非小細胞肺癌（NSCLC）約占肺癌的 80% 以上，吉西他濱聯合順鉑已成為目前治療 NSCLC 的一線化療方案。本研究旨在探討 18氟-氟代脫氧葡萄糖（18F-FDG）和 18氟-氟代脫氧胸腺嘧啶（18F-FLT）的小動物正電子（microPET）顯像早期監測吉西他濱聯合順鉑治療 NSCLC 療效的價值。以荷 Lewis 肺癌的 C57BL/6 小鼠作為動物模型，實驗組給予吉西他濱加順鉑聯合化療，對照組給予等量生理鹽水處理。分別在治療前和治療后第 3 天進行 18F-FDG 和 18F-FLT 的 microPET 顯像，觀察實驗組及對照組動物腫瘤體積及 18F-FDG、18F-FLT 攝取的變化。顯像結束后處死部分小鼠，取腫瘤組織進行蘇木精-伊紅（HE）染色及抗原 Ki67 免疫組化染色。與對照組相比，實驗組的腫瘤生長明顯受到抑制（P<0.05）。在實驗組中，18F-FLT 的最大標準化攝取值（SUVmax）從治療前的 0.59±0.05 下降至治療后第 3 天的 0.28±0.05，結果顯示差異具有統計學意義（P<0.05），而 18F-FDG 的 SUVmax 從治療前的 4.35±0.46 下降至治療后第 3 天的 4.02±0.47，結果顯示差異不具有統計學意義（P>0.05）。組織學結果顯示，在采用吉西他濱加順鉑治療后，腫瘤增殖指標抗原 Ki67 出現明顯下降（P<0.05）。HE 染色提示化療后腫瘤組織中有較多壞死細胞及炎性細胞。本研究結果提示，18F-FLT 比 18F-FDG 能夠更早期監測吉西他濱聯合順鉑治療 NSCLC 的效果；此外，18F-FLT 受化療后腫瘤組織中的炎癥反應干擾更小。
引用本文： 邢巖, 王甜甜, 郭李磊, 孫娜, 趙晉華. 18氟-氟代脫氧葡萄糖與 18氟-氟代胸腺嘧啶用于吉西他濱聯合順鉑治療非小細胞肺癌動物模型的早期療效監測比較 . 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(3): 409-414. doi: 10.7507/1001-5515.201610011 復制
引言
肺癌的病死率位居全世界惡性腫瘤之首[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占原發性肺癌的 80% 以上，大部分患者確診時已屬無法手術切除的局部晚期或者已出現遠處轉移；即使診斷為早期肺癌，也有 50% 以上的患者會出現術后轉移；因此大部分的 NSCLC 患者需要接受化療。吉西他濱聯合順鉑已經成為治療 NSCLC 患者的一線化療方案[2]。然而在臨床應用中，吉西他濱加順鉑聯合化療也只對一部分患者有治療效果。此外，腫瘤的生物學行為差異極大，同種類型腫瘤的不同個體，甚至同一個體的不同階段，對同樣的化療藥物敏感性也有所不同。因此，早期評價療效可以幫助臨床醫生制定個體化治療方案，避免不必要的藥物毒性及經濟上的浪費。
腫瘤療效評估普遍采用以腫瘤形態學變化為基礎的實體瘤療效評估標準（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST），然而腫瘤對治療的反應包含了一系列生物學變化過程，形態上的變化明顯滯后于功能代謝的變化。正電子發射斷層顯像（positron emission tomography，PET）作為一種無創性功能成像模式，已被用于腫瘤療效評價，尤其是治療后的早期評價。目前臨床應用最廣泛的 PET 顯像劑是 18 氟-氟代脫氧葡萄糖（18F-fluorode-oxyglucose，18F-FDG），18F-FDG 主要反映葡萄糖代謝水平，其缺點在于非腫瘤特異性，在炎癥組織中也會有 18F-FDG 的高攝取[3]。作為胸腺嘧啶類似物，18 氟-氟代胸腺嘧啶（18F-fluorothymidine，18F-FLT）的 PET 顯像可以反映活體內細胞增殖情況。在一些臨床前期研究中，18F-FLT PET 就被用于監測治療后的腫瘤細胞增殖變化。然而這些研究的結論不盡相同，部分研究結果顯示 18F-FLT PET 能夠早期監測腫瘤治療后的細胞增殖情況；另一些研究顯示盡管腫瘤對治療有良好反應，但腫瘤對 18F-FLT 的攝取卻沒有明顯變化[4-8]。在本文中，我們模擬臨床化療方案對 NSCLC 動物模型進行吉西他濱聯合順鉑治療，比較 18F-FDG 和 18F-FLT 兩種 PET 顯像劑在早期監測化療療效方面的價值；以期在臨床實踐中，應用 PET 顯像早期監測吉西他濱聯合順鉑治療 NSCLC 患者的療效。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑
