本文主要研究載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對炎癥環境下軟骨細胞維持表型的作用。通過物理共混結合真空冷凍干燥的方法制備載穿心蓮內酯膠原緩釋支架，采用環境掃描電子顯微鏡（ESEM）、真密度儀和紫外可見分光光度計表征載藥支架的形貌、開孔率和藥物釋放情況。將經分離、擴增培養后的兔關節軟骨細胞接種于載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上，在常規培養液條件下培養 3 d、白細胞介素 1β（IL-1β）模擬的炎癥環境下培養 7 d，期間采用阿爾瑪藍（Alamar Blue）、熒光素二乙酸（FDA）染色、實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）等方法研究所制備支架對軟骨細胞的增殖和表型的影響。實驗結果表明，真空冷凍干燥法制備的膠原支架孔連通性良好，平均孔徑為（120.7 ± 17.8）μm，開孔率可達 96%，該載藥支架可在兩周內實現藥物的持續釋放。Alamar Blue 實驗結果表明，質量分數為 2.22% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可顯著抑制軟骨細胞增殖，而其它載藥濃度的膠原緩釋支架對炎癥環境下軟骨細胞的增殖無顯著影響。FDA 染色結果表明，質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可降低 IL-1β 對軟骨細胞形貌的改變，且該濃度載藥支架可顯著抑制基質金屬蛋白酶-1（MMP-1）和基質金屬蛋白酶-13（MMP-13）的轉錄，促進基質金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、軟骨細胞外基質相關基因 II 型膠原（COL II）和聚集蛋白聚糖（Aggrecan）的轉錄，提高 COL II/I 型膠原（COL I）的比值。基于以上研究結果，表明質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可以抑制 IL-1β 模擬的炎癥環境下軟骨細胞內不利于維持表型的基因（如：MMP-1、MMP-13）的轉錄，促進利于維持表型的基因（如：COL II、Aggrecan、TIMP-1）的轉錄，從而增強炎癥環境下的軟骨細胞維持其表型的能力，有望用于關節炎軟骨損傷修復。
引用本文： 徐麗女, 劉海蓉, 戴瑤, 李永生, 陳微. 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架促進體外炎癥環境下軟骨細胞表型維持的研究. 生物醫學工程學雜志, 2018, 35(6): 905-913. doi: 10.7507/1001-5515.201804025 復制
引言
目前，通過組織工程或再生醫學構建再生組織用以修復軟骨缺損已取得一系列進展[1-2]，但是當其植入患處后，體內急慢性炎癥環境極易導致軟骨細胞失去表型進而形成礦化軟骨導致修復失敗[3]。因此在炎癥環境下如何使軟骨細胞維持其表型成為工程化軟骨臨床應用過程中的關鍵。研究表明，白細胞介素 1β（interleukin-1 beta, IL-1β）是關節炎中最重要的致病炎癥因子之一，可以極大促進軟骨細胞外基質的降解[4]，因此如何預防促炎因子 IL-1β 環境下軟骨基質的降解成為備受關注的重要研究課題，目前相關研究大部分采用 10 ng/mL 的 IL-1β 培養液以模擬體內炎癥環境[5-7]。
支架在組織工程中具有重要作用，不僅可以提供細胞生長需要的空間，更重要的是可以給細胞提供一個良好的保護環境，因此通過添加生物活性因子，賦予支架抗炎性能，能使其具有重要的應用價值。目前常利用作用于炎癥通路或特定酶的小分子藥物來實現抗炎作用，通過生長因子促進軟骨細胞分泌細胞外基質來實現表型維持，然而從組織工程或再生醫學角度出發，如何構建功能化支架以實現抗炎功效的同時增強軟骨細胞維持表型的能力顯得尤為重要[8-9]。已有研究表明，中藥有效成分可作為一種重要調控因子調控細胞的生理過程，更因其長效、穩定、多靶點作用等優點可應用于炎癥的治療且效果顯著[10-11]。其中，穿心蓮內酯作為一種中藥有效成分，具有在炎癥環境下可抑制軟骨細胞中能降解細胞外基質的基質金屬蛋白酶分泌的功能，并可促進正常環境下軟骨細胞的細胞外基質分泌[12-13]。因此，本文將穿心蓮內酯與膠原復合制成緩釋支架，使用 10 ng/mL 的 IL-1β 培養液誘導軟骨細胞產生炎癥反應來模擬體內的炎癥環境。然后通過研究模擬炎癥環境下，不同藥物濃度的膠原緩釋支架對軟骨細胞形貌及表型相關基因轉錄的影響，探索軟骨組織工程臨床轉化過程中可能因患處炎癥微環境導致再生修復失敗的解決方法，并為深入理解炎癥環境對軟骨細胞表型的影響機制和改良組織工程可降解支架材料的設計以增強炎癥環境下的軟骨細胞維持其特有表型的能力提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器設備
1.1.1 主要試劑
I 型膠原（collagen I, COL I）（基因型為 COL I）、IL-1β、糖原、異丙醇、引物等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；熒光素二乙酸（fluorescein diacetate, FDA）購自上海翊圣生物科技有限公司；穿心蓮內酯（結構式如圖 1 所示）、氯仿購自上海阿拉丁生化科技有限公司；醋酸、丙酮購自國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇購自天津市富宇精細化工有限公司；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）購自美國 Genview 公司；新西蘭兔（一周齡）購自中南大學湘雅三醫院動物實驗中心；達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）（高糖）培養基、0.2 mL 離心管等購自美國 Thermo 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；胰蛋白酶、雙抗（青霉素和鏈霉素）、氯仿苯酚異戊醇混合液、聚丙烯酰胺、酶標板等購自北京鼎國生物技術有限公司；阿爾瑪藍（Alamar Blue）、Trizol 試劑、逆轉錄酶購自美國 Invitrogen 公司；核糖核酸酶 A（RNase A）、RNA 逆轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser）購自日本 Takara 公司；脫氧核糖核酸酶 I（DNase I）、DNA 標記（DNA Marker）、Tag DNA 聚合酶購自加拿大 Fermentas 公司；熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）預混液購自康為公司；瓊脂糖購自法國 Biowest 公司；細胞培養皿、24 孔細胞培養板購自德國 Greiner bio-one 公司；0.2 mL 八排 PCR 管、1.5 mL 離心管購自美國 Axygen 公司。
圖1
穿心蓮內酯分子結構
Figure1.
