本研究旨在探討 cAMP/Ca2+ 信號通路在紅景天苷誘導骨髓間充質干細胞（BMSCs）向神經元細胞定向分化中的作用機制。將骨髓間充質干細胞株 D1 細胞分為空白對照組和紅景天苷誘導組，空白對照組細胞加入不含藥物的等量 D/F12 完全培養液，誘導組細胞加入含有 100 mg·L–1 紅景天苷的 D/F12 完全培養液分別作用 24、48 和 72 h。運用 RT2 Profiler PCR Array 方法檢測紅景天苷誘導 BMSCs 不同時間后 cAMP/Ca2+ 信號通路中差異表達的基因。實驗表明，紅景天苷分別誘導 BMSCs 24、48 和 72 h 后，與空白對照組比較，表達有差異的基因共 38 個，其中上調基因 23 個，下調基因 15 個，經過篩選上調較顯著的基因有 4 個：DNA 損傷誘導因子 3（Ddit3）、熱休克蛋白 5（Hspa5）、磷酸酶1調節亞單位 15a（Ppp1r15a）、前列腺素內過氧化物合酶（Ptgs2）；下調顯著的基因有 4 個：胰高血糖素（Gcg）、白細胞介素 2（Il2）、腫瘤壞死因子（Tnf）、生長激素抑制素（Sst）。這些基因可能對紅景天苷誘導 BMSCs 向神經元細胞的定向分化具有一定影響。
引用本文： 趙玲, 趙紅斌, 秦文, 李根, 唐俊杰, 王九娜. cAMP/Ca2+ 信號通路在紅景天苷誘導骨髓間充質干細胞向神經元細胞定向分化中的作用和機制 . 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(3): 401-408. doi: 10.7507/1001-5515.201505037 復制
引言
紅景天（Rhodiola）是多年生草本或亞灌木野生植物，因其花、根和莖的浸液都是紅色而得名，素有“高原人參”的美稱，是我國的傳統藏藥。藥理研究表明其主要有效成分紅景天苷（salidroside，SD）具有調節免疫、抗缺氧、降血糖、保護神經細胞、抗氧化、防輻射和保護肝臟等作用[1-2]。課題組前期研究證明，紅景天苷可誘導骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分化為神經元細胞，而 Ca2+/鈣調蛋白（calmodulin，CaM）信號通路在其分化過程中具有一定作用[3]。
實時熒光定量 PCR 是一種檢測基因表達水平的分子生物學技術，它以準確的定量、較好的重現性等優勢，得到了全世界的公認。其基本原理是將熒光染料或熒光探針加入 PCR 反應體系中，由于熒光信號強度與 DNA 產量成正比，因此通過連續監測熒光信號強度的變化便可得到靶序列的初始濃度，由此便可推斷出目的基因的初始量。實時定量 PCR 陣列技術（real-time quantitative PCR array technique，RQ-PCR array）以實時定量 PCR 技術為核心并結合了陣列技術，具有高通量檢測基因表達水平的優勢，能夠準確、可靠地檢測大規模基因的表達，在疾病相關通路的研究中具有重要意義。美國 SABiosciences 公司生產的 RT2 Profiler PCR Array 是 RQ-PCR-array 技術的代表，在研究疾病發生的分子機制和輔助診斷方面具有重要參考意義。本實驗以 cAMP/Ca2+ 信號通路為研究對象，運用 RT2 Profiler PCR Array 方法檢測紅景天苷誘導 BMSCs 不同時間后該信號通路中差異表達的基因，進一步揭示紅景天苷誘導 BMSCs 分化為神經細胞的分子機制。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
小鼠骨髓間充質干細胞 D1 細胞株（序列號 ATCCCRL-12424），購自美國 ATCC 公司。
1.2 實驗儀器
紫外分光光度計（G1115A）購自美國 HP 公司；實時熒光定量 PCR 儀（73000）購自美國 ABI 公司；CO2 細胞培養箱（Forma371）購自美國 Thermo Revco 公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD）購自蘇州蘇潔凈化設備有限公司；臺式高速冷凍離心機（Primo R）購自德國 Heraeus 公司；微量高速離心機（TG16-W）購自湖南儀器儀表總廠興華儀器廠；自動純水蒸餾器（SCD-Ⅱ）購自天津銳馬蘭盾科技有限公司；熒光顯微鏡（倒置1×71）購自日本 OLYMPUS 公司；壓力蒸汽滅菌器（YXP-LS-50A）購自上海博迅實業有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（ZX-GF101-BS2）購自上海躍進醫療器械廠。