回旋加速器（MINI trace，美國 GE 公司）；多功能合成儀（TRACERlab FX-Fn，美國 GE 公司）；小動物 PET 儀（Inveon，德國 Siemens 公司）；洛斯維帕克紀念所 1640（Roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶（美國 Gibco 公司）；兔抗鼠 Ki67 多克隆抗體（英國 Abcam 公司）；順鉑（山東齊魯制藥廠）；吉西他濱（譽捷，哈爾濱譽衡藥業有限公司）；叔丁氧羰基（t-Butyloxy carbonyl，BOC）前體、碳酸鉀、乙腈、乙醇、乙酸鈉、氨基聚醚 2.2.2（Kryptofix 2.2.2）均購自常熟華益化工有限公司。
1.2 細胞與動物模型
鼠肺腺癌細胞株 Lewis 細胞購自南京凱基生物科技發展有限公司，采用 RPMI 1640 細胞培養基（含 10% 胎牛血清、50 μg/mL 青霉素、50 μg/mL 鏈霉素）置于 37℃、5% CO2 孵箱中培養。C57BL/6 小鼠（雌性，4～6 周齡，體重 18～22 g）購于揚州大學比較醫學中心，按無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級標準飼養于上海市第一人民醫院實驗動物中心層流架內，恒溫（20～26℃）、恒濕（50%～65%），進食飲水自由。收集對數生長期 Lewis 肺癌細胞，取細胞數 2.5×107 個/mL 接種 0.2 mL 于小鼠右前肢皮下，每天測量并記錄腫瘤大小（腫瘤體積=0.52×長×寬2）。當腫瘤體積達到大于 300 mm3 時開始進行實驗分組。
1.3 動物分組及處理
將 36 只荷瘤小鼠隨機分為實驗組和對照組，各組又隨機分為 18F-FLT 和 18F-FDG 組，每組 9 只。實驗組給予吉西他濱+順鉑聯合化療，腹腔注射吉西他濱，按 50 mg/kg 給藥，體積約 0.5～0.7 mL；注射吉西他濱 4 h 后腹腔注射順鉑，按 6 mg/kg 給藥，體積約 0.5～0.7 mL。對照組小鼠腹腔注射同等體積的生理鹽水。在治療前和治療后第 3 天，分別對實驗組和對照組進行 18F-FDG 以及 18F-FLT 小動物 PET 顯像；每次顯像結束后分別取實驗組和對照組中 3 只小鼠處死，取腫瘤組織進行病理分析。對剩余的荷瘤小鼠，繼續每天測量并記錄腫瘤大小，一直觀測到治療后第7天，根據腫瘤大小繪制腫瘤生長曲線。
1.4 18F-FDG 及 18F-FLT 小動物 PET 顯像及圖像處理
顯像劑來源：18F-FLT 由本院正電子藥物中心利用前體物質 3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-（4，4’-二甲氧基三苯甲基）-2’-脫氧-3’-O-（4-硝基苯磺酰基-β-1）-蘇戊呋喃糖]胸腺嘧啶脫氧核苷（N-BOC-FLT）合成，合成方法參照文獻[9]。產率約 15%，放化純度>90%。18F-FDG 來自日常臨床所用，購于上海原子高科有限公司。
小動物 PET 顯像：① 18F-FDG 顯像：荷瘤小鼠需空腹 6 h 上，經尾靜脈注射 18F-FDG 100～200 μCi；注射顯像劑 40～50 min 后，以 2% 異氟烷氣體吸入麻醉，固定在 PET 掃描架上，進行 PET 掃描 20 min。② 18F-FLT 顯像：荷瘤小鼠無需空腹，尾靜脈注射 18F-FLT 100～200 μCi，注射顯像劑 50～60 min 后，以 2% 異氟烷氣體吸入麻醉，固定在 PET 掃描架上，進行 PET 掃描 20 min。所有顯像結果均使用圖像采集軟件（Inveon Acquisition Workplace，德國 Siemens 公司）和圖像分析軟件（ASIPro VM，德國 Siemens 公司）進行圖像處理。通過沿腫瘤邊緣勾畫感興趣區（regions of inte-rest，ROIs）后由計算機自動計算腫瘤的最大標準化攝取值（maximal standardized uptake value，SUVmax）。
1.5 病理學檢查
取腫瘤組織后進行固定、包埋及石蠟切片，并進行蘇木精-伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色和抗原 Ki67 染色，于光學顯微鏡下觀察各組切片的 HE 染色結果及抗原 Ki67 免疫組化染色結果并攝像。Ki67 陽性染色表現為細胞核染成棕褐色或棕黃色，高倍鏡下觀察 5 個視野（左上、右上、左下、右下及中間），采用定量法計算 Ki67 陽染細胞占總腫瘤細胞數的百分比。