Structure of andrographolide
1.1.2 主要儀器設備
倒置熒光顯微鏡（IX2-1LL100，OLYMPUS，日本），真空冷凍干燥機（GLZ-1，上海浦東冷凍干燥設備有限公司），冷凍離心機（MICRO 17R，Thermo，美國），冷凍離心機（MULTIFUGE C1R，Thermo，美國），集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司），紫外可見分光光度計（UV-2600，UNICO，美國），微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo，美國），酶標儀（MK3，Thermo，美國），生物安全柜（HF-1200，上海力申科學儀器有限公司），凝膠成像系統（Tanon 2500R，上海天能科技有限公司），實時熒光定量 PCR 儀（CFX96，Bio-Rad，美國），真密度儀（JW-M100A，北京精微高博科學技術有限公司），環境掃描電子顯微鏡（environmental scanning electron microscope, ESEM）（FEI QUANTA 200，捷克，捷克），石蠟切片機（RM2245，LEICA，德國）。
1.2 方法
1.2.1 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架的制備
將穿心蓮內酯粉末溶于 DMSO 溶劑中，分別制備濃度為 0、8、40、200 μg/μL 的穿心蓮內酯 DMSO 溶液。將 COL I 溶于 3% 醋酸溶液中，磁力攪拌使其充分溶解，1 500 r/min 條件下離心 10 min 除去氣泡，制備出質量分數為 9 mg/mL 的膠原溶液。向膠原溶液中加入不同濃度穿心蓮內酯 DMSO 溶液，通過磁力攪拌和離心處理后制備出穿心蓮內酯質量分數為 0%、0.088%、0.44%、2.22% 的穿心蓮內酯膠原溶液，將穿心蓮內酯膠原溶液以每孔 0.5 mL 加入 24 孔板中，–10℃ 條件下預凍 24 h 后冷凍干燥 24 h。對所制備的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架采用環氧乙烷滅菌處理后備用。
1.2.2 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架性能表征
將載穿心蓮內酯膠原緩釋支架噴金處理后采用 ESEM（FEI QUANTA 200，捷克，捷克）對支架形貌進行表征，并通過圖像處理軟件 Image J Launcher（National Institutes of Health，美國）隨機測量 100 個孔的直徑，以計算膠原支架的平均孔徑大小[14]。
采用真密度儀（JW-M100A，北京精微高博科學技術有限公司）測試載穿心蓮內酯膠原緩釋支架的開孔率。首先稱量樣品質量 m，測量樣品的尺寸并計算其視體積 v，然后將樣品放入樣品杯中，利用真密度儀測量樣品的真密度 ρ真，最后計算出樣品的開孔率，如式（1）所示：
 |
公式中 ρ視 為視密度，ρ視 = m/v。
1.2.3 溶液配制
雙抗：100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素；
常規培養液：1% 雙抗 + 10% 胎牛血清 + 100% DMEM（高糖）培養基（體積分數）；
炎癥培養液：含有 10 ng/mL IL-1β 的常規培養液；
磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline, PBS）溶液：8 g/L NaCl + 0.2 g/L KCl + 1.44 g/L Na2HP04 + 0.24 g/L KH2P04；
乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）溶液：7.4 g EDTA 粉末均勻混于 1 L 二重蒸餾水中；
消化液：0.25 g 胰蛋白酶粉末 + 200 μL EDTA 溶液 + 100 mL PBS 溶液；
Alamar Blue 反應液：5%Alamar Blue + 100% 常規培養液（體積分數）；
FDA 反應液：0.1% 5 mg/mL 的 FDA 丙酮溶液 + 100% DMEM（高糖）培養基（體積分數）；
0.15% II 型膠原酶（collagenase II）溶液：0.15 g collagenase II 溶于 100 mL DMEM（高糖）培養基。
1.2.4 軟骨細胞分離與培養
將一周齡的雄性新西蘭兔處死，在無菌環境下取出四肢的關節軟骨，將軟骨切成 1～3 mm3大小，用體積分數為 1% 雙抗的 PBS 溶液清洗 3 次后移入無菌離心管中，向離心管中加入適量 0.15% collagenase II 溶液，37℃ 下對軟骨進行消化處理，每隔 4 h 收集細胞，共收集兩次。收集到的消化液經 200 目篩過濾后于 1 000 r/min 條件下離心 5 min 使細胞沉淀，重懸計數后以 1.5 × 106 個/皿接種于培養皿中，加入常規培養液，置于培養箱中培養，常規培養液每隔 1 d 進行更換。
1.2.5 軟骨細胞與載穿心蓮內酯膠原緩釋支架于炎癥環境下共培養
采用消化液對軟骨細胞進行脫壁處理，加入常規培養液將細胞懸液濃度調整為 2.5 × 105 個/mL，吸取 400 μL 細胞懸液滴加于每個載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上，培養 6 h 待細胞黏附后加入常規培養液繼續培養。常規培養液培養 3 d 使軟骨細胞保持正常生長活性，然后將常規培養液更換為炎癥培養液模擬炎癥環境，繼續培養 7 d。
1.2.6 軟骨細胞增殖率
采用 Alamar Blue 方法檢測軟骨細胞在載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上的增殖率。當細胞在材料上培養 1、3、5、7、10 d 后，移除孔內原液體，每孔加入 1 mL Alamar Blue 反應液，置于培養箱培養 6 h 后每孔取 100 μL Alamar Blue 反應液于酶標板中檢測其在 570 nm 和 630 nm 波長處的吸光值。第 1 d 采用常規培養液其他時間采用炎癥培養液替換孔板中剩余的反應液，繼續培養。
細胞增殖率實驗中，軟骨細胞分組情況如下：
① 陰性對照組：空白孔（無細胞）的 Alamar Blue 反應液；
② C0 組：軟骨細胞在質量分數為 0% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養 1、3、5、7、10 d；
③ C1 組：軟骨細胞在質量分數為 0.088% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養 1、3、5、7、10 d；
④ C2 組：軟骨細胞在質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養 1、3、5、7、10 d；
⑤ C3 組：軟骨細胞在質量分數為 2.22% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養 1、3、5、7、10 d。
細胞還原率（reduced, R）（以符號 Rv表示），定義為具有氧化性的 Alamar Blue 被細胞中線粒體酶還原為還原產物的程度，表達式如式（2）所示：
'/> |
其中：
（εred, λ1）=155 677[還原態時 Alamar Blue 的摩爾消光系數（570 nm）]；
（εred, λ2）=5 494[還原態時 Alamar Blue 的摩爾消光系數（630 nm）]；
（εox, λ2）=80 586[氧化態時 Alamar Blue 的摩爾消光系數（630 nm）]；
Aλ1=測試孔吸光度（570 nm）；
Aλ2=測試孔吸光度（630 nm）；
A′λ1=陰性對照組吸光度（570 nm）；
A′λ2=陰性對照組吸光度（630 nm）。
為更好地比較不同濃度載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對細胞增殖的影響，以第 1 d 測得的還原率作為基準值進行歸一化處理，將其余時間點測得的還原率除以該基準值，即得到相應的細胞增殖率。
1.2.7 軟骨細胞形貌