1.3 主要試劑
紅景天苷標準品購自中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%；D/F12 培養基購自美國 GIBCO 公司；胎牛血清購自蘭州榮曄生物公司；全反式維甲酸（Retinoids acid，RA）購自美國 Sigma 公司；反轉錄試劑盒（Prime ScriptTM reagentKit、RNeasy Mini Kit 和 RT2 First strand kit）購自德國 QIAGEN 公司。
2 實驗方法
2.1 D1 細胞的培養
用含 10% 胎牛血清的 D/F12 完全培養液常規培養 D1 細胞，每 2～3 天更換一次培養液，待 80% 細胞融合后，用 0.25% 的胰酶對其消化傳代，繼續培養。
2.2 神經細胞標志分子相關基因表達的檢測
實驗分為空白對照組、紅景天苷誘導組和維甲酸誘導組（陽性對照組），分別使用 D/F12 完全培養液、含有 100 mg·L–1 紅景天苷的 D/F12 完全培養液、5 μg·L–1 維甲酸誘導 D1 細胞 12 h，通過凝膠電泳檢測神經細胞標志分子相關基因神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、β 微管蛋白 Ⅲ（β-Tubulin Ⅲ）和微管結合蛋白 2（microtubule- associated protein 2，MAP2）的表達情況。將 1×TAE 電泳緩沖液加至液面覆蓋瓊脂糖凝膠，在超凈工作臺上，吸取總 RNA 樣品 4 μL 于封口膜上。在實驗臺上再加入 5 μL 1×TAE 電泳緩沖液及 1 μL 的 10×載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。打開電源開關，調節電壓至 100 V，使 RNA 由負極向正極電泳，約 30 min 后將凝膠放入 EB 染液中染色 5 min，用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察 RNA 電泳結果，所有實驗重復 3 次。
2.3 cAMP/Ca2+ Signaling PathwayFinder PCR Array 檢測
實驗分為紅景天苷誘導組和空白對照組，誘導組細胞加入含有 100 mg·L–1 紅景天苷的 D/F12 完全培養液，空白對照組細胞加入不含藥物的等量 D/F12 完全培養液，分別作用 D1 細胞 24、48 和 72 h。按照 RNeasy Mini Kit 試劑使用說明提取細胞總 RNA，紫外分光光度計測定 RNA 純度和濃度，采用 G1115A 紫外分光光度計分別測定各組總 RNA 在 260、280、320 nm 波長的 OD 值，并用甲醛變性凝膠電泳做進一步的 RNA 質量檢測。各組總 RNA 純度應符合：OD260/OD280 Ratio 值在 1.8～2.0 之間。取 1 μg 總 RNA，RT2 First Strand Kit 合成 cDNA，反應體系 10 μL，反應條件：42℃，15 min；95℃，5 min；采用熒光定量 PCR-7300 兩步法擴增，反應體系 25 μL，PCR 反應條件：95℃ 預變性 10 min；95℃ 變性 15 s；60℃ 退火 1 min，40 個循環。分別檢測信號通路中相關基因 mRNA 的表達水平，基因的相對表達采用 2–ΔΔct 公式計算，所有實驗重復 3 次。
2.4 統計學分析
凝膠電泳檢測結果使用單因素方差分析進行統計，RT2 Profiler PCR Array 所得數據運用 RT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.5 軟件在線進行分析（http://pcrdataanalysis.sabiosciences. com/pcr/array analysis.php），上調或下調顯著的判定標準為實驗組比對照組表達量≥2 倍。
3 實驗結果
3.1 凝膠電泳檢測結果
紅景天苷誘導 12 h 后，可見在 NSE、β-Tubulin Ⅲ 和 MAP2 mRNA 的表達上（見圖 1），陽性對照組上述基因的表達豐度均低于紅景天苷誘導組，差異具有統計學意義（P<0.01）；而空白對照組未見上述基因的表達。
圖1
不同誘導組中神經相關基因的表達 1：紅景天苷誘導組；2：維甲酸誘導組；3：空白對照組；M：分子量標記。與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與維甲酸誘導組相比，#P<0.05
Figure1.
