O4-PEG@CD34 組 EPCs 中出現藍染，而 Fe3O4-PEG 組則沒有，說明在短時間內 Fe3O4-PEG@CD34 能夠特異性結合 EPCs。
圖4
普魯士藍與結晶紫對磁性納米粒子與 EPCs 結合后染色光鏡結果（bar = 50 μm）
Figure4.
Prussian blue and crystal violet stained microphotographs of EPCs incubated with magnetic nanoparticles (bar = 50 μm)
2.5 外加磁場下磁性納米粒子對 EPCs 的定向引導
由圖 5、6 可知，施加 3 min 短期磁場后，對照組和 Fe3O4-PEG 組只有少量細胞，而 Fe3O4-PEG@CD34 組細胞數量顯著增加。由此可見，Fe3O4-PEG@CD34 具有短期內識別 EPCs 并將其快速運輸到磁場施加部位的能力。在動態施加磁場 6 h 后，對照組和 Fe3O4-PEG 均有一定量的細胞黏附，且 Fe3O4-PEG 組多于對照組，這可能是已經有部分 Fe3O4-PEG 納米粒子進入細胞內，將其運送到磁場施加部位。但 Fe3O4-PEG@CD34 組 EPCs 數量顯著高于其他兩組，說明長時間磁場作用下，Fe3O4-PEG@CD34 對 EPCs 具有良好的識別捕獲能力。
圖5
動態磁場作用下，Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 在不同時間內對 EPCs 的捕獲結果
Figure5.
The EPCs capture results in different times by Fe3O4-PEG and Fe3O4-PEG@CD34 magnetic nanoparticles in dynamic magnetic field
圖6
動態磁場作用下，Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 在 不同時間內對 EPCs 的捕獲計數（**P < 0.01，*** P < 0.001）
Figure6.
The number of captured EPCs in different times by Fe3O4-PEG and Fe3O4-PEG@CD34 magnetic nanoparticles in dynamic magnetic field (**P < 0.01, *** P < 0.001)
3 總結
本文在 PEG 修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子表面使用 CD34 抗體對其進行進一步的生物分子修飾，成功制備出了具有 CD34 抗體修飾的磁性納米粒子。紅外結果顯示 CD34 抗體成功修飾到 Fe3O4-PEG 納米粒子上。CD34 抗體修飾后的納米粒子水合粒徑為 100～200 nm，透射電鏡粒徑為（14.2 ± 1.5）nm，可滿足后期體內實驗需求。
Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子與 EPCs 共同培養中展現出了很好的細胞相容性，在濃度為 100 μg·mL–1時細胞的活性最強。靜態 Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子與 EPCs 結合的實驗結果表明隨著 CD34 抗體的引入，提高了磁性納米粒子對 EPCs 識別結合的能力。進一步地，在外加磁場和動態環境下，可實現 Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子對 EPCs 的快速捕獲和定向引導。這為生物功能化的磁性納米粒子在生物醫學材料領域的應用奠定了基礎。
引言
磁性納米粒子（magnetic nanoparticles，MNPs）在生物學領域因其獨特的磁響應性、良好的生物相容性、體內可降解性等，引起了研究者們的廣泛關注，具有廣闊的應用前景[1]。近年來，以磁性納米粒子為載體的特異性靶向已被廣泛運用到心血管疾病的治療和內皮損傷重建上[2-5]。研究表明，通過在納米粒子表面固定識別分子，可以實現對細胞的特異性捕獲。Landázuri 等[6]將聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修飾的超順磁性納米顆粒（superparamagnetism nanoparticles，SPIONs）有效負載在人源間充質干細胞（human mesenchymal stem cells，hMSCs）上，發現對加載了 SPIONs 的 hMSCs 應用適當的磁場梯度，將有可能在特定的血管網絡組織中定位 hMSCs。Vosen 等[7]可以在外加磁場作用下將納米粒子磁化后的細胞靶向到小鼠頸動脈受損部位從而促進受損部位內皮重組。