通過活細胞熒光示蹤探針 FDA 染色觀察載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上軟骨細胞的形貌。取出軟骨細胞/載穿心蓮內酯膠原緩釋支架復合物，移除孔內原液體后用 37℃ 的 PBS 溶液清洗 3 次，加入 1 mL FDA 反應液，在室溫、避光條件下反應 5 min 后利用 37℃ 的 PBS 溶液清洗 3 次，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞形貌。
軟骨細胞形貌實驗中，細胞分組情況如下：
① D0 正常組：軟骨細胞在質量分數為 0% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 10 d；
② D0 組：軟骨細胞在質量分數為 0% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d；
③ D1 組：軟骨細胞在質量分數為 0.088% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d；
④ D2 組：軟骨細胞在質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d。
1.2.8 軟骨細胞基因轉錄情況
為進一步闡明在 IL-1β 模擬的炎癥環境下，載穿心蓮內酯膠原緩釋支架增強軟骨細胞維持其分化特征的分子生物學機制，本文采用實時定量 PCR（reverse-transcriptase quantitative PCR, RT-qPCR）檢測了軟骨細胞表型相關基因 COLⅠ、II 型膠原（collagen II, COL II）基因（COLⅡ）、 聚集蛋白蛋白聚糖（Aggrecan）基因（Aggrecan）和炎癥相關基因基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-1（MMP-1）基因（MMP-1）、MMP-13 基因（MMP-13）和 MMPs 抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1）基因（TIMP-1）的轉錄情況。將軟骨細胞/載穿心蓮內酯膠原緩釋支架復合物在常規培養液培養 3 d、炎癥培養液培養 7 d 后取出，PBS 溶液清洗后，加入消化液使細胞從支架上脫落，離心收集細胞后，按照試劑說明書，采用 Trizol 裂解細胞并進行 RNA 的純化與逆轉錄，采用 RT-qPCR 檢測基因轉錄情況，RT-qPCR 檢測用的兔基因引物序列如表 1 所示。
表1
兔基因引物序列
Table1.
primer sequences of rabbit genes
RT-qPCR 基因轉錄情況實驗中，細胞分組情況如下：
① D0 組：軟骨細胞在質量分數為 0% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d；
② D1 組：軟骨細胞在質量分數為 0.088% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d；
③ D2 組：軟骨細胞在質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養3 d、炎癥培養液中培養 7 d。
1.2.9 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架藥物釋放
首先采用紫外可見分光光度計（UV-2600，UNICO，美國）進行全波長掃描確定穿心蓮內酯的特征吸收峰為 227 nm 波長處，并建立穿心蓮內酯溶于 PBS 溶液中的藥物濃度標準曲線。將載穿心蓮內酯膠原緩釋支架置于 24 孔板中，每孔加入 1.5 mL PBS 后將孔板置于細胞培養箱中，于 1、3、5、7、9、11、13、15 d 時分別從每孔取出 50 μL，通過微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo，美國）檢測 227 nm 波長處吸光度，以測定 PBS 溶液中穿心蓮內酯的濃度。
1.3 統計學分析
所有的實驗結果均取 3 組平行樣，實驗數據以平均數 ± 標準差方式表示，通過統計分析軟件 SPSS 10.0（IBM，美國）處理，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 膠原支架微觀形貌
三維多孔支架可以為細胞的黏附、遷移、增殖等生理活動提供一個仿生的三維空間環境，對維持軟骨細胞的表型具有重要影響。載穿心蓮內酯膠原緩釋支架的 ESEM 形貌圖如圖 2 所示，可以看出膠原支架通孔性良好，孔徑大小均勻，平均孔徑為（120.7 ± 17.8）μm，通過真密度儀測得的支架開孔率達 96%，形成連通多孔的三維空間微環境，滿足軟骨組織工程支架孔徑大小和開孔率的要求。
圖2
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架 ESEM 形貌圖
Figure2.
ESEM images of andrographolide-releasing collagen scaffold
2.2 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞增殖的影響
緩釋支架中活性因子成分的濃度高低直接決定了緩釋過程中細胞培養微環境中活性成分的濃度，進而影響細胞行為，所以首先應確定合適的載藥濃度。本文采用 Alamar Blue 法連續檢測每個支架上軟骨細胞的生長狀況[15]。為充分體現樣品組之間細胞增殖的差異，采取細胞增殖率的方式進行比較。將質量分數為 0%、0.088%、0.44%、2.22% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養的軟骨細胞分別命名為 C0 組、C1 組、C2 組和 C3 組。不同濃度載藥支架上軟骨細胞在常規培養液培養 3 d，炎癥培養液培養 7 d 期間的細胞增殖率如圖 3 所示。相比純膠原支架，載藥濃度最高時，即質量分數為 2.22 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上的軟骨細胞增殖率明顯下降，而其他載藥支架對軟骨細胞增殖無明顯影響，表明高濃度穿心蓮內酯可抑制軟骨細胞增殖，這與文獻報道的結果一致[13]。因此本文將針對質量分數為 0.088 % 和 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架開展進一步的研究。
圖3
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞增殖的影響（n=3）
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2.3 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞形貌的影響
通過熒光示蹤探針 FDA 染色法觀察載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上軟骨細胞的形貌，研究載藥支架對軟骨細胞表型的影響。將質量分數為 0%、0.088% 和 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d 的軟骨細胞分別命名為 D0 組、D1 組和 D2 組；使用不含穿心蓮內酯的膠原支架，在常規培養液中培養 10 d 的軟骨細胞視為正常形貌，并命名為 D0 正常組，各組細胞形貌如圖 4 所示，相比 D0 正常組上細胞形貌類似圓形且尺寸較小，D0 組細胞在支架上均勻分布，但細胞形狀呈細長形，表現出軟骨細胞去分化的典型特征，表明 IL-1β 模擬的炎癥環境會促使軟骨細胞去分化[3]。然而相比 D0 組，D1 組上的軟骨細胞形狀細長接近 D0 組細胞的形貌，且細胞偽足相較 D0 組更細長。但該現象（即 IL-1β 促使軟骨細胞形貌發生改變）在質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架（D2 組）上得到有效的抑制，軟骨細胞形態趨于圓形，細胞尺寸變小，接近 D0 正常組細胞的形貌，表明質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可增強 IL-1β 模擬的炎癥環境下的軟骨細胞維持其特有形貌的能力。
圖4
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上軟骨細胞 FDA 染色
Figure4.