Expression of neuron related genes in different induced groups 1: salidroside induction group; 2: retinoic acid induction group; 3: control group; M: marker. Compared with the blank control group, *P<0.05, **P<0.01; compared with the retinoic acid induction group, #P<0.05
3.2 PCR Array 檢測結果
將實時熒光定量 PCR 所得數據使用 QIAGEN 公司在線軟件進行分析，24、48、72 h 誘導組分別與對照組比較，誘導后 cAMP/Ca2+ 信號通路中 84 個相關基因的表達情況如表 1 所示。
表1
誘導組與對照組基因表達的比較（n=3）
Table1.
Genes expression of induction groups compared with that of control group (n=3)
與對照組比較，各誘導組基因變化情況如圖 2 所示。其中 24 h 誘導組與空白對照組比較基因變化情況，上調基因有 12 個，下調基因 19 個（上圖）；48 h 誘導組與空白對照組比較基因變化情況，上調基因 17 個，下調基因 12 個（中圖）；72 h 誘導組與空白對照組比較基因變化情況，上調基因 14 個，下調基因 13 個（下圖）。
圖2
24 h、48 h、72 h 誘導組基因變化散點圖Group 1：24 h 誘導組；Group 2：48 h 誘導組；Group 3：72 h 誘導組；Control：空白對照組
Figure2.
Scatter diagram of induction groups compared with that of control group Group 1: 24 h induction group; Group 2: 48 h induction group; Group 3: 72 h induction group; Control: blank control group
綜合以上結果，與對照組比較，誘導組中均表達上調且差異較顯著的基因有 4 個，依次是：DNA 損傷誘導轉錄因子 3（DNA damage-inducible tran-script 3，Ddit3），變化在 20 倍以上；蛋白磷酸酶 1 調節亞單位 15a（protein phosphatase 1 regulatory subunit 15A，Ppp1r15a），變化在 13 倍以上；前列腺素內過氧化物合酶（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，Ptgs2），變化量在 9 倍以上；熱休克蛋白 5（heat shock protein 5，Hspa5），變化量 6 倍以上；其余基因在 2～5 倍之間，見圖 3。
圖3
根據差異倍數篩選的上調、下調基因 與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01
Figure3.
Up-regulated and down-regulated genes according to fold changes Compared with the blank control group, *P<0.05, **P<0.01
誘導組表達下調且差異顯著的基因有 4 個，依次是：胰高血糖素（glucagon，Gcg），變化倍數 8～16 倍；白細胞介素 2（interleukin 2，Il2）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，Tnf），變化倍數 5～10 倍；生長激素抑制素（somatostatin，Sst），變化 5～8 倍，見圖 3。
基因聚類圖顯示（圖 4），Ptgs-2、Ddit3、Hspa5 等基因相關性較強，Gcg、Il2 相關性較強，Sst、Tnf 相關性較強。
圖4
不同時間誘導組與對照組基因變化聚類圖 Group 1：24 h 誘導組；Group 2：48 h 誘導組；Group 3：72 h 誘導組；Control：空白對照組
Figure4.