在本研究中，通過共價接枝的方法將 CD34 抗體接枝到 PEG 修飾的 Fe3O4 磁性納米粒子上，構建一種可以特異性靶向內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）的功能型納米粒子，并對其穩定性及細胞相容性進行了評價，為后期開展更為深入的應用研究進行初步探索。
1 實驗部分
1.1 實驗試劑
1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、結晶紫/PB 染色劑、CCK-8 指示劑購自美國 Sigma 公司；末端雙羧基 PEG 修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子（Fe3O4-PEG）購自北京萬德高科技發展有限公司；Rat CD34 抗體購自美國 Gene Tax 公司；α-MEM 培養基購自美國 Hyclone 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司。
傅里葉紅外光譜儀購自美國 Thermo Fisher Scientific 公司，動態激光散射儀購自英國馬爾文公司，電子顯微鏡購自日本 Jeol 公司，酶標儀購自美國 Bio-tek instrument 公司，光學顯微鏡購自荷蘭 OLYMPUS 公司，PD-10 交換柱購自美國 GE 公司。
1.2 納米粒子制備
利用羧基和氨基官能團的縮合反應實現生物分子 CD34 抗體與雙羧基 PEG 修飾 Fe3O4-PEG 納米粒子的結合。具體操作步驟如下：首先將 2 mg Fe3O4-PEG 納米粒子分散到 PBS 溶液（pH = 7.4）中，再依次加入 1.25 mg 的 EDC 和 NHS。室溫下反應 1 h 后，采用 PD-10 交換柱對活化后的 Fe3O4-PEG 進行清洗。然后無菌條件下加入 15 μg CD34 抗體，在 37℃ 搖床上以 80 r·min–1的速度反應 4 h 后進行磁傾析。用 PBS 溶液清洗 3 遍后，重新分散到 PBS 中，即得到 CD34 抗體修飾的磁性納米粒子（Fe3O4-PEG@CD34）。
1.3 材料學表征
1.3.1 傅里葉變換紅外光譜學（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）
采用傅立葉變換紅外光譜儀檢測 CD34 抗體接枝前后納米粒子的化學基團變化，測量范圍設定為 4 000～400 cm–1。
1.3.2 動態光散射（dynamic light scattering，DLS）
采用動態激光散射儀分析 Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 兩種樣品的粒徑分布及電位變化。
1.3.3 透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）
用透射電子顯微鏡觀察 Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 的尺寸和形貌變化。
1.4 細胞學評價
1.4.1 Fe3O4-PEG@CD34 對 EPCs 增殖能力影響
用 CCK-8 評價 CD34 抗體修飾后的納米粒子對 EPCs 增殖活性的影響。將 EPCs 與不同濃度 Fe3O4-PEG@CD34（0、50、100、150、200 μg·mL–1）共混培養 1 d 和 3 d。在測試時間點前 4 h 將培養基吸出，每孔加入含有 10% CCK-8 的 α-MEM 培養基 500 μL，置于 37℃、5% CO2 細胞培養箱中孵育 4 h。吸取 CCK-8 工作液于 96 孔板中，在波長 450 nm 處讀取吸光度值。
1.4.2 Fe3O4-PEG、Fe3O4-PEG@CD34 與 EPCs 的靜態結合
用 α-MEM 培養基分別將 Fe3O4-PEG、Fe3O4-PEG@CD34 稀釋至 100 μg·mL–1后加入 1 mL 至 12 孔板內，與培養了 24 h 的 EPCs 在 37℃、5% CO2 細胞培養箱中共同孵育 3 min，對照組只加入新鮮細胞培養基。棄去懸液，用生理鹽水反復清洗 5 次，10% 多聚甲醛溶液固定 20 min 后，加入普魯士藍與結晶紫染色劑分別對磁性納米粒子和細胞進行染色，用光學顯微鏡觀察。
1.4.3 外加磁場下磁性納米粒子對 EPCs 的定向引導