FDA staining of chondrocytes cultured on andrographolide-releasing collagen scaffold
2.4 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞基因轉錄水平的影響
Aggrecan、COL II 是軟骨細胞外基質的主要成分[16-17]，COL II/COL I 的比值被視為軟骨細胞去分化程度的標志，隨著軟骨細胞去分化程度的加深，COL II/COL I 比值逐漸下降[18-19]。MMP 高表達將引起軟骨細胞外基質的降解，MMP 和 MMP 抑制劑 TIMP-1 表達的失衡被認為是骨關節炎導致軟骨缺損的一個主要原因[20-21]。將質量分數為 0%、0.088% 和 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d 的軟骨細胞分別命名為 D0 組、D1 組和 D2 組。各組軟骨細胞相關基因轉錄情況如圖 5 所示。相比于純膠原支架，質量分數為 0.088% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可抑制軟骨細胞內不利于維持表型的基因 MMP-1、MMP-13、COL I 的轉錄，同時也抑制軟骨細胞轉錄中有利于維持表型的基因 COL II。而質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可極大促進 Aggrecan、COL II、COL I、TIMP-1 的轉錄，也抑制不利維持軟骨細胞表型的 MMP-1、MMP-13 的轉錄，且 COL II/COL I 的比值是純膠原支架上的 12 倍，表明該載藥濃度的載藥膠原支架極大增強了 IL-1β 模擬的炎癥環境下軟骨細胞維持其表型的能力，這與熒光染色結果一致。這些分子生物學上的數據可以進一步確認載藥支架表現出抗炎效果，并闡明合適載藥量的膠原支架增強軟骨細胞抵抗炎癥，維持分化表型的機制。
圖5
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上軟骨細胞基因轉錄情況（n=3）
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2.5 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架體外藥物釋放
在 IL-1β 模擬的炎癥環境下，質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可增強軟骨細胞維持表型的能力，而穿心蓮內酯的濃度對軟骨細胞影響很大，因而本文進一步檢測該支架的藥物釋放行為。結果如圖 6 所示，藥物釋放 1 d 后在 PBS 溶液中穿心蓮內酯濃度為 9 mg/L，7 d 后藥物釋放速度逐漸減緩，15 d 時藥物釋放量達到最大值 15.35 mg/L，表明質量分數為 0.44 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可在兩周內持續釋放穿心蓮內酯，且無明顯突釋現象。
圖6
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架藥物釋放曲線
Figure6.
The profile of andrographolide releasing from andrographolide-releasing collagen scaffold
3 討論
由創傷、關節炎惡化等引起的關節軟骨缺損已成為臨床上亟待解決的難題之一，采用組織工程和再生醫學修復軟骨缺損促進軟骨再生已取得一系列進展[22-23]，然而由于關節軟骨缺損往往伴隨著急慢性炎癥，面對炎癥的威脅，體外構建的工程化軟骨植入體內仍面臨后期退化導致修復失敗[3]，其中最主要的原因是軟骨細胞在炎癥環境下極易失去其特有表型進而喪失功能，主要表現為細胞尺寸變大，細胞形貌逐漸由圓形、多邊形變為纖維狀，軟骨基質相關蛋白表達降低，非軟骨基質的蛋白表達水平升高，比如 COL II 分泌量逐漸降低而 COL I 分泌量逐漸升高[18]。
在組織工程中，支架具有重要的作用，合適的孔徑結構可以給軟骨細胞提供生長與細胞外基質分泌所需的空間，更重要的是可以通過賦予組織工程支架長效的抗炎性能，給軟骨組織再生提供一個適宜的環境，因此構建具有長效抗炎性能進而增強炎癥環境下軟骨細胞維持其特有表型的能力的功能化支架對軟骨組織損傷修復具有重要的研究意義與應用價值。通過將具有抗炎效果和促軟骨細胞表型維持的藥物分子載入支架是一個有效的解決方案。穿心蓮內酯作為一種中藥有效成分，具有長效穩定的性能，同時具有良好的抗炎效果。研究顯示，穿心蓮內酯可抑制二維炎癥環境下的軟骨細胞炎性因子的分泌，促進二維正常環境下軟骨細胞增殖和細胞外基質分泌。因此，將穿心蓮內酯引入組織工程或再生醫學支架中，研究其對 IL-1β 模擬的炎癥環境下軟骨細胞表型維持的作用具有重要意義。
支架的孔隙結構和開孔率對細胞的黏附、遷移、增殖等生命活動具有重要作用，對于軟骨組織工程支架，合適的孔徑范圍約為 75～150 μm[24-25]。本研究所制備的膠原支架具有良好的連通結構，孔徑大小約 120 μm，其開孔率可達 96%，可為軟骨細胞提供一個良好的三維生長環境和營養物質、代謝廢物輸送通道。
