腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）與肝癌等腫瘤發生、發展有關。然而這方面的研究大都是基于體外細胞實驗或小鼠移植瘤模型開展的。本文介紹一個運用白蛋白啟動子驅動 Cre（Alb-Cre）轉基因，通過基因重組技術成功構建基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre 的轉基因小鼠模型，肝臟特異表達的 Cre 重組酶在轉基因小鼠中實現對肝臟 AMPKα1 特異性高效敲除。肝臟 AMPKα1 敲除后不影響小鼠的生長、繁殖及肝臟的結構。肝臟特異敲除 AMPKα1 小鼠模型的成功構建，為實現在動物整體水平對 AMPK 與肝臟代謝或肝癌的發生、發展的關系等方面的研究提供了基礎。
引用本文： 唐興鴻, 孔慶斌, 蔣揚富, 敬靜. 肝臟特異敲除腺苷酸活化蛋白激酶小鼠模型的建立. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(3): 415-420. doi: 10.7507/1001-5515.201703025 復制
引言
肝癌是我國的常見惡性腫瘤，其發病機制、防治策略均是重要的研究方向[1]。“能量感受器”腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）由催化亞基 α 和調節亞基 β、γ 組成。根據編碼基因的不同，α 亞基有 α1、α2 兩種，β 亞基可分為 β1 和 β2，而 γ 亞基存在 γ1、γ2、γ3 三種形式[2]。AMPK 是維持細胞內能量穩態的一個重要分子開關，當胞內能量消耗大于能量供給，AMP/ATP 比值上升，AMPK 則被激活，活化的 AMPK 直接或間接作用于下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物 1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）、乙酰輔酶 A 羧化酶 1/2（acetyl-CoA carboxylase，ACC1/2）等，關閉耗能的合成代謝信號通路，與此同時 AMPK 還能夠激活過氧化物酶體增殖物活化受體 γ 協同刺激因子 1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC1α）、6-磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2同工酶3（phosphofructokinase-2/fructose-2，6-bispho-sphatase 3，PFKFB3）等，從而促進產能的分解代謝信號通路，通過參與上述能量調控過程，AMPK 可以精確調控細胞的生長、凋亡等[3]。
肝臟是體內重要的代謝器官，糖、脂代謝紊亂與腫瘤的發生發展有關[4]。研究報道，腫瘤細胞中脂肪酸合成增加，活化的 AMPK 可以抑制與脂代謝相關的一系列酶的活性，如脂肪酸合成酶、乙酰輔酶 A 羧化酶、羥甲基戊二酸單酰輔酶 A 等，從而抑制腫瘤的發生及生長[5]。糖酵解是腫瘤細胞主要的產能方式，腫瘤抑制基因P53通過上調 P53 誘導的糖酵解和凋亡調節子（P53 induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR），引起 2、6-二磷酸果糖水平的降低，抑制糖酵解[6]。AMPK 可通過調控 P53 減少糖分解中間體的利用，減少腫瘤細胞的能量來源，進而抑制腫瘤細胞的生長[7]。盡管 AMPK 曾被認為是腫瘤抑制因子，但也有研究提示其也具有促腫瘤作用，也就是說 AMPK 可能在不同類型或遺傳背景腫瘤、腫瘤發展不同階段以及不同的腫瘤微環境中發揮不同甚至相反的作用[8]。
目前有關 AMPK 與腫瘤發生、發展之間關系的研究大都是基于體外細胞實驗或小鼠移植瘤模型開展的，這對于說明 AMPK 在腫瘤發生發展中的作用有一定意義，但也有局限性。因此，很有必要結合 AMPK 敲除動物模型研究 AMPK 在腫瘤發生、發展中的作用。基于 Cre-LoxP 重組酶系統的基因敲除技術是建立條件性基因敲除動物模型的經典技術，其原理是 Cre 重組酶與限制性內切酶相似，具有位點特異性，能識別特異的 DNA 序列即 loxP 位點，使 loxP 位點間的基因序列被刪除或重組，達到基因敲除的目的[9]。如果將 Cre 重組酶表達限定在特定器官中，則能實現器官特異性基因敲除。通過將 Cre 片段插入在肝臟特異性表達的白蛋白（albumin, Alb）啟動子之后，可實現肝臟特異性表達 Cre 重組酶。Cre-LoxP 重組酶系統因其高效的剪切效率在構建轉基因動物模型方面得到廣泛應用。本文報道一個應用 Cre-LoxP 重組酶系統建立的肝臟特異敲除 AMPKα1 小鼠模型。本研究所用 AMP-Kα1fl/fl 小鼠是野生型 C57BL/6 品系小鼠經基因工程改造而得到，AMPKα1fl/fl 小鼠基因組中 AMPKα1 基因 3 號外顯子兩側具有 LoxP 位點，該位點可被 Cre 重組酶識別，將 Cre 重組酶表達限制在肝臟表達就能夠對 LoxP 位點間的 3 號外顯子進行剪切，從而實現對 AMPKα1 的肝臟特異性敲除。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
AMPKα1fl/fl 和 Alb-Cre 單基因型小鼠均為 C57BL/6 品系。AMPKα1fl/fl 小鼠購自 Jackson Laboratory（Prkaa1tm1.1Sjm/J，Stock No：014141），白蛋白啟動子驅動 Cre 轉基因（Alb-Cre）小鼠由四川大學生物治療國家重點實驗室神經分子生物學研究室肖波教授饋贈。