1.6 統計學分析
結果以均數±標準差表示，采用繪制醫學圖表軟件 GraphPad Prism 5 行統計分析，實驗組與對照組荷瘤小鼠的腫瘤體積采用獨立樣本 t 檢驗。不同時間 18F-FDG 和 18F-FLT 攝取及兩組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 吉西他濱加順鉑聯合化療對腫瘤生長的抑制
如圖 1 所示，治療前實驗組和對照組小鼠的腫瘤體積差異無統計學意義，在治療后的 7 天中，對照組的腫瘤體積隨時間延長呈持續上升，而實驗組的腫瘤體積沒有明顯增長。從治療后第 4 天開始，實驗組和對照組的腫瘤體積出現了差異，差異具有統計學意義（P<0.05），對照組的腫瘤體積從治療前的（365.67±35.83）mm3 上升至治療后第7天的（1 677.3±181.01）mm3，而實驗組腫瘤體積從治療前的（368.50±26.99）mm3上升至治療后第 7 天的（408.17±26.58）mm3。
圖1
實驗組與對照組的腫瘤生長曲線 * P<0.05，實驗組 vs. 對照組
Figure1.
Tumor growth curve of treated group and control group * P<0.05, treated group vs. control group
2.2 18F-FDG 和 18F-FLT 顯像結果
如圖 2、圖 3 所示，治療前實驗組和對照組小鼠的腫瘤部位均可見 18F-FDG 和 18F-FLT 攝取，腫瘤部位以虛線圈出。治療前，實驗組腫瘤的 18F-FDG SUVmax 為 4.35±0.46，對照組小鼠腫瘤的 18F-FDG SUVmax 為 4.43±0.21，結果顯示差異不具有統計學意義（P>0.05）。治療前，實驗組腫瘤的 18F-FLT SUV-max 為 0.59±0.05，對照組小鼠腫瘤的 18F-FLT SUV-max 為 0.51±0.06，結果顯示差異不具有統計學意義（P>0.05）。無論是實驗組還是對照組，治療前腫瘤的 18F-FDG SUVmax 大約是 18F-FLT SUVmax 的 7～8 倍。
圖2
實驗組和對照組的 18F-FDG PET 顯像 *為治療后第 3 天，實驗組與對照組比較，P<0.001
Figure2.
18F-FDG PET imaging of treated group and control group *, P<0.001, treated group vs. control group on day 3
圖3
實驗組和對照組的 18F-FLT PET 顯像 #P<0.05，治療后第 3 天，實驗組與治療前比較；*P<0.001，治療后第 3 天，實驗組與對照組比較
Figure3.
18F-FLT PET imaging of treated group and control group #P<0.05, treated group vs. baseline on day 3; *P<0.001, treated group vs. control group on day 3
在吉西他濱聯合順鉑治療后第 3 天，實驗組小鼠腫瘤的 18F-FDG 攝取明顯低于對照組，結果顯示差異具有統計學意義（P<0.001）。而與治療前 PET 結果相比，實驗組小鼠腫瘤對 18F-FDG 的攝取差異不具有統計學意義（P>0.05）。另一方面，治療后第 3 天，實驗組小鼠腫瘤對 18F-FLT 的攝取明顯低于對照組，結果顯示差異具有統計學意義（P<0.001）；而且與治療前相比，實驗組腫瘤對 18F-FLT 的攝取明顯低于治療前的基線水平，結果顯示差異具有統計學意義（P<0.05）。
2.3 病理檢查結果
抗原 Ki67 免疫組化染色結果顯示，經過吉西他濱聯合順鉑治療后第 3 天，腫瘤組織中的 Ki67 染色就出現了明顯下降，Ki67 陽性細胞百分比明顯低于治療前的基線水平，結果顯示差異具有統計學意義（P<0.05）。而HE染色結果顯示，經過吉西他濱聯合順鉑治療后，腫瘤組織中出現了大量的炎性細胞和壞死細胞，結果如圖 4 所示。
圖4
腫瘤組織的病理學結果（×20） *P<0.05，治療后第 3 天實驗組與對照組比較
Figure4.