細胞增殖對軟骨組織的構建具有重要作用，從本研究可以看出，高濃度載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可顯著抑制軟骨細胞增殖，合適載藥濃度的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞增殖無明顯影響。本文的數據表明，在 IL-1β 模擬的炎癥環境下，純膠原支架上的軟骨細胞形貌變得細長，本文構建的體外炎癥環境和體內的炎癥環境一樣可以使軟骨細胞退分化，失去正常的軟骨形貌。使用質量分數為 0.44 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架培養軟骨細胞時，軟骨細胞呈現出正常環境下常見的圓形形貌，表明在炎癥環境下質量分數為 0.44 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架有利于軟骨細胞維持其表型。為進一步闡明炎癥環境下該支架利于軟骨細胞維持其表型的機制，本文探索了軟骨細胞內與維持軟骨細胞表型相關基因的轉錄水平。對比純膠原支架組，質量分數為 0.44 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可顯著促進軟骨細胞表型維持相關基因 COL II、Aggrecan 的轉錄，且 COL II/COL I 的比值為對照組的 12 倍，同時降低炎癥因子 MMP-1、MMP-13 的轉錄水平，表明該緩釋支架具有促進軟骨細胞表型維持與抗炎的作用。綜合以上結果表明，合適載藥濃度的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可增強炎癥環境下的軟骨細胞維持其表型的能力，有望成為軟骨組織工程或再生醫學治療軟骨缺損過程中因炎癥導致修復失敗的有效解決方法。
引言
目前，通過組織工程或再生醫學構建再生組織用以修復軟骨缺損已取得一系列進展[1-2]，但是當其植入患處后，體內急慢性炎癥環境極易導致軟骨細胞失去表型進而形成礦化軟骨導致修復失敗[3]。因此在炎癥環境下如何使軟骨細胞維持其表型成為工程化軟骨臨床應用過程中的關鍵。研究表明，白細胞介素 1β（interleukin-1 beta, IL-1β）是關節炎中最重要的致病炎癥因子之一，可以極大促進軟骨細胞外基質的降解[4]，因此如何預防促炎因子 IL-1β 環境下軟骨基質的降解成為備受關注的重要研究課題，目前相關研究大部分采用 10 ng/mL 的 IL-1β 培養液以模擬體內炎癥環境[5-7]。
支架在組織工程中具有重要作用，不僅可以提供細胞生長需要的空間，更重要的是可以給細胞提供一個良好的保護環境，因此通過添加生物活性因子，賦予支架抗炎性能，能使其具有重要的應用價值。目前常利用作用于炎癥通路或特定酶的小分子藥物來實現抗炎作用，通過生長因子促進軟骨細胞分泌細胞外基質來實現表型維持，然而從組織工程或再生醫學角度出發，如何構建功能化支架以實現抗炎功效的同時增強軟骨細胞維持表型的能力顯得尤為重要[8-9]。已有研究表明，中藥有效成分可作為一種重要調控因子調控細胞的生理過程，更因其長效、穩定、多靶點作用等優點可應用于炎癥的治療且效果顯著[10-11]。其中，穿心蓮內酯作為一種中藥有效成分，具有在炎癥環境下可抑制軟骨細胞中能降解細胞外基質的基質金屬蛋白酶分泌的功能，并可促進正常環境下軟骨細胞的細胞外基質分泌[12-13]。因此，本文將穿心蓮內酯與膠原復合制成緩釋支架，使用 10 ng/mL 的 IL-1β 培養液誘導軟骨細胞產生炎癥反應來模擬體內的炎癥環境。然后通過研究模擬炎癥環境下，不同藥物濃度的膠原緩釋支架對軟骨細胞形貌及表型相關基因轉錄的影響，探索軟骨組織工程臨床轉化過程中可能因患處炎癥微環境導致再生修復失敗的解決方法，并為深入理解炎癥環境對軟骨細胞表型的影響機制和改良組織工程可降解支架材料的設計以增強炎癥環境下的軟骨細胞維持其特有表型的能力提供參考。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器設備
1.1.1 主要試劑
I 型膠原（collagen I, COL I）（基因型為 COL I）、IL-1β、糖原、異丙醇、引物等購自生工生物工程（上海）股份有限公司；熒光素二乙酸（fluorescein diacetate, FDA）購自上海翊圣生物科技有限公司；穿心蓮內酯（結構式如圖 1 所示）、氯仿購自上海阿拉丁生化科技有限公司；醋酸、丙酮購自國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇購自天津市富宇精細化工有限公司；二甲基亞砜（dimethylsulfoxide, DMSO）購自美國 Genview 公司；新西蘭兔（一周齡）購自中南大學湘雅三醫院動物實驗中心；達爾伯克改良伊格爾培養基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）（高糖）培養基、0.2 mL 離心管等購自美國 Thermo 公司；胎牛血清購自美國 Gibco 公司；胰蛋白酶、雙抗（青霉素和鏈霉素）、氯仿苯酚異戊醇混合液、聚丙烯酰胺、酶標板等購自北京鼎國生物技術有限公司；阿爾瑪藍（Alamar Blue）、Trizol 試劑、逆轉錄酶購自美國 Invitrogen 公司；核糖核酸酶 A（RNase A）、RNA 逆轉錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser）購自日本 Takara 公司；脫氧核糖核酸酶 I（DNase I）、DNA 標記（DNA Marker）、Tag DNA 聚合酶購自加拿大 Fermentas 公司；熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）預混液購自康為公司；瓊脂糖購自法國 Biowest 公司；細胞培養皿、24 孔細胞培養板購自德國 Greiner bio-one 公司；0.2 mL 八排 PCR 管、1.5 mL 離心管購自美國 Axygen 公司。
圖1
穿心蓮內酯分子結構
Figure1.