Cluster analysis of different time induction groups compared with that of control group Group 1: 24 h induction group; Group 2: 48 h induction group; Group 3: 72 h induction group; Control: blank control group
4 討論
紅景天味甘性寒，歸脾、肺經，具有補腎養心、調經活血、明目安神、扶正固本之功效。紅景天苷是紅景天的主要有效成分，研究表明，紅景天苷具有調節免疫、抗缺氧、保護神經細胞、抗氧化等作用[2]。本實驗結果顯示，紅景天能顯著上調神經細胞相關基因 NSE、β-Tubulin Ⅲ 和 MAP2 的 mRNA 表達。NSE 是神經元和神經內分泌細胞所特有的標志分子，在鑒定神經細胞方面具有重要意義。β-Tubulin Ⅲ 是神經分化相關的一種微管蛋白。MAP2 的表達與與神經元的生長和損傷后修復有關。由此可知，紅景天苷可誘導 BMSCs 向神經元樣細胞分化。
細胞分化是指相同類型的細胞在分裂的過程中逐漸形成的在形態、結構和功能上都具有穩定性差異的細胞。其核心是通過基因的調控使細胞內合成了不同的專一蛋白質。
本實驗將紅景天苷作用 D1 細胞不同時間后，對表達差異具有統計學意義的基因進行篩選，涉及到的生物學功能主要包括細胞周期、細胞應激、炎癥反應、DNA 損傷修復等各方面。我們從中挑選出上調較顯著的基因 Ddit3、Hspa5、Ppp1r15a 和 Ptgs-2，以及下調較顯著的基因 Gcg、Il2、Tnf 和 Sst，對其作用機制進行分析研究，以探討 cAMP/Ca2+ 信號通路在紅景天苷誘導 BMSCs 向神經元樣細胞分化中的作用機制。
Ddit3 是內質網應激反應中的多功能轉錄因子，研究顯示，它可上調 Ppp1r15a 基因[4]與內質網氧化還原酶 1（endoplasmic reticulum oxidoreductase 1，EROlα）基因的表達[5]，而后者又可激活磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，IP3R），從而促進大量的 Ca2+ 從內質網轉運至胞質，使胞內 Ca2+ 濃度升高[6]。研究發現內質網應激可上調 Ddit3 的表達[7]，實驗結果表明，Ddit3 在誘導 48 h 時上調較為顯著，說明 Ddit3 在紅景天苷誘導前期對 BMSCs 的神經向分化具有促進作用。
熱休克蛋白是生物界中高度保守的一種蛋白質，細胞在受到某些刺激（如缺氧、高熱、感染、缺血及化學物質等）時，機體在很短的時間內大量合成熱休克蛋白，熱休克蛋白的出現標志著細胞自身保護機制的啟動。熱休克蛋白還具有神經保護作用，許多神經系統疾病如癲癇、阿爾茨海默癥、多發性硬化等，都與熱休克蛋白有關[8]。Hspa5 是熱休克蛋 白70（heat shock protein 70，HSP70）家族的成員之一[9]，該家族包含 21 種蛋白質，它們在進化上保持高度同源性。大體可分為 4 種類型：HSP70、HSC70、GRP78 和 GRP75[10-11]。張霞等[12]實驗研究顯示，熱休克狀態時，小鼠胚胎成纖維細胞中 CaM 和 HSP70 的表達量顯著增加，若阻斷 CaM 則 HSP70 的表達量也降低。Holmberg 等[13]報道，鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 Ⅱ（calmodulin dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）能促使 HeLa 細胞中熱休克因子 1（heat shock factor 1，HSF1）的 Ser230 位點磷酸化，而 HSF1 可在熱休克狀態時被活化，并誘導 HSP70 基因的轉錄[14]。CaMKⅡ 是 Ca2+/CaM 信號下游的一種重要蛋白激酶，可直接被 Ca2+/CaM 激活[15]，并參與乙酰膽堿依賴性鈣離子通道的激活[16]和神經傳導[17]等生理過程。因此，Ca2+ 濃度的增加可激活 HSP70 的表達。實驗顯示，隨著紅景天苷誘導時間的增加，細胞內 Ca2+ 濃度在 48 h 時出現峰值，同樣 HSP70 在 48 h 時表達量最高，結果表明 HSP70 在誘導中起正調控作用，48 h 時較為顯著。
Ppp1r15a，又稱為 GADD34（DNA 損傷誘導蛋白 34）。PP1 是一種細胞周期蛋白，是真核生物中的一種重要的蛋白磷酸酶，參與細胞的生長、分化、轉錄、翻譯等生理過程[18]。PP1 和 CaMKⅡ 是一對去磷酸化與磷酸化蛋白質，它們可直接或間接參與 Ca2+ 及 Ca2+-ATPase 活性的調控[19]。研究表明，內質網應激在腦缺血預處理后引起的神經保護中發揮著重要作用[20]，Ppp1r15a 在實驗中表達升高，說明其對神經分化起正調控作用，48 h 時較顯著。