Histopathologic results of tumor xenografts（×20） *P<0.05, treated group vs. control group on day 3
3 討論
對腫瘤進行早期準確的療效監測可以使患者避免接受不必要的治療，因此具有重要的臨床意義。PET 顯像能夠無創、動態地顯示機體內生理代謝狀況，并且早于實體腫瘤體積的變化，更適合早期評價腫瘤的治療效果。PET 顯像示蹤劑種類繁多，可以反映腫瘤的葡萄糖代謝、氨基酸和蛋白質合成、核苷代謝、氧代謝、乙酸鹽代謝及膽堿代謝等不同生理變化。近年來，已有眾多國內外研究者應用 18F-FDG 和 18F-FLT 這兩種 PET 顯像劑對不同種類的腫瘤進行診斷和療效評估[10-11]。
18F-FDG 是主要反映腫瘤細胞葡萄糖代謝水平的 PET 顯像劑，被廣泛應用于肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、食管癌等多種腫瘤的診斷及鑒別診斷、分期及臨床預后評估，但一些炎性病變也可以不同程度攝取 18F-FDG，容易造成假陽性結果。在化療早期，腫瘤部位會出現炎性細胞，大量攝取 18F-FDG，從而嚴重影響 18F-FDG 對化療早期效果的真實評價。
作為一種胸腺嘧啶的類似物，18F-FLT 能夠和胸腺嘧啶一樣進入細胞并摻入 DNA。18F-FLT 在細胞質內的胸腺嘧啶核苷激酶 1（thymidine kinase 1，TK1）作用下發生磷酸化，生成 18F-FLT-磷酸鹽。由于 3’-端氟原子的交換，18F-FLT-磷酸鹽不能進一步參與 DNA 的合成，也不能通過細胞膜返回組織液而滯留在細胞內，從而可以進行 PET 顯像。TK1 是細胞 DNA 補救合成過程中的關鍵酶，存在于增殖細胞的 S 期和 G1 期，在靜止期細胞中無酶活性。腫瘤細胞在增殖過程中，DNA 合成增加從而對核苷類底物的利用增加，使得在腫瘤增殖細胞 G1 期后期和 S 期 TK1 的活性達到最大。18F-FLT 通過反映 TK1 活性而反映細胞的增殖狀況，提高了對腫瘤細胞早期化療評估的準確度[12-13]。抗原 Ki67 是一種與細胞增殖密切相關的蛋白，其表達從細胞周期 G1 后期開始出現，至 M 期達到高峰，在有絲分裂結束后迅速降解，而 G0 和 G1 期細胞不表達，因此 Ki67 相對于其他增殖指標如增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），更能全面反映增殖細胞的數量。
在本研究中，我們應用 18F-FDG 和 18F-FLT 兩種不同的 PET 顯像劑，在動物體內實時、無創地監測了經過吉西他濱加順鉑聯合治療后，NSCLC 的早期葡萄糖代謝及細胞增殖的變化情況。結果顯示，吉西他濱聯合順鉑化療能夠明顯抑制 Lewis 腫瘤的生長。在治療后第 3 天，腫瘤對 18F-FLT 和 18F-FDG 的攝取較治療前的基線水平均有不同程度的下降，相比之下，18F-FDG 下降的差異不明顯，而 18F-FLT 下降的差異具有統計學意義。免疫組化染色結果進一步證實，經過吉西他濱聯合順鉑治療后，腫瘤組織中的增殖標志物 Ki67 較治療前有明顯下降，說明 18F-FLT 用于評估腫瘤早期反應的效果優于 18F-FDG ，這與其他研究結果一致[14-16]。
本研究另一個發現是，治療前 NSCLC 腫瘤對 18F-FDG 的攝取大約為 18F-FLT 的 7～8 倍，這一結果也與其他研究報道的 18F-FDG 在探測 NSCLC 方面的敏感性優于 18F-FLT 是一致的[17]。有研究者猜測，這可能是因為在 NSCLC 腫瘤中葡萄糖代謝活躍的細胞比增殖的細胞數目多[18]。除此之外，本文的局限性主要有以下三點：首先，我們沒有評估腫瘤對顯像劑攝取的早期改變與荷瘤動物的腫瘤長期抑制是否有關。其次，本研究只觀察了 NSCLC 腫瘤在化療后第 3 天對 18F-FLT 和 18F-FDG 兩種不同顯像劑的攝取，尚不能判斷 18F-FDG 能在化療后多長時間準確評估吉西他濱聯合順鉑的療效，在今后的研究中，還需要延長治療后天數進行再次顯像，進一步證實 18F-FDG 判斷療效的適當時機。第三點，本研究是臨床前期的基礎研究，還需要進一步轉化為臨床應用。