Structure of andrographolide
1.1.2 主要儀器設備
倒置熒光顯微鏡（IX2-1LL100，OLYMPUS，日本），真空冷凍干燥機（GLZ-1，上海浦東冷凍干燥設備有限公司），冷凍離心機（MICRO 17R，Thermo，美國），冷凍離心機（MULTIFUGE C1R，Thermo，美國），集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S，鞏義市予華儀器有限責任公司），紫外可見分光光度計（UV-2600，UNICO，美國），微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo，美國），酶標儀（MK3，Thermo，美國），生物安全柜（HF-1200，上海力申科學儀器有限公司），凝膠成像系統（Tanon 2500R，上海天能科技有限公司），實時熒光定量 PCR 儀（CFX96，Bio-Rad，美國），真密度儀（JW-M100A，北京精微高博科學技術有限公司），環境掃描電子顯微鏡（environmental scanning electron microscope, ESEM）（FEI QUANTA 200，捷克，捷克），石蠟切片機（RM2245，LEICA，德國）。
1.2 方法
1.2.1 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架的制備
將穿心蓮內酯粉末溶于 DMSO 溶劑中，分別制備濃度為 0、8、40、200 μg/μL 的穿心蓮內酯 DMSO 溶液。將 COL I 溶于 3% 醋酸溶液中，磁力攪拌使其充分溶解，1 500 r/min 條件下離心 10 min 除去氣泡，制備出質量分數為 9 mg/mL 的膠原溶液。向膠原溶液中加入不同濃度穿心蓮內酯 DMSO 溶液，通過磁力攪拌和離心處理后制備出穿心蓮內酯質量分數為 0%、0.088%、0.44%、2.22% 的穿心蓮內酯膠原溶液，將穿心蓮內酯膠原溶液以每孔 0.5 mL 加入 24 孔板中，–10℃ 條件下預凍 24 h 后冷凍干燥 24 h。對所制備的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架采用環氧乙烷滅菌處理后備用。
1.2.2 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架性能表征
將載穿心蓮內酯膠原緩釋支架噴金處理后采用 ESEM（FEI QUANTA 200，捷克，捷克）對支架形貌進行表征，并通過圖像處理軟件 Image J Launcher（National Institutes of Health，美國）隨機測量 100 個孔的直徑，以計算膠原支架的平均孔徑大小[14]。
采用真密度儀（JW-M100A，北京精微高博科學技術有限公司）測試載穿心蓮內酯膠原緩釋支架的開孔率。首先稱量樣品質量 m，測量樣品的尺寸并計算其視體積 v，然后將樣品放入樣品杯中，利用真密度儀測量樣品的真密度 ρ真，最后計算出樣品的開孔率，如式（1）所示：
|
公式中 ρ視 為視密度，ρ視 = m/v。
1.2.3 溶液配制
雙抗：100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素；
常規培養液：1% 雙抗 + 10% 胎牛血清 + 100% DMEM（高糖）培養基（體積分數）；
炎癥培養液：含有 10 ng/mL IL-1β 的常規培養液；
磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline, PBS）溶液：8 g/L NaCl + 0.2 g/L KCl + 1.44 g/L Na2HP04 + 0.24 g/L KH2P04；
乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）溶液：7.4 g EDTA 粉末均勻混于 1 L 二重蒸餾水中；
消化液：0.25 g 胰蛋白酶粉末 + 200 μL EDTA 溶液 + 100 mL PBS 溶液；
Alamar Blue 反應液：5%Alamar Blue + 100% 常規培養液（體積分數）；
FDA 反應液：0.1% 5 mg/mL 的 FDA 丙酮溶液 + 100% DMEM（高糖）培養基（體積分數）；
0.15% II 型膠原酶（collagenase II）溶液：0.15 g collagenase II 溶于 100 mL DMEM（高糖）培養基。
1.2.4 軟骨細胞分離與培養
將一周齡的雄性新西蘭兔處死，在無菌環境下取出四肢的關節軟骨，將軟骨切成 1～3 mm3大小，用體積分數為 1% 雙抗的 PBS 溶液清洗 3 次后移入無菌離心管中，向離心管中加入適量 0.15% collagenase II 溶液，37℃ 下對軟骨進行消化處理，每隔 4 h 收集細胞，共收集兩次。收集到的消化液經 200 目篩過濾后于 1 000 r/min 條件下離心 5 min 使細胞沉淀，重懸計數后以 1.5 × 106 個/皿接種于培養皿中，加入常規培養液，置于培養箱中培養，常規培養液每隔 1 d 進行更換。
1.2.5 軟骨細胞與載穿心蓮內酯膠原緩釋支架于炎癥環境下共培養
采用消化液對軟骨細胞進行脫壁處理，加入常規培養液將細胞懸液濃度調整為 2.5 × 105 個/mL，吸取 400 μL 細胞懸液滴加于每個載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上，培養 6 h 待細胞黏附后加入常規培養液繼續培養。常規培養液培養 3 d 使軟骨細胞保持正常生長活性，然后將常規培養液更換為炎癥培養液模擬炎癥環境，繼續培養 7 d。
1.2.6 軟骨細胞增殖率
采用 Alamar Blue 方法檢測軟骨細胞在載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上的增殖率。當細胞在材料上培養 1、3、5、7、10 d 后，移除孔內原液體，每孔加入 1 mL Alamar Blue 反應液，置于培養箱培養 6 h 后每孔取 100 μL Alamar Blue 反應液于酶標板中檢測其在 570 nm 和 630 nm 波長處的吸光值。第 1 d 采用常規培養液其他時間采用炎癥培養液替換孔板中剩余的反應液，繼續培養。
細胞增殖率實驗中，軟骨細胞分組情況如下：
① 陰性對照組：空白孔（無細胞）的 Alamar Blue 反應液；
② C0 組：軟骨細胞在質量分數為 0% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養 1、3、5、7、10 d；
③ C1 組：軟骨細胞在質量分數為 0.088% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養 1、3、5、7、10 d；
④ C2 組：軟骨細胞在質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養 1、3、5、7、10 d；
⑤ C3 組：軟骨細胞在質量分數為 2.22% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養 1、3、5、7、10 d。
細胞還原率（reduced, R）（以符號 Rv表示），定義為具有氧化性的 Alamar Blue 被細胞中線粒體酶還原為還原產物的程度，表達式如式（2）所示：
|
'/> |
其中：
（εred, λ1）=155 677[還原態時 Alamar Blue 的摩爾消光系數（570 nm）]；
（εred, λ2）=5 494[還原態時 Alamar Blue 的摩爾消光系數（630 nm）]；
（εox, λ2）=80 586[氧化態時 Alamar Blue 的摩爾消光系數（630 nm）]；
Aλ1=測試孔吸光度（570 nm）；
Aλ2=測試孔吸光度（630 nm）；
A′λ1=陰性對照組吸光度（570 nm）；
A′λ2=陰性對照組吸光度（630 nm）。
為更好地比較不同濃度載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對細胞增殖的影響，以第 1 d 測得的還原率作為基準值進行歸一化處理，將其余時間點測得的還原率除以該基準值，即得到相應的細胞增殖率。
1.2.7 軟骨細胞形貌
通過活細胞熒光示蹤探針 FDA 染色觀察載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上軟骨細胞的形貌。取出軟骨細胞/載穿心蓮內酯膠原緩釋支架復合物，移除孔內原液體后用 37℃ 的 PBS 溶液清洗 3 次，加入 1 mL FDA 反應液，在室溫、避光條件下反應 5 min 后利用 37℃ 的 PBS 溶液清洗 3 次，最后在倒置熒光顯微鏡下觀察軟骨細胞形貌。
軟骨細胞形貌實驗中，細胞分組情況如下：
① D0 正常組：軟骨細胞在質量分數為 0% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 10 d；
② D0 組：軟骨細胞在質量分數為 0% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d；
③ D1 組：軟骨細胞在質量分數為 0.088% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d；
④ D2 組：軟骨細胞在質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d。
1.2.8 軟骨細胞基因轉錄情況
為進一步闡明在 IL-1β 模擬的炎癥環境下，載穿心蓮內酯膠原緩釋支架增強軟骨細胞維持其分化特征的分子生物學機制，本文采用實時定量 PCR（reverse-transcriptase quantitative PCR, RT-qPCR）檢測了軟骨細胞表型相關基因 COLⅠ、II 型膠原（collagen II, COL II）基因（COLⅡ）、 聚集蛋白蛋白聚糖（Aggrecan）基因（Aggrecan）和炎癥相關基因基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-1（MMP-1）基因（MMP-1）、MMP-13 基因（MMP-13）和 MMPs 抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1）基因（TIMP-1）的轉錄情況。將軟骨細胞/載穿心蓮內酯膠原緩釋支架復合物在常規培養液培養 3 d、炎癥培養液培養 7 d 后取出，PBS 溶液清洗后，加入消化液使細胞從支架上脫落，離心收集細胞后，按照試劑說明書，采用 Trizol 裂解細胞并進行 RNA 的純化與逆轉錄，采用 RT-qPCR 檢測基因轉錄情況，RT-qPCR 檢測用的兔基因引物序列如表 1 所示。
表1
兔基因引物序列
Table1.