1.2 小鼠飼養與繁殖
按照 SPF 級動物飼養標準在四川大學華西科技園實驗動物中心進行飼養。室內溫度 21～25℃，相對濕度 50%～60%，每日光照 12 h，小鼠飼料、飲水、墊料均經高溫高壓滅菌處理。肝臟特異性 AMPKα1 基因敲除可通過 AMPKα1 基因被 Alb-Cre 重組酶在 AMPKα1 的 3 號外顯子上剪切而實現。取 8 周齡的 AMPKα1fl/fl 雌鼠與 Alb-Cre 雄鼠交配。經多次交配和篩選，獲得 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型的小鼠。之后將 AMPKα1fl/fl 型和 AMPKα1-/--Alb-Cre 型互相交配將得到穩定的 AMP-Kα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 兩種基因型小鼠。
1.3 主要試劑
Taq PCR 預混液、瓊脂糖購自成都擎科梓熙生物技術有限公司（Cat TSE004、Cat 16031105），AMPKα1 抗體、磷酸化 ACC 抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司（Cat 2795S，Cat 3661S），β-Actin 抗體、磷酸化 S6 抗體購自成都正能生物技術有限責任公司（Cat 200068-8F10，Cat 310090），ECL 發光液購自碧云天生物技術公司（Cat P0018）。
1.4 肝臟特異敲除AMPK小鼠模型的建立
1.4.1 小鼠基因型鑒定 小鼠出生后 3 周斷奶，耳號標記并分籠。無菌剪刀取小鼠尾約 0.5 cm，加入 75 μL Buffer A （25 mmol/L NaOH 和 0.2 mmol/L EDTA）置于 PCR 儀中 98℃ 加熱 1 h 后冷卻至室溫，然后加入 75 μL Buffer B（40 mmol/L Tris-HCl pH 5.5），混勻并離心（4 000 r/min，3 min），吸取 2 μL 上清用于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）鑒定。
用于 PCR 的 AMPKα1/AMPKα1-LoxP 與 Cre 引物序列見表 1。以下反應物構成 20 μL 反應體系：Taq PCR 預混液 10 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，模板 NDA 1 μL，ddH2O 7 μL，共 20 μL。PCR 反應條件如下：94℃ 預變性 3 min，94℃ 變性 20 s，65℃ 退火 25 s，68℃ 延伸 20 s，10 個循環，每個循環降 0.5℃，94℃ 變性 20 s，60℃ 退火 25 s，72℃ 延伸 20 s，28 個循環，72℃ 總延伸 3 min，12℃ 維持。PCR 擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行小鼠基因型鑒定。制備 1% 瓊脂糖凝膠，取 PCR 反應終產物 10 μL 進行電泳。電泳后使用凝膠成像系統進行電泳圖片分析。
表1
小鼠基因型鑒定PCR引物序列
Table1.
Genotyping primer sequences of mice
1.4.2 小鼠肝臟病理學檢查 隨機選取 8 周齡的 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 小鼠各三只，稱重后頸椎脫臼處死，迅速完整取出肝臟，稱重，同時觀察肝臟大小、色澤、質地。取適量肝臟組織石蠟包埋，伊紅-蘇木素（hematoxylin-eosin, HE）染色。HE 染色步驟如下：二甲苯脫蠟 2 次，10 min/次，梯度酒精脫水，10 min/梯度，PBS 緩沖液清洗 3 次，5 min/次，顯微鏡下伊紅、蘇木素染色，細胞質和細胞核著色后立即終止反應，自來水沖洗反藍 5 min，1% 鹽酸酒精分化 10 s，PBS 緩沖液清洗 3 次，5 min/次，梯度酒精脫水，5 min/梯度，二甲苯透明 2 次，10 min/次，中性樹脂封片，鏡檢。
1.4.3 蛋白印跡檢測 AMPKα1 蛋白的表達 取適量小鼠肝組織，按 250 mg 組織加入蛋白質抽提試劑 1 mL 提取組織蛋白，以 BCA 分析試劑測定蛋白質濃度。總蛋白質（30 μg）經 10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠 90 V 電泳分離后，電轉移至聚偏氟乙烯膜，260 mA 恒流濕轉 95 min，將膜置于 5%（50 g/L）脫脂牛奶中室溫孵育 1 h，封閉膜上的非特異結合。一抗（1∶1 500）4℃ 孵育過夜。Tris 緩沖液洗膜 3 次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），室溫孵育 1 h，再以 Tris 緩沖液洗膜 3 次，5 min/次，采用同樣方法標記 β-Actin 作為對照。ECL 發光液顯影，采集圖像。
1.5 統計學方法
所有數據采用 Graphpad Prism 5.0 軟件進行統計學分析，數據以均值±標準差表示，兩組間均值的統計比較用非配對 t 檢驗，以 P≤0.05 為差異有統計學意義。
2 實驗結果
2.1 肝臟特異性 AMPKα1 敲除小鼠的獲得與基因型鑒定