綜上所述，18F-FDG 與 18F-FLT PET 均可用于吉西他濱聯合順鉑治療 NSCLC 的療效評價，但作為與腫瘤增殖相關的顯像劑，18F-FLT 對化療早期療效評估的準確性高于 18F-FDG。18F-FLT 可以及時反映機體內腫瘤細胞增殖的變化水平，不容易受化療后腫瘤局部炎癥反應的影響，在今后的臨床應用中可以指導臨床醫生及時調整治療方案。
引言
肺癌的病死率位居全世界惡性腫瘤之首[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占原發性肺癌的 80% 以上，大部分患者確診時已屬無法手術切除的局部晚期或者已出現遠處轉移；即使診斷為早期肺癌，也有 50% 以上的患者會出現術后轉移；因此大部分的 NSCLC 患者需要接受化療。吉西他濱聯合順鉑已經成為治療 NSCLC 患者的一線化療方案[2]。然而在臨床應用中，吉西他濱加順鉑聯合化療也只對一部分患者有治療效果。此外，腫瘤的生物學行為差異極大，同種類型腫瘤的不同個體，甚至同一個體的不同階段，對同樣的化療藥物敏感性也有所不同。因此，早期評價療效可以幫助臨床醫生制定個體化治療方案，避免不必要的藥物毒性及經濟上的浪費。
腫瘤療效評估普遍采用以腫瘤形態學變化為基礎的實體瘤療效評估標準（response evaluation criteria in solid tumors，RECIST），然而腫瘤對治療的反應包含了一系列生物學變化過程，形態上的變化明顯滯后于功能代謝的變化。正電子發射斷層顯像（positron emission tomography，PET）作為一種無創性功能成像模式，已被用于腫瘤療效評價，尤其是治療后的早期評價。目前臨床應用最廣泛的 PET 顯像劑是 18 氟-氟代脫氧葡萄糖（18F-fluorode-oxyglucose，18F-FDG），18F-FDG 主要反映葡萄糖代謝水平，其缺點在于非腫瘤特異性，在炎癥組織中也會有 18F-FDG 的高攝取[3]。作為胸腺嘧啶類似物，18 氟-氟代胸腺嘧啶（18F-fluorothymidine，18F-FLT）的 PET 顯像可以反映活體內細胞增殖情況。在一些臨床前期研究中，18F-FLT PET 就被用于監測治療后的腫瘤細胞增殖變化。然而這些研究的結論不盡相同，部分研究結果顯示 18F-FLT PET 能夠早期監測腫瘤治療后的細胞增殖情況；另一些研究顯示盡管腫瘤對治療有良好反應，但腫瘤對 18F-FLT 的攝取卻沒有明顯變化[4-8]。在本文中，我們模擬臨床化療方案對 NSCLC 動物模型進行吉西他濱聯合順鉑治療，比較 18F-FDG 和 18F-FLT 兩種 PET 顯像劑在早期監測化療療效方面的價值；以期在臨床實踐中，應用 PET 顯像早期監測吉西他濱聯合順鉑治療 NSCLC 患者的療效。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑
回旋加速器（MINI trace，美國 GE 公司）；多功能合成儀（TRACERlab FX-Fn，美國 GE 公司）；小動物 PET 儀（Inveon，德國 Siemens 公司）；洛斯維帕克紀念所 1640（Roswell park memorial institute 1640，RPMI 1640）培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶（美國 Gibco 公司）；兔抗鼠 Ki67 多克隆抗體（英國 Abcam 公司）；順鉑（山東齊魯制藥廠）；吉西他濱（譽捷，哈爾濱譽衡藥業有限公司）；叔丁氧羰基（t-Butyloxy carbonyl，BOC）前體、碳酸鉀、乙腈、乙醇、乙酸鈉、氨基聚醚 2.2.2（Kryptofix 2.2.2）均購自常熟華益化工有限公司。
1.2 細胞與動物模型
鼠肺腺癌細胞株 Lewis 細胞購自南京凱基生物科技發展有限公司，采用 RPMI 1640 細胞培養基（含 10% 胎牛血清、50 μg/mL 青霉素、50 μg/mL 鏈霉素）置于 37℃、5% CO2 孵箱中培養。C57BL/6 小鼠（雌性，4～6 周齡，體重 18～22 g）購于揚州大學比較醫學中心，按無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級標準飼養于上海市第一人民醫院實驗動物中心層流架內，恒溫（20～26℃）、恒濕（50%～65%），進食飲水自由。收集對數生長期 Lewis 肺癌細胞，取細胞數 2.5×107 個/mL 接種 0.2 mL 于小鼠右前肢皮下，每天測量并記錄腫瘤大小（腫瘤體積=0.52×長×寬2）。當腫瘤體積達到大于 300 mm3 時開始進行實驗分組。