primer sequences of rabbit genes
RT-qPCR 基因轉錄情況實驗中，細胞分組情況如下：
① D0 組：軟骨細胞在質量分數為 0% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d；
② D1 組：軟骨細胞在質量分數為 0.088% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d；
③ D2 組：軟骨細胞在質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養3 d、炎癥培養液中培養 7 d。
1.2.9 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架藥物釋放
首先采用紫外可見分光光度計（UV-2600，UNICO，美國）進行全波長掃描確定穿心蓮內酯的特征吸收峰為 227 nm 波長處，并建立穿心蓮內酯溶于 PBS 溶液中的藥物濃度標準曲線。將載穿心蓮內酯膠原緩釋支架置于 24 孔板中，每孔加入 1.5 mL PBS 后將孔板置于細胞培養箱中，于 1、3、5、7、9、11、13、15 d 時分別從每孔取出 50 μL，通過微量紫外分光光度計（NanoDrop 2000，Thermo，美國）檢測 227 nm 波長處吸光度，以測定 PBS 溶液中穿心蓮內酯的濃度。
1.3 統計學分析
所有的實驗結果均取 3 組平行樣，實驗數據以平均數 ± 標準差方式表示，通過統計分析軟件 SPSS 10.0（IBM，美國）處理，P < 0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 膠原支架微觀形貌
三維多孔支架可以為細胞的黏附、遷移、增殖等生理活動提供一個仿生的三維空間環境，對維持軟骨細胞的表型具有重要影響。載穿心蓮內酯膠原緩釋支架的 ESEM 形貌圖如圖 2 所示，可以看出膠原支架通孔性良好，孔徑大小均勻，平均孔徑為（120.7 ± 17.8）μm，通過真密度儀測得的支架開孔率達 96%，形成連通多孔的三維空間微環境，滿足軟骨組織工程支架孔徑大小和開孔率的要求。
圖2
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架 ESEM 形貌圖
Figure2.
ESEM images of andrographolide-releasing collagen scaffold
2.2 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞增殖的影響
緩釋支架中活性因子成分的濃度高低直接決定了緩釋過程中細胞培養微環境中活性成分的濃度，進而影響細胞行為，所以首先應確定合適的載藥濃度。本文采用 Alamar Blue 法連續檢測每個支架上軟骨細胞的生長狀況[15]。為充分體現樣品組之間細胞增殖的差異，采取細胞增殖率的方式進行比較。將質量分數為 0%、0.088%、0.44%、2.22% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上培養的軟骨細胞分別命名為 C0 組、C1 組、C2 組和 C3 組。不同濃度載藥支架上軟骨細胞在常規培養液培養 3 d，炎癥培養液培養 7 d 期間的細胞增殖率如圖 3 所示。相比純膠原支架，載藥濃度最高時，即質量分數為 2.22 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上的軟骨細胞增殖率明顯下降，而其他載藥支架對軟骨細胞增殖無明顯影響，表明高濃度穿心蓮內酯可抑制軟骨細胞增殖，這與文獻報道的結果一致[13]。因此本文將針對質量分數為 0.088 % 和 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架開展進一步的研究。
圖3
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞增殖的影響（n=3）
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2.3 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞形貌的影響
通過熒光示蹤探針 FDA 染色法觀察載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上軟骨細胞的形貌，研究載藥支架對軟骨細胞表型的影響。將質量分數為 0%、0.088% 和 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d 的軟骨細胞分別命名為 D0 組、D1 組和 D2 組；使用不含穿心蓮內酯的膠原支架，在常規培養液中培養 10 d 的軟骨細胞視為正常形貌，并命名為 D0 正常組，各組細胞形貌如圖 4 所示，相比 D0 正常組上細胞形貌類似圓形且尺寸較小，D0 組細胞在支架上均勻分布，但細胞形狀呈細長形，表現出軟骨細胞去分化的典型特征，表明 IL-1β 模擬的炎癥環境會促使軟骨細胞去分化[3]。然而相比 D0 組，D1 組上的軟骨細胞形狀細長接近 D0 組細胞的形貌，且細胞偽足相較 D0 組更細長。但該現象（即 IL-1β 促使軟骨細胞形貌發生改變）在質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架（D2 組）上得到有效的抑制，軟骨細胞形態趨于圓形，細胞尺寸變小，接近 D0 正常組細胞的形貌，表明質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可增強 IL-1β 模擬的炎癥環境下的軟骨細胞維持其特有形貌的能力。
圖4
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上軟骨細胞 FDA 染色
Figure4.