2.1.1 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型小鼠的獲得 我們首先采用 F0 代 AMPKα1fl/fl 雌鼠 2 只與 Alb-Cre 雄鼠 1 只交配后得到基因型為 AMPKα1fl/+Alb-Cre 的 F1 代小鼠 15 只。選取 F1 代基因型為 AMPKα1fl/+-Alb-Cre 的雌鼠 2 只與 AMPKα1fl/fl 雄鼠 1 只回交，得到基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre、AMPKα1fl/+-Alb-Cre、AMPKα1fl/fl、AMPKα1fl/+ 的 F2 代小鼠 32 只。在 F2 代小鼠中選擇基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre 的雄鼠 1 只與 AMPKα1fl/fl 雌鼠 2 只自交，得到 F3 代基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre、AMPKα1fl/fl 小鼠 25 只，按此循環交配可得到穩定的基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre 的肝臟特異性 AMPKα1 敲除小鼠（見圖 1）。
圖1
肝臟特異性敲除 AMPKα1 小鼠建立流程圖
Figure1.
Procedure of generating liver-specific AMPKα1 knockout mice
2.1.2 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型小鼠的基因型鑒定 我們通過 PCR 擴增法對小鼠進行基因型鑒定。AMPKα1fl/fl 小鼠基因組序列中 AMPKα1 的 3 號外顯子區被插入了一段 LoxP 序列，因此，通過同時針對 AMPKα1 和 LoxP 區域基因組 DNA 進行特異性擴增，純合 AMPKα1fl/fl 小鼠得到 450 bp 的條帶，而 AMPKα1fl/+ 雜合小鼠則同時具有 334 bp 和 450 bp 兩條帶（334 bp 為 AMPKα1 野生型小鼠表現，結果未列出）；根據上述 PCR 產物大小即可將 AMPKα1fl/fl 型和 AMPKα1fl/+ 型小鼠區分開來。同時，利用針對 Cre 重組酶的特異性引物亦能夠區分是否表達 Alb-Cre 重組酶。如圖 2 所示，25、20 號小鼠在 450 bp 處呈單一條帶，為 AMPKα1fl/fl 純合型小鼠的表現；同時，20 號小鼠在 300 bp（Cre）處有條帶，表明有 Alb-Cre 重組酶表達，故該小鼠基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre，而 25 號小鼠在 300 bp 處無 Cre 條帶，說明該小鼠無 Alb-Cre 重組酶表達，則基因型為 AMPKα1fl/fl。19、12、18、17 號小鼠在 334 bp 和 450 bp 處呈雙條帶，為 AMPKα1fl/+ 雜合型小鼠的表現；同時，19、17 號小鼠在 300 bp 處有 Cre 條帶，故它們的基因型為 AMPKα1fl/+-Alb-Cre，而 12、18 號小鼠無 Cre 條帶，故其基因型為 AMPKα1fl/+。
圖2
瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型
Figure2.
Genotyping and identification of liver-specific AMPKα1 knockout mice by PCR assay
2.2 蛋白印跡驗證 AMPKα1 在 AMPKα1-/--Alb-Cre 型小鼠肝臟中不表達
為進一步驗證在 AMPKα1-/--Alb-Cre 型小鼠中 AMPKα1 確實已被敲除，我們采用蛋白印跡法檢測 AMPKα1fl/fl 組和 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中 AMPKα1 蛋白的表達情況。結果顯示，AMPKα1fl/fl 組小鼠肝組織中存在 AMPKα1 表達，而 AMPKα1-/--Alb-Cre 組肝臟組織中不表達 AMPKα1，進一步驗證了 AMPKα1 在 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中被高效敲除（見圖 3）。此外，我們也檢測了 AMPK 的靶標 ACC 的磷酸化水平以及 mTOR 下游的 S6 磷酸化水平，結果顯示，AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中 ACC 及 S6 磷酸化水平均低于 AMPKα1fl/fl 組（見圖 4）。
圖3
AMPKα1 在 AMPKα1fl/fl 組與 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中的表達 1、3：AMPKα1fl/fl 組小鼠肝臟蛋白；2、4：AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟蛋白
Figure3.
Immunoblotting analysis of AMPKα1 expression of liver lysates from AMPKα1fl/fl or AMPKα1-/--Alb-Cre mice Lane 1 and 3: the liver lysates from AMPKα1fl/fl mice; Lane 2 and 4: the liver lysates from AMPKα1-/--Alb-Cre mice
圖4
AMPKα1fl/fl 組與 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中 ACC、S6 的磷酸化水平
Figure4.