為了評價 Fe3O4-PEG@CD34 在磁場輔助下能否快速靶向 EPCs 并且聚集到磁場施加位置，分別評價了動態短期施加磁場（3 min）和長期施加磁場（6 h）下，Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 對 EPCs 的捕獲情況。具體操作如下：在 80 r·min–1動態情況下，將 Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34（100 μg·mL–1）分別與細胞密度為 5×104個/cm2的 EPCs 懸液共混后加入 1 mL 至 12 孔板內，在孔板底部施加磁場，磁場強度為 250 mT，一組在培養板底部動態連續施加磁場 3 min 后，棄上清，重新加入培養基后在 37℃、5% CO2 細胞培養箱里培養 6 h，另一組連續施加磁場培養 6 h。對照組只加入 EPCs 懸液，其余操作同上。生理鹽水清洗多次后，10% 多聚甲醛溶液固定 20 min，再用普魯士藍與結晶紫染色，觀察培養板上的細胞情況。采用 SPSS 軟件進行方差分析，檢驗水準 α = 0.05。
2 結果及分析
2.1 FT-IR
由圖 1 可見，PEG 修飾的 Fe3O4 磁性納米粒子在 599 cm–1處出現了納米粒子 Fe3O4 的 Fe-O 特征伸縮振動峰，2 877 cm–1和 1 150～1 060 cm–1處出現 PEG 的-CH2-CH2 伸縮振動峰和較強的-C-O 的伸縮振動峰。經 CD34 抗體修飾后的納米粒子分別在 1 542 cm–1和 1 400 cm–1處出現酰胺Ⅱ帶和酰胺Ⅲ帶吸收峰。酰胺峰位的出現表明 CD34 抗體成功修飾到原磁性納米粒子上。另外，Fe3O4-PEG 中在 1 000～750 cm–1處出現的明顯透過峰可能是羧基上的氫氧變形振動峰，當 PEG 上的羧基與 CD34 抗體上的氨基發生脫水縮合后，氫氧變形振動峰就消失了，所以這兩個峰在 Fe3O4-PEG@CD34 并未出現。
圖1
Fe3O4-PEG（a）和 Fe3O4-PEG@CD34（b）納米粒子的 紅外光譜圖
Figure1.
FT-IR spectra of Fe3O4-PEG (a) and Fe3O4-PEG@CD34 (b) magnetic nanoparticles
2.2 納米粒子表征
通過 DLS 來測量 CD34 抗體修飾前后納米粒子的粒徑分布情況。由圖 2 可知，Fe3O4-PEG 在 PBS 溶液中粒徑主要分布在 30～100 nm，平均粒徑約 47 nm。Fe3O4-PEG@CD34 的粒徑主要分布在 100～200 nm，平均粒徑為 123 nm。30 d 后二者的平均粒徑分別變為 54 nm 和 210 nm。這可能是由于 CD34 抗體上的氨基很多，可能同時接在很多個納米粒子上，所以修飾后的納米粒子平均粒徑更大，粒徑分布范圍更廣。一般情況下，體內使用的納米粒子粒徑在 5～200 nm 之間，這樣既能避免納米粒子因粒徑過小而被腎臟清除，又能避免因其粒徑過大被脾臟過濾[8-9]。所以，本文所制備的納米粒子能用于體內。根據 TEM 顯示，Fe3O4-PEG 形貌規則，多為球形分布，粒徑為（12.1 ± 1.4）nm；而 CD34 修飾后的納米粒子形貌變得較不規則，粒徑增大到（14.2 ± 1.5）nm。這可能是由于 CD34 抗體表面的氨基官能團與 Fe3O4-PEG 納米粒子上的羧基官能團發生脫水縮合，使多個納米粒子交聯所致，也從側面反映了生物分子與納米粒子的結合。Fe3O4-PEG 納米粒子的 Zeta 電位為（–9.03 ± 0.57）mV，Fe3O4-PEG@CD34 的 Zeta 電位為（–13.67 ± 0.29）mV。水合粒徑和 Zeta 電位的變化可以間接表明 CD34 抗體成功修飾到 PEG 包裹的四氧化三鐵納米粒子上。
圖2
Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子的水合粒徑和透射電鏡分布圖
Figure2.
DLS and TEM of Fe3O4-PEG and Fe3O4-PEG@CD34 magnetic nanoparticles
2.3 細胞增殖活性
由圖 3 可知 EPCs 的活性隨著培養時間的延長而增強。共同培養 1 d，不同濃度 Fe3O4-PEG@CD34 之間的細胞活性存在一定的差異，100 μg·mL–1 濃度組具有相對較高的細胞活性。第 3 天細胞活性與第 1 天結果趨勢相同，但整體細胞活性相比第 1 天呈現顯著的增強，100 μg·mL–1 濃度組的細胞活性最高。
圖3
不同濃度 Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子與 EPCs 共同培 養的 CCK-8 結果（*P < 0.05，** P < 0.01）
Figure3.