FDA staining of chondrocytes cultured on andrographolide-releasing collagen scaffold
2.4 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞基因轉錄水平的影響
Aggrecan、COL II 是軟骨細胞外基質的主要成分[16-17]，COL II/COL I 的比值被視為軟骨細胞去分化程度的標志，隨著軟骨細胞去分化程度的加深，COL II/COL I 比值逐漸下降[18-19]。MMP 高表達將引起軟骨細胞外基質的降解，MMP 和 MMP 抑制劑 TIMP-1 表達的失衡被認為是骨關節炎導致軟骨缺損的一個主要原因[20-21]。將質量分數為 0%、0.088% 和 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上于常規培養液中培養 3 d、炎癥培養液中培養 7 d 的軟骨細胞分別命名為 D0 組、D1 組和 D2 組。各組軟骨細胞相關基因轉錄情況如圖 5 所示。相比于純膠原支架，質量分數為 0.088% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可抑制軟骨細胞內不利于維持表型的基因 MMP-1、MMP-13、COL I 的轉錄，同時也抑制軟骨細胞轉錄中有利于維持表型的基因 COL II。而質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可極大促進 Aggrecan、COL II、COL I、TIMP-1 的轉錄，也抑制不利維持軟骨細胞表型的 MMP-1、MMP-13 的轉錄，且 COL II/COL I 的比值是純膠原支架上的 12 倍，表明該載藥濃度的載藥膠原支架極大增強了 IL-1β 模擬的炎癥環境下軟骨細胞維持其表型的能力，這與熒光染色結果一致。這些分子生物學上的數據可以進一步確認載藥支架表現出抗炎效果，并闡明合適載藥量的膠原支架增強軟骨細胞抵抗炎癥，維持分化表型的機制。
圖5
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架上軟骨細胞基因轉錄情況（n=3）
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2.5 載穿心蓮內酯膠原緩釋支架體外藥物釋放
在 IL-1β 模擬的炎癥環境下，質量分數為 0.44% 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可增強軟骨細胞維持表型的能力，而穿心蓮內酯的濃度對軟骨細胞影響很大，因而本文進一步檢測該支架的藥物釋放行為。結果如圖 6 所示，藥物釋放 1 d 后在 PBS 溶液中穿心蓮內酯濃度為 9 mg/L，7 d 后藥物釋放速度逐漸減緩，15 d 時藥物釋放量達到最大值 15.35 mg/L，表明質量分數為 0.44 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可在兩周內持續釋放穿心蓮內酯，且無明顯突釋現象。
圖6
載穿心蓮內酯膠原緩釋支架藥物釋放曲線
Figure6.
The profile of andrographolide releasing from andrographolide-releasing collagen scaffold
3 討論
由創傷、關節炎惡化等引起的關節軟骨缺損已成為臨床上亟待解決的難題之一，采用組織工程和再生醫學修復軟骨缺損促進軟骨再生已取得一系列進展[22-23]，然而由于關節軟骨缺損往往伴隨著急慢性炎癥，面對炎癥的威脅，體外構建的工程化軟骨植入體內仍面臨后期退化導致修復失敗[3]，其中最主要的原因是軟骨細胞在炎癥環境下極易失去其特有表型進而喪失功能，主要表現為細胞尺寸變大，細胞形貌逐漸由圓形、多邊形變為纖維狀，軟骨基質相關蛋白表達降低，非軟骨基質的蛋白表達水平升高，比如 COL II 分泌量逐漸降低而 COL I 分泌量逐漸升高[18]。
在組織工程中，支架具有重要的作用，合適的孔徑結構可以給軟骨細胞提供生長與細胞外基質分泌所需的空間，更重要的是可以通過賦予組織工程支架長效的抗炎性能，給軟骨組織再生提供一個適宜的環境，因此構建具有長效抗炎性能進而增強炎癥環境下軟骨細胞維持其特有表型的能力的功能化支架對軟骨組織損傷修復具有重要的研究意義與應用價值。通過將具有抗炎效果和促軟骨細胞表型維持的藥物分子載入支架是一個有效的解決方案。穿心蓮內酯作為一種中藥有效成分，具有長效穩定的性能，同時具有良好的抗炎效果。研究顯示，穿心蓮內酯可抑制二維炎癥環境下的軟骨細胞炎性因子的分泌，促進二維正常環境下軟骨細胞增殖和細胞外基質分泌。因此，將穿心蓮內酯引入組織工程或再生醫學支架中，研究其對 IL-1β 模擬的炎癥環境下軟骨細胞表型維持的作用具有重要意義。
支架的孔隙結構和開孔率對細胞的黏附、遷移、增殖等生命活動具有重要作用，對于軟骨組織工程支架，合適的孔徑范圍約為 75～150 μm[24-25]。本研究所制備的膠原支架具有良好的連通結構，孔徑大小約 120 μm，其開孔率可達 96%，可為軟骨細胞提供一個良好的三維生長環境和營養物質、代謝廢物輸送通道。
細胞增殖對軟骨組織的構建具有重要作用，從本研究可以看出，高濃度載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可顯著抑制軟骨細胞增殖，合適載藥濃度的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架對軟骨細胞增殖無明顯影響。本文的數據表明，在 IL-1β 模擬的炎癥環境下，純膠原支架上的軟骨細胞形貌變得細長，本文構建的體外炎癥環境和體內的炎癥環境一樣可以使軟骨細胞退分化，失去正常的軟骨形貌。使用質量分數為 0.44 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架培養軟骨細胞時，軟骨細胞呈現出正常環境下常見的圓形形貌，表明在炎癥環境下質量分數為 0.44 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架有利于軟骨細胞維持其表型。為進一步闡明炎癥環境下該支架利于軟骨細胞維持其表型的機制，本文探索了軟骨細胞內與維持軟骨細胞表型相關基因的轉錄水平。對比純膠原支架組，質量分數為 0.44 % 的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可顯著促進軟骨細胞表型維持相關基因 COL II、Aggrecan 的轉錄，且 COL II/COL I 的比值為對照組的 12 倍，同時降低炎癥因子 MMP-1、MMP-13 的轉錄水平，表明該緩釋支架具有促進軟骨細胞表型維持與抗炎的作用。綜合以上結果表明，合適載藥濃度的載穿心蓮內酯膠原緩釋支架可增強炎癥環境下的軟骨細胞維持其表型的能力，有望成為軟骨組織工程或再生醫學治療軟骨缺損過程中因炎癥導致修復失敗的有效解決方法。