Immunoblotting analysis of the phosphorylation of ACC and S6 in AMPKα1fl/fl or AMPKα1-/--Alb-Cre mice liver
2.3 肝臟特異敲除 AMPKα1 對小鼠繁殖、生長及肝臟組織形態等的影響
AMPKα1 在小鼠肝臟被特異性敲除以后，不影響小鼠的正常生長、繁殖。AMPKα1fl/fl 組小鼠體重為（27.73±1.45）g，AMPKα1-/--Alb-Cre 組為（29.00±1.73）g，兩組間差異無統計學意義（P>0.05）。AMPKα1 敲除后不影響肝臟的生長及結構，AMPKα1fl/fl 組小鼠肝重占體重百分比為 3.72%±0.002 6%，AMPKα1-/--Alb-Cre 組為 4.22%±0.002 9%，二者間差異無統計學意義（P>0.05）。兩組小鼠肝臟表面光滑，呈紅褐色，質地柔軟，未見肉眼可見改變。兩組肝臟切片 HE 染色顯示，肝小葉結構完整、正常，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞索與肝血竇排列規則，未見肝細胞變性、壞死等征像（見圖 5）。
圖5
AMPKα1fl/fl 組與 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟大體觀及 HE 染色光學顯微鏡下表現
Figure5.
Gross and HE staining views of mice liver with gene-type of AMPKα1fl/fl and AMPKα1-/--Alb-Cre
3 討論
能量代謝異常是腫瘤細胞的重要特征之一。作為調控細胞能量穩態的重要分子開關，AMPK 與腫瘤的關系受到廣泛關注，常被認為是腫瘤抑制因子。但是，AMPK 在腫瘤發生、發展過程中的具體功能尚無定論。有研究表明 AMPK 通過磷酸化結節硬化復合物 2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2）抑制 mTORC1 依賴的蛋白合成，以及磷酸化 ACC 抑制脂質合成，從而抑制腫瘤細胞的增殖[10-12]。動物實驗發現小鼠 B 淋巴細胞中特異敲除 AMPKα1 亞基能夠加速 Myc 基因誘導的淋巴瘤形成[13]，但另一項研究卻發現 c-Myc 驅動的腫瘤細胞的生存依賴于 AMPK 活化[14]。最近兩篇關于 AMPK 調節 Hippo 通路中的關鍵因子 YAP（Yes-associated protein）的報道揭示了應激環境影響腫瘤細胞增殖的新機制[15-17]。這表明當腫瘤細胞處于應激狀態時，作為能量感應的分子開關 AMPK 接受環境信號并發出關閉耗能的代謝通路的指令，腫瘤細胞此時將進入一個生長停滯的休眠期，當外界生長環境改善后細胞又將重新恢復增殖。從這個角度看，腫瘤微環境動力學對腫瘤發展影響很大，AMPK 活化亦是一種保護腫瘤細胞存活于逆境的適應機制。
AMPK 作為細胞代謝調控的一個關鍵分子，在腫瘤發生、發展中的作用較為復雜。盡管 AMPK 具有一些抑癌作用，但一些研究一致發現 AMPK 可以促進應激狀態下的癌細胞存活[8, 18-21]。AMPK 的 β1 亞基表達水平降低能夠導致前列腺癌細胞存活能力下降[22]。在雄激素依賴的前列腺癌細胞中，AMPK 通過誘導自噬以增加細胞在應激情況下的存活率[23]，此外，AMPK 還能通過調節還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的水平促進脫離了細胞外基質的癌細胞以及糖剝奪的癌細胞的存活能力[24]。在 BRAF 基因突變的黑色素瘤細胞中，AMPK 介導了癌細胞對 BRAF 抑制劑的耐藥性[25]。AMPK 活化還可削弱血管內皮生長因子抗體的抗癌作用[26]。
事實上，雖然很多基因都被劃分為癌基因或抑癌基因，但在癌癥研究中發現不少“雙面蛋白”，一個典型的例子就是轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。雖然較多研究涉及到 AMPK，但不少是基于直接或間接作用于 AMPK 的小分子或藥物，鑒于這些小分子藥物可能具有 AMPK 之外的靶標，因此其作用是否能歸因于 AMPK 尚存疑問[27-28]。本實驗中，我們采用 Cre-LoxP 重組酶系統實現了 AMPKα1 在小鼠肝臟的特異性敲除。Cre 片段插入在肝臟特異性表達的白蛋白啟動子之后，從而實現肝臟特異性表達 Cre 重組酶及對 AMPKα1 的特異性敲除。我們采用 PCR 擴增法對 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 兩種基因型小鼠進行了鑒定，并采用蛋白印跡法證實了小鼠肝臟 AMPKα1 被敲除。而且，敲除小鼠肝臟 AMPKα1 不影響小鼠的生長、繁殖及肝臟的組織結構。肝臟特異敲除 AMPKα1 小鼠模型的建立為研究 AMPKα1 與肝臟代謝或肝癌發生、發展間的關系等提供了一個理想的動物模型，為實現在動物水平對 AMPK 功能的研究打下了基礎。
引言