The CCK-8 results of EPCs incubated with different concentrations of the magnetic nanoparticles (*P < 0.05, ** P < 0.01)
由 CCK-8 結果可知隨 Fe3O4-PEG@CD34 濃度的增加，細胞活性先呈現上升的趨勢，在濃度為 100 μg·mL–1時細胞的活性最強，隨后隨著 MNPs 的濃度增加，細胞活性呈現下降的趨勢。這可能是由于 CD34 抗體的引入可加強 Fe3O4-PEG@CD34 與細胞間的特異性結合作用，因而 Fe3O4-PEG@CD34 能改善細胞相容性，進而促進細胞的增殖；但隨著 Fe3O4-PEG@CD34 濃度的逐步增加，納米粒子的尺寸效應對細胞生長的抑制作用也逐漸凸顯，因而細胞活性有所下降。
2.4 磁性納米粒子與 EPCs 的靜態結合
將 Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34（100 μg·mL–1）分別與 EPCs 短時間孵育 3 min，并通過普魯士藍染液檢測鐵離子的存在。結果如圖 4 所示，Fe3O4-PEG@CD34 組 EPCs 中出現藍染，而 Fe3O4-PEG 組則沒有，說明在短時間內 Fe3O4-PEG@CD34 能夠特異性結合 EPCs。
圖4
普魯士藍與結晶紫對磁性納米粒子與 EPCs 結合后染色光鏡結果（bar = 50 μm）
Figure4.
Prussian blue and crystal violet stained microphotographs of EPCs incubated with magnetic nanoparticles (bar = 50 μm)
2.5 外加磁場下磁性納米粒子對 EPCs 的定向引導
由圖 5、6 可知，施加 3 min 短期磁場后，對照組和 Fe3O4-PEG 組只有少量細胞，而 Fe3O4-PEG@CD34 組細胞數量顯著增加。由此可見，Fe3O4-PEG@CD34 具有短期內識別 EPCs 并將其快速運輸到磁場施加部位的能力。在動態施加磁場 6 h 后，對照組和 Fe3O4-PEG 均有一定量的細胞黏附，且 Fe3O4-PEG 組多于對照組，這可能是已經有部分 Fe3O4-PEG 納米粒子進入細胞內，將其運送到磁場施加部位。但 Fe3O4-PEG@CD34 組 EPCs 數量顯著高于其他兩組，說明長時間磁場作用下，Fe3O4-PEG@CD34 對 EPCs 具有良好的識別捕獲能力。
圖5
動態磁場作用下，Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 在不同時間內對 EPCs 的捕獲結果
Figure5.
The EPCs capture results in different times by Fe3O4-PEG and Fe3O4-PEG@CD34 magnetic nanoparticles in dynamic magnetic field
圖6
動態磁場作用下，Fe3O4-PEG 和 Fe3O4-PEG@CD34 在 不同時間內對 EPCs 的捕獲計數（**P < 0.01，*** P < 0.001）
Figure6.
The number of captured EPCs in different times by Fe3O4-PEG and Fe3O4-PEG@CD34 magnetic nanoparticles in dynamic magnetic field (**P < 0.01, *** P < 0.001)
3 總結
本文在 PEG 修飾的四氧化三鐵磁性納米粒子表面使用 CD34 抗體對其進行進一步的生物分子修飾，成功制備出了具有 CD34 抗體修飾的磁性納米粒子。紅外結果顯示 CD34 抗體成功修飾到 Fe3O4-PEG 納米粒子上。CD34 抗體修飾后的納米粒子水合粒徑為 100～200 nm，透射電鏡粒徑為（14.2 ± 1.5）nm，可滿足后期體內實驗需求。
Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子與 EPCs 共同培養中展現出了很好的細胞相容性，在濃度為 100 μg·mL–1時細胞的活性最強。靜態 Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子與 EPCs 結合的實驗結果表明隨著 CD34 抗體的引入，提高了磁性納米粒子對 EPCs 識別結合的能力。進一步地，在外加磁場和動態環境下，可實現 Fe3O4-PEG@CD34 納米粒子對 EPCs 的快速捕獲和定向引導。這為生物功能化的磁性納米粒子在生物醫學材料領域的應用奠定了基礎。