1.3 動物分組及處理
將 36 只荷瘤小鼠隨機分為實驗組和對照組，各組又隨機分為 18F-FLT 和 18F-FDG 組，每組 9 只。實驗組給予吉西他濱+順鉑聯合化療，腹腔注射吉西他濱，按 50 mg/kg 給藥，體積約 0.5～0.7 mL；注射吉西他濱 4 h 后腹腔注射順鉑，按 6 mg/kg 給藥，體積約 0.5～0.7 mL。對照組小鼠腹腔注射同等體積的生理鹽水。在治療前和治療后第 3 天，分別對實驗組和對照組進行 18F-FDG 以及 18F-FLT 小動物 PET 顯像；每次顯像結束后分別取實驗組和對照組中 3 只小鼠處死，取腫瘤組織進行病理分析。對剩余的荷瘤小鼠，繼續每天測量并記錄腫瘤大小，一直觀測到治療后第7天，根據腫瘤大小繪制腫瘤生長曲線。
1.4 18F-FDG 及 18F-FLT 小動物 PET 顯像及圖像處理
顯像劑來源：18F-FLT 由本院正電子藥物中心利用前體物質 3-N-t-叔丁氧羰基-1-[5’-O-（4，4’-二甲氧基三苯甲基）-2’-脫氧-3’-O-（4-硝基苯磺酰基-β-1）-蘇戊呋喃糖]胸腺嘧啶脫氧核苷（N-BOC-FLT）合成，合成方法參照文獻[9]。產率約 15%，放化純度>90%。18F-FDG 來自日常臨床所用，購于上海原子高科有限公司。
小動物 PET 顯像：① 18F-FDG 顯像：荷瘤小鼠需空腹 6 h 上，經尾靜脈注射 18F-FDG 100～200 μCi；注射顯像劑 40～50 min 后，以 2% 異氟烷氣體吸入麻醉，固定在 PET 掃描架上，進行 PET 掃描 20 min。② 18F-FLT 顯像：荷瘤小鼠無需空腹，尾靜脈注射 18F-FLT 100～200 μCi，注射顯像劑 50～60 min 后，以 2% 異氟烷氣體吸入麻醉，固定在 PET 掃描架上，進行 PET 掃描 20 min。所有顯像結果均使用圖像采集軟件（Inveon Acquisition Workplace，德國 Siemens 公司）和圖像分析軟件（ASIPro VM，德國 Siemens 公司）進行圖像處理。通過沿腫瘤邊緣勾畫感興趣區（regions of inte-rest，ROIs）后由計算機自動計算腫瘤的最大標準化攝取值（maximal standardized uptake value，SUVmax）。
1.5 病理學檢查
取腫瘤組織后進行固定、包埋及石蠟切片，并進行蘇木精-伊紅（Hematoxylin and eosin，HE）染色和抗原 Ki67 染色，于光學顯微鏡下觀察各組切片的 HE 染色結果及抗原 Ki67 免疫組化染色結果并攝像。Ki67 陽性染色表現為細胞核染成棕褐色或棕黃色，高倍鏡下觀察 5 個視野（左上、右上、左下、右下及中間），采用定量法計算 Ki67 陽染細胞占總腫瘤細胞數的百分比。
1.6 統計學分析
結果以均數±標準差表示，采用繪制醫學圖表軟件 GraphPad Prism 5 行統計分析，實驗組與對照組荷瘤小鼠的腫瘤體積采用獨立樣本 t 檢驗。不同時間 18F-FDG 和 18F-FLT 攝取及兩組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 為差異具有統計學意義。
2 結果
2.1 吉西他濱加順鉑聯合化療對腫瘤生長的抑制
如圖 1 所示，治療前實驗組和對照組小鼠的腫瘤體積差異無統計學意義，在治療后的 7 天中，對照組的腫瘤體積隨時間延長呈持續上升，而實驗組的腫瘤體積沒有明顯增長。從治療后第 4 天開始，實驗組和對照組的腫瘤體積出現了差異，差異具有統計學意義（P<0.05），對照組的腫瘤體積從治療前的（365.67±35.83）mm3 上升至治療后第7天的（1 677.3±181.01）mm3，而實驗組腫瘤體積從治療前的（368.50±26.99）mm3上升至治療后第 7 天的（408.17±26.58）mm3。
圖1
實驗組與對照組的腫瘤生長曲線 * P<0.05，實驗組 vs. 對照組
Figure1.