肝癌是我國的常見惡性腫瘤，其發病機制、防治策略均是重要的研究方向[1]。“能量感受器”腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）由催化亞基 α 和調節亞基 β、γ 組成。根據編碼基因的不同，α 亞基有 α1、α2 兩種，β 亞基可分為 β1 和 β2，而 γ 亞基存在 γ1、γ2、γ3 三種形式[2]。AMPK 是維持細胞內能量穩態的一個重要分子開關，當胞內能量消耗大于能量供給，AMP/ATP 比值上升，AMPK 則被激活，活化的 AMPK 直接或間接作用于下游的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物 1（mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1）、乙酰輔酶 A 羧化酶 1/2（acetyl-CoA carboxylase，ACC1/2）等，關閉耗能的合成代謝信號通路，與此同時 AMPK 還能夠激活過氧化物酶體增殖物活化受體 γ 協同刺激因子 1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha，PGC1α）、6-磷酸果糖激酶-2/果糖雙磷酸酶-2同工酶3（phosphofructokinase-2/fructose-2，6-bispho-sphatase 3，PFKFB3）等，從而促進產能的分解代謝信號通路，通過參與上述能量調控過程，AMPK 可以精確調控細胞的生長、凋亡等[3]。
肝臟是體內重要的代謝器官，糖、脂代謝紊亂與腫瘤的發生發展有關[4]。研究報道，腫瘤細胞中脂肪酸合成增加，活化的 AMPK 可以抑制與脂代謝相關的一系列酶的活性，如脂肪酸合成酶、乙酰輔酶 A 羧化酶、羥甲基戊二酸單酰輔酶 A 等，從而抑制腫瘤的發生及生長[5]。糖酵解是腫瘤細胞主要的產能方式，腫瘤抑制基因P53通過上調 P53 誘導的糖酵解和凋亡調節子（P53 induced glycolysis and apoptosis regulator，TIGAR），引起 2、6-二磷酸果糖水平的降低，抑制糖酵解[6]。AMPK 可通過調控 P53 減少糖分解中間體的利用，減少腫瘤細胞的能量來源，進而抑制腫瘤細胞的生長[7]。盡管 AMPK 曾被認為是腫瘤抑制因子，但也有研究提示其也具有促腫瘤作用，也就是說 AMPK 可能在不同類型或遺傳背景腫瘤、腫瘤發展不同階段以及不同的腫瘤微環境中發揮不同甚至相反的作用[8]。
目前有關 AMPK 與腫瘤發生、發展之間關系的研究大都是基于體外細胞實驗或小鼠移植瘤模型開展的，這對于說明 AMPK 在腫瘤發生發展中的作用有一定意義，但也有局限性。因此，很有必要結合 AMPK 敲除動物模型研究 AMPK 在腫瘤發生、發展中的作用。基于 Cre-LoxP 重組酶系統的基因敲除技術是建立條件性基因敲除動物模型的經典技術，其原理是 Cre 重組酶與限制性內切酶相似，具有位點特異性，能識別特異的 DNA 序列即 loxP 位點，使 loxP 位點間的基因序列被刪除或重組，達到基因敲除的目的[9]。如果將 Cre 重組酶表達限定在特定器官中，則能實現器官特異性基因敲除。通過將 Cre 片段插入在肝臟特異性表達的白蛋白（albumin, Alb）啟動子之后，可實現肝臟特異性表達 Cre 重組酶。Cre-LoxP 重組酶系統因其高效的剪切效率在構建轉基因動物模型方面得到廣泛應用。本文報道一個應用 Cre-LoxP 重組酶系統建立的肝臟特異敲除 AMPKα1 小鼠模型。本研究所用 AMP-Kα1fl/fl 小鼠是野生型 C57BL/6 品系小鼠經基因工程改造而得到，AMPKα1fl/fl 小鼠基因組中 AMPKα1 基因 3 號外顯子兩側具有 LoxP 位點，該位點可被 Cre 重組酶識別，將 Cre 重組酶表達限制在肝臟表達就能夠對 LoxP 位點間的 3 號外顯子進行剪切，從而實現對 AMPKα1 的肝臟特異性敲除。
1 材料與方法
1.1 實驗動物
AMPKα1fl/fl 和 Alb-Cre 單基因型小鼠均為 C57BL/6 品系。AMPKα1fl/fl 小鼠購自 Jackson Laboratory（Prkaa1tm1.1Sjm/J，Stock No：014141），白蛋白啟動子驅動 Cre 轉基因（Alb-Cre）小鼠由四川大學生物治療國家重點實驗室神經分子生物學研究室肖波教授饋贈。
1.2 小鼠飼養與繁殖
按照 SPF 級動物飼養標準在四川大學華西科技園實驗動物中心進行飼養。室內溫度 21～25℃，相對濕度 50%～60%，每日光照 12 h，小鼠飼料、飲水、墊料均經高溫高壓滅菌處理。肝臟特異性 AMPKα1 基因敲除可通過 AMPKα1 基因被 Alb-Cre 重組酶在 AMPKα1 的 3 號外顯子上剪切而實現。取 8 周齡的 AMPKα1fl/fl 雌鼠與 Alb-Cre 雄鼠交配。經多次交配和篩選，獲得 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型的小鼠。之后將 AMPKα1fl/fl 型和 AMPKα1-/--Alb-Cre 型互相交配將得到穩定的 AMP-Kα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 兩種基因型小鼠。
1.3 主要試劑
Taq PCR 預混液、瓊脂糖購自成都擎科梓熙生物技術有限公司（Cat TSE004、Cat 16031105），AMPKα1 抗體、磷酸化 ACC 抗體購自美國 Cell Signaling Technology 公司（Cat 2795S，Cat 3661S），β-Actin 抗體、磷酸化 S6 抗體購自成都正能生物技術有限責任公司（Cat 200068-8F10，Cat 310090），ECL 發光液購自碧云天生物技術公司（Cat P0018）。
1.4 肝臟特異敲除AMPK小鼠模型的建立
1.4.1 小鼠基因型鑒定 小鼠出生后 3 周斷奶，耳號標記并分籠。無菌剪刀取小鼠尾約 0.5 cm，加入 75 μL Buffer A （25 mmol/L NaOH 和 0.2 mmol/L EDTA）置于 PCR 儀中 98℃ 加熱 1 h 后冷卻至室溫，然后加入 75 μL Buffer B（40 mmol/L Tris-HCl pH 5.5），混勻并離心（4 000 r/min，3 min），吸取 2 μL 上清用于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）鑒定。
用于 PCR 的 AMPKα1/AMPKα1-LoxP 與 Cre 引物序列見表 1。以下反應物構成 20 μL 反應體系：Taq PCR 預混液 10 μL，上游引物（10 μmol/L）1 μL，下游引物（10 μmol/L）1 μL，模板 NDA 1 μL，ddH2O 7 μL，共 20 μL。PCR 反應條件如下：94℃ 預變性 3 min，94℃ 變性 20 s，65℃ 退火 25 s，68℃ 延伸 20 s，10 個循環，每個循環降 0.5℃，94℃ 變性 20 s，60℃ 退火 25 s，72℃ 延伸 20 s，28 個循環，72℃ 總延伸 3 min，12℃ 維持。PCR 擴增后，通過瓊脂糖凝膠電泳進行小鼠基因型鑒定。制備 1% 瓊脂糖凝膠，取 PCR 反應終產物 10 μL 進行電泳。電泳后使用凝膠成像系統進行電泳圖片分析。
表1
小鼠基因型鑒定PCR引物序列
Table1.
Genotyping primer sequences of mice
1.4.2 小鼠肝臟病理學檢查 隨機選取 8 周齡的 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 小鼠各三只，稱重后頸椎脫臼處死，迅速完整取出肝臟，稱重，同時觀察肝臟大小、色澤、質地。取適量肝臟組織石蠟包埋，伊紅-蘇木素（hematoxylin-eosin, HE）染色。HE 染色步驟如下：二甲苯脫蠟 2 次，10 min/次，梯度酒精脫水，10 min/梯度，PBS 緩沖液清洗 3 次，5 min/次，顯微鏡下伊紅、蘇木素染色，細胞質和細胞核著色后立即終止反應，自來水沖洗反藍 5 min，1% 鹽酸酒精分化 10 s，PBS 緩沖液清洗 3 次，5 min/次，梯度酒精脫水，5 min/梯度，二甲苯透明 2 次，10 min/次，中性樹脂封片，鏡檢。
1.4.3 蛋白印跡檢測 AMPKα1 蛋白的表達 取適量小鼠肝組織，按 250 mg 組織加入蛋白質抽提試劑 1 mL 提取組織蛋白，以 BCA 分析試劑測定蛋白質濃度。總蛋白質（30 μg）經 10% SDS 聚丙烯酰胺凝膠 90 V 電泳分離后，電轉移至聚偏氟乙烯膜，260 mA 恒流濕轉 95 min，將膜置于 5%（50 g/L）脫脂牛奶中室溫孵育 1 h，封閉膜上的非特異結合。一抗（1∶1 500）4℃ 孵育過夜。Tris 緩沖液洗膜 3 次，5 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶2 000），室溫孵育 1 h，再以 Tris 緩沖液洗膜 3 次，5 min/次，采用同樣方法標記 β-Actin 作為對照。ECL 發光液顯影，采集圖像。
1.5 統計學方法
所有數據采用 Graphpad Prism 5.0 軟件進行統計學分析，數據以均值±標準差表示，兩組間均值的統計比較用非配對 t 檢驗，以 P≤0.05 為差異有統計學意義。
2 實驗結果
2.1 肝臟特異性 AMPKα1 敲除小鼠的獲得與基因型鑒定
2.1.1 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型小鼠的獲得 我們首先采用 F0 代 AMPKα1fl/fl 雌鼠 2 只與 Alb-Cre 雄鼠 1 只交配后得到基因型為 AMPKα1fl/+Alb-Cre 的 F1 代小鼠 15 只。選取 F1 代基因型為 AMPKα1fl/+-Alb-Cre 的雌鼠 2 只與 AMPKα1fl/fl 雄鼠 1 只回交，得到基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre、AMPKα1fl/+-Alb-Cre、AMPKα1fl/fl、AMPKα1fl/+ 的 F2 代小鼠 32 只。在 F2 代小鼠中選擇基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre 的雄鼠 1 只與 AMPKα1fl/fl 雌鼠 2 只自交，得到 F3 代基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre、AMPKα1fl/fl 小鼠 25 只，按此循環交配可得到穩定的基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre 的肝臟特異性 AMPKα1 敲除小鼠（見圖 1）。
圖1
肝臟特異性敲除 AMPKα1 小鼠建立流程圖
Figure1.