Tumor growth curve of treated group and control group * P<0.05, treated group vs. control group
2.2 18F-FDG 和 18F-FLT 顯像結果
如圖 2、圖 3 所示，治療前實驗組和對照組小鼠的腫瘤部位均可見 18F-FDG 和 18F-FLT 攝取，腫瘤部位以虛線圈出。治療前，實驗組腫瘤的 18F-FDG SUVmax 為 4.35±0.46，對照組小鼠腫瘤的 18F-FDG SUVmax 為 4.43±0.21，結果顯示差異不具有統計學意義（P>0.05）。治療前，實驗組腫瘤的 18F-FLT SUV-max 為 0.59±0.05，對照組小鼠腫瘤的 18F-FLT SUV-max 為 0.51±0.06，結果顯示差異不具有統計學意義（P>0.05）。無論是實驗組還是對照組，治療前腫瘤的 18F-FDG SUVmax 大約是 18F-FLT SUVmax 的 7～8 倍。
圖2
實驗組和對照組的 18F-FDG PET 顯像 *為治療后第 3 天，實驗組與對照組比較，P<0.001
Figure2.
18F-FDG PET imaging of treated group and control group *, P<0.001, treated group vs. control group on day 3
圖3
實驗組和對照組的 18F-FLT PET 顯像 #P<0.05，治療后第 3 天，實驗組與治療前比較；*P<0.001，治療后第 3 天，實驗組與對照組比較
Figure3.
18F-FLT PET imaging of treated group and control group #P<0.05, treated group vs. baseline on day 3; *P<0.001, treated group vs. control group on day 3
在吉西他濱聯合順鉑治療后第 3 天，實驗組小鼠腫瘤的 18F-FDG 攝取明顯低于對照組，結果顯示差異具有統計學意義（P<0.001）。而與治療前 PET 結果相比，實驗組小鼠腫瘤對 18F-FDG 的攝取差異不具有統計學意義（P>0.05）。另一方面，治療后第 3 天，實驗組小鼠腫瘤對 18F-FLT 的攝取明顯低于對照組，結果顯示差異具有統計學意義（P<0.001）；而且與治療前相比，實驗組腫瘤對 18F-FLT 的攝取明顯低于治療前的基線水平，結果顯示差異具有統計學意義（P<0.05）。
2.3 病理檢查結果
抗原 Ki67 免疫組化染色結果顯示，經過吉西他濱聯合順鉑治療后第 3 天，腫瘤組織中的 Ki67 染色就出現了明顯下降，Ki67 陽性細胞百分比明顯低于治療前的基線水平，結果顯示差異具有統計學意義（P<0.05）。而HE染色結果顯示，經過吉西他濱聯合順鉑治療后，腫瘤組織中出現了大量的炎性細胞和壞死細胞，結果如圖 4 所示。
圖4
腫瘤組織的病理學結果（×20） *P<0.05，治療后第 3 天實驗組與對照組比較
Figure4.