Procedure of generating liver-specific AMPKα1 knockout mice
2.1.2 AMPKα1-/--Alb-Cre 基因型小鼠的基因型鑒定 我們通過 PCR 擴增法對小鼠進行基因型鑒定。AMPKα1fl/fl 小鼠基因組序列中 AMPKα1 的 3 號外顯子區被插入了一段 LoxP 序列，因此，通過同時針對 AMPKα1 和 LoxP 區域基因組 DNA 進行特異性擴增，純合 AMPKα1fl/fl 小鼠得到 450 bp 的條帶，而 AMPKα1fl/+ 雜合小鼠則同時具有 334 bp 和 450 bp 兩條帶（334 bp 為 AMPKα1 野生型小鼠表現，結果未列出）；根據上述 PCR 產物大小即可將 AMPKα1fl/fl 型和 AMPKα1fl/+ 型小鼠區分開來。同時，利用針對 Cre 重組酶的特異性引物亦能夠區分是否表達 Alb-Cre 重組酶。如圖 2 所示，25、20 號小鼠在 450 bp 處呈單一條帶，為 AMPKα1fl/fl 純合型小鼠的表現；同時，20 號小鼠在 300 bp（Cre）處有條帶，表明有 Alb-Cre 重組酶表達，故該小鼠基因型為 AMPKα1-/--Alb-Cre，而 25 號小鼠在 300 bp 處無 Cre 條帶，說明該小鼠無 Alb-Cre 重組酶表達，則基因型為 AMPKα1fl/fl。19、12、18、17 號小鼠在 334 bp 和 450 bp 處呈雙條帶，為 AMPKα1fl/+ 雜合型小鼠的表現；同時，19、17 號小鼠在 300 bp 處有 Cre 條帶，故它們的基因型為 AMPKα1fl/+-Alb-Cre，而 12、18 號小鼠無 Cre 條帶，故其基因型為 AMPKα1fl/+。
圖2
瓊脂糖凝膠電泳鑒定小鼠基因型
Figure2.
Genotyping and identification of liver-specific AMPKα1 knockout mice by PCR assay
2.2 蛋白印跡驗證 AMPKα1 在 AMPKα1-/--Alb-Cre 型小鼠肝臟中不表達
為進一步驗證在 AMPKα1-/--Alb-Cre 型小鼠中 AMPKα1 確實已被敲除，我們采用蛋白印跡法檢測 AMPKα1fl/fl 組和 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中 AMPKα1 蛋白的表達情況。結果顯示，AMPKα1fl/fl 組小鼠肝組織中存在 AMPKα1 表達，而 AMPKα1-/--Alb-Cre 組肝臟組織中不表達 AMPKα1，進一步驗證了 AMPKα1 在 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中被高效敲除（見圖 3）。此外，我們也檢測了 AMPK 的靶標 ACC 的磷酸化水平以及 mTOR 下游的 S6 磷酸化水平，結果顯示，AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中 ACC 及 S6 磷酸化水平均低于 AMPKα1fl/fl 組（見圖 4）。
圖3
AMPKα1 在 AMPKα1fl/fl 組與 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中的表達 1、3：AMPKα1fl/fl 組小鼠肝臟蛋白；2、4：AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟蛋白
Figure3.
Immunoblotting analysis of AMPKα1 expression of liver lysates from AMPKα1fl/fl or AMPKα1-/--Alb-Cre mice Lane 1 and 3: the liver lysates from AMPKα1fl/fl mice; Lane 2 and 4: the liver lysates from AMPKα1-/--Alb-Cre mice
圖4
AMPKα1fl/fl 組與 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟中 ACC、S6 的磷酸化水平
Figure4.
Immunoblotting analysis of the phosphorylation of ACC and S6 in AMPKα1fl/fl or AMPKα1-/--Alb-Cre mice liver
2.3 肝臟特異敲除 AMPKα1 對小鼠繁殖、生長及肝臟組織形態等的影響
AMPKα1 在小鼠肝臟被特異性敲除以后，不影響小鼠的正常生長、繁殖。AMPKα1fl/fl 組小鼠體重為（27.73±1.45）g，AMPKα1-/--Alb-Cre 組為（29.00±1.73）g，兩組間差異無統計學意義（P>0.05）。AMPKα1 敲除后不影響肝臟的生長及結構，AMPKα1fl/fl 組小鼠肝重占體重百分比為 3.72%±0.002 6%，AMPKα1-/--Alb-Cre 組為 4.22%±0.002 9%，二者間差異無統計學意義（P>0.05）。兩組小鼠肝臟表面光滑，呈紅褐色，質地柔軟，未見肉眼可見改變。兩組肝臟切片 HE 染色顯示，肝小葉結構完整、正常，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝細胞索與肝血竇排列規則，未見肝細胞變性、壞死等征像（見圖 5）。
圖5
AMPKα1fl/fl 組與 AMPKα1-/--Alb-Cre 組小鼠肝臟大體觀及 HE 染色光學顯微鏡下表現
Figure5.
Gross and HE staining views of mice liver with gene-type of AMPKα1fl/fl and AMPKα1-/--Alb-Cre
3 討論
能量代謝異常是腫瘤細胞的重要特征之一。作為調控細胞能量穩態的重要分子開關，AMPK 與腫瘤的關系受到廣泛關注，常被認為是腫瘤抑制因子。但是，AMPK 在腫瘤發生、發展過程中的具體功能尚無定論。有研究表明 AMPK 通過磷酸化結節硬化復合物 2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2）抑制 mTORC1 依賴的蛋白合成，以及磷酸化 ACC 抑制脂質合成，從而抑制腫瘤細胞的增殖[10-12]。動物實驗發現小鼠 B 淋巴細胞中特異敲除 AMPKα1 亞基能夠加速 Myc 基因誘導的淋巴瘤形成[13]，但另一項研究卻發現 c-Myc 驅動的腫瘤細胞的生存依賴于 AMPK 活化[14]。最近兩篇關于 AMPK 調節 Hippo 通路中的關鍵因子 YAP（Yes-associated protein）的報道揭示了應激環境影響腫瘤細胞增殖的新機制[15-17]。這表明當腫瘤細胞處于應激狀態時，作為能量感應的分子開關 AMPK 接受環境信號并發出關閉耗能的代謝通路的指令，腫瘤細胞此時將進入一個生長停滯的休眠期，當外界生長環境改善后細胞又將重新恢復增殖。從這個角度看，腫瘤微環境動力學對腫瘤發展影響很大，AMPK 活化亦是一種保護腫瘤細胞存活于逆境的適應機制。
AMPK 作為細胞代謝調控的一個關鍵分子，在腫瘤發生、發展中的作用較為復雜。盡管 AMPK 具有一些抑癌作用，但一些研究一致發現 AMPK 可以促進應激狀態下的癌細胞存活[8, 18-21]。AMPK 的 β1 亞基表達水平降低能夠導致前列腺癌細胞存活能力下降[22]。在雄激素依賴的前列腺癌細胞中，AMPK 通過誘導自噬以增加細胞在應激情況下的存活率[23]，此外，AMPK 還能通過調節還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的水平促進脫離了細胞外基質的癌細胞以及糖剝奪的癌細胞的存活能力[24]。在 BRAF 基因突變的黑色素瘤細胞中，AMPK 介導了癌細胞對 BRAF 抑制劑的耐藥性[25]。AMPK 活化還可削弱血管內皮生長因子抗體的抗癌作用[26]。
事實上，雖然很多基因都被劃分為癌基因或抑癌基因，但在癌癥研究中發現不少“雙面蛋白”，一個典型的例子就是轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）。雖然較多研究涉及到 AMPK，但不少是基于直接或間接作用于 AMPK 的小分子或藥物，鑒于這些小分子藥物可能具有 AMPK 之外的靶標，因此其作用是否能歸因于 AMPK 尚存疑問[27-28]。本實驗中，我們采用 Cre-LoxP 重組酶系統實現了 AMPKα1 在小鼠肝臟的特異性敲除。Cre 片段插入在肝臟特異性表達的白蛋白啟動子之后，從而實現肝臟特異性表達 Cre 重組酶及對 AMPKα1 的特異性敲除。我們采用 PCR 擴增法對 AMPKα1fl/fl 和 AMPKα1-/--Alb-Cre 兩種基因型小鼠進行了鑒定，并采用蛋白印跡法證實了小鼠肝臟 AMPKα1 被敲除。而且，敲除小鼠肝臟 AMPKα1 不影響小鼠的生長、繁殖及肝臟的組織結構。肝臟特異敲除 AMPKα1 小鼠模型的建立為研究 AMPKα1 與肝臟代謝或肝癌發生、發展間的關系等提供了一個理想的動物模型，為實現在動物水平對 AMPK 功能的研究打下了基礎。