Histopathologic results of tumor xenografts（×20） *P<0.05, treated group vs. control group on day 3
3 討論
對腫瘤進行早期準確的療效監測可以使患者避免接受不必要的治療，因此具有重要的臨床意義。PET 顯像能夠無創、動態地顯示機體內生理代謝狀況，并且早于實體腫瘤體積的變化，更適合早期評價腫瘤的治療效果。PET 顯像示蹤劑種類繁多，可以反映腫瘤的葡萄糖代謝、氨基酸和蛋白質合成、核苷代謝、氧代謝、乙酸鹽代謝及膽堿代謝等不同生理變化。近年來，已有眾多國內外研究者應用 18F-FDG 和 18F-FLT 這兩種 PET 顯像劑對不同種類的腫瘤進行診斷和療效評估[10-11]。
18F-FDG 是主要反映腫瘤細胞葡萄糖代謝水平的 PET 顯像劑，被廣泛應用于肺癌、乳腺癌、淋巴瘤、食管癌等多種腫瘤的診斷及鑒別診斷、分期及臨床預后評估，但一些炎性病變也可以不同程度攝取 18F-FDG，容易造成假陽性結果。在化療早期，腫瘤部位會出現炎性細胞，大量攝取 18F-FDG，從而嚴重影響 18F-FDG 對化療早期效果的真實評價。
作為一種胸腺嘧啶的類似物，18F-FLT 能夠和胸腺嘧啶一樣進入細胞并摻入 DNA。18F-FLT 在細胞質內的胸腺嘧啶核苷激酶 1（thymidine kinase 1，TK1）作用下發生磷酸化，生成 18F-FLT-磷酸鹽。由于 3’-端氟原子的交換，18F-FLT-磷酸鹽不能進一步參與 DNA 的合成，也不能通過細胞膜返回組織液而滯留在細胞內，從而可以進行 PET 顯像。TK1 是細胞 DNA 補救合成過程中的關鍵酶，存在于增殖細胞的 S 期和 G1 期，在靜止期細胞中無酶活性。腫瘤細胞在增殖過程中，DNA 合成增加從而對核苷類底物的利用增加，使得在腫瘤增殖細胞 G1 期后期和 S 期 TK1 的活性達到最大。18F-FLT 通過反映 TK1 活性而反映細胞的增殖狀況，提高了對腫瘤細胞早期化療評估的準確度[12-13]。抗原 Ki67 是一種與細胞增殖密切相關的蛋白，其表達從細胞周期 G1 后期開始出現，至 M 期達到高峰，在有絲分裂結束后迅速降解，而 G0 和 G1 期細胞不表達，因此 Ki67 相對于其他增殖指標如增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），更能全面反映增殖細胞的數量。
在本研究中，我們應用 18F-FDG 和 18F-FLT 兩種不同的 PET 顯像劑，在動物體內實時、無創地監測了經過吉西他濱加順鉑聯合治療后，NSCLC 的早期葡萄糖代謝及細胞增殖的變化情況。結果顯示，吉西他濱聯合順鉑化療能夠明顯抑制 Lewis 腫瘤的生長。在治療后第 3 天，腫瘤對 18F-FLT 和 18F-FDG 的攝取較治療前的基線水平均有不同程度的下降，相比之下，18F-FDG 下降的差異不明顯，而 18F-FLT 下降的差異具有統計學意義。免疫組化染色結果進一步證實，經過吉西他濱聯合順鉑治療后，腫瘤組織中的增殖標志物 Ki67 較治療前有明顯下降，說明 18F-FLT 用于評估腫瘤早期反應的效果優于 18F-FDG ，這與其他研究結果一致[14-16]。
本研究另一個發現是，治療前 NSCLC 腫瘤對 18F-FDG 的攝取大約為 18F-FLT 的 7～8 倍，這一結果也與其他研究報道的 18F-FDG 在探測 NSCLC 方面的敏感性優于 18F-FLT 是一致的[17]。有研究者猜測，這可能是因為在 NSCLC 腫瘤中葡萄糖代謝活躍的細胞比增殖的細胞數目多[18]。除此之外，本文的局限性主要有以下三點：首先，我們沒有評估腫瘤對顯像劑攝取的早期改變與荷瘤動物的腫瘤長期抑制是否有關。其次，本研究只觀察了 NSCLC 腫瘤在化療后第 3 天對 18F-FLT 和 18F-FDG 兩種不同顯像劑的攝取，尚不能判斷 18F-FDG 能在化療后多長時間準確評估吉西他濱聯合順鉑的療效，在今后的研究中，還需要延長治療后天數進行再次顯像，進一步證實 18F-FDG 判斷療效的適當時機。第三點，本研究是臨床前期的基礎研究，還需要進一步轉化為臨床應用。
綜上所述，18F-FDG 與 18F-FLT PET 均可用于吉西他濱聯合順鉑治療 NSCLC 的療效評價，但作為與腫瘤增殖相關的顯像劑，18F-FLT 對化療早期療效評估的準確性高于 18F-FDG。18F-FLT 可以及時反映機體內腫瘤細胞增殖的變化水平，不容易受化療后腫瘤局部炎癥反應的影響，在今后的臨床應用中可以指導臨床醫生及時調整治療方案。