Ptgs2 又名環氧化酶 2（cyclooxygenase 2，COX-2），是一種重要的炎性介質，參與中樞神經系統多種病理過程，參與炎癥反應、神經元死亡、神經元超興奮性、星形細胞活化，也與細胞增殖有關[21]。它是前列腺素合成的限速酶，在正常體細胞中不表達，僅在細胞受到某種刺激（如生長因子、細胞因子、維甲酸和熱休克蛋白等）時才會迅速合成并分泌，被稱為“快速反應基因”。Ptgs2 啟動子上含有兩個核轉錄因子 κB（nuclear transcription factor，NF-κB）位點序列，該序列可誘導 Ptgs2 轉錄激活，當它與特異性抑制因子結合后，以 IκB 非活性形式存在。核轉錄因子 κB 激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）是 NF-κB 信號傳導通路的關鍵性激酶，當細胞外信號作用于細胞時，可激活 IKK，使 IκB 磷酸化，并釋放出有活性的 NF-κB，活化的 NF-κB 進入細胞核后可調節許多基因的轉錄[如神經黏附分子、誘導型一氧化氮合酶、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotmphic factor，BDNF）、Ptgs2 和 CaMKⅡ][22]，參與細胞的增殖、分化、炎癥反應、凋亡等過程。研究表明[23]，神經元細胞的胞外 Ca2+ 可通過 L-型鈣離子通道進入細胞內，進而激活 CaMKⅡ，后者又經過自體磷酸化而激活 NF-κB，NF-κB 在神經突觸可塑性中具有重要作用。Ptgs2 在誘導過程中表達上調，表明它對神經元樣細胞的誘導分化具有促進作用，48 h 時較顯著。
Choudhary 等[24]研究發現 Ca2+ 誘導 Ptgs2 mRNA 的表達啟動子的活性不依賴于蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）而依賴于蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）信號通路。Ogata 等[25]采用下頜骨成纖維細胞研究 Ca2+ 敏感性受體的作用時發現，細胞外 Ca2+ 可能通過 Ca2+ 敏感性受體激活細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2、p38MAPK 和 c-jun N 端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK），增加 Ptgs2 的表達。而陳亞男[26]研究發現，紅景天苷可通過激活 ERK1/2 和 PI3K/AKT/mTOR 信號通路，促進 BMSCs 向神經細胞定向分化。
Gcg 又名胰增血糖素或抗胰島素，是胰島 α 細胞分泌的一種激素，具有促進糖原分解和糖異生的作用。Gcg 作用初期首先與胞細胞膜上的受體特異性結合，將腺苷酸環化酶活化，cAMP 成為第二信使活化磷酸化酶，促進糖原分解。研究表明[27]，細胞內鈣離子濃度的升高可促使 Gcg 的釋放。這是由于血糖濃度的下降能促使胰島 α 細胞釋放谷氨酸鹽，谷氨酸鹽作用于 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）和 kainate 型促離子型谷氨酸受體，使細胞膜去極化，鈣離子通道被打開，細胞質中的自由鈣離子濃度增加，從而促進 Gcg 的釋放。Gcg 在誘導分化中表達下調，表明其對 BMSCs 的神經向分化起負調控作用。
Il2 是一種具有多向性作用的細胞因子，主要由活化的 T 細胞產生，對機體的免疫應答和抗病毒感染等有重要作用。研究表明[28]，Il2 與其受體結合后主要通過三條信號通路進行信號轉導：JAK/STAT5、PI3K/Akt/mTOR 以及絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路。實驗已證實，在離體神經細胞培養中，Il2 可促進鼠海馬細胞、皮質細胞、紋狀體、小腦及交感神經元的存活。Il2 可影響神經元的形態如軸突的分支及長度。目前認為其對神經軸突起的外生作用是直接的，而對神經元存活的影響可能為間接的，還可能參與影響少突膠質細胞的增生及成熟分化及星形膠質細胞、小膠質細胞的生長[29]。實驗結果表明 Il2 表達下調，說明它對神經向分化具有抑制作用。
Tnf 是一種抗腫瘤作用最強的細胞因子，主要由活化的單核/巨噬細胞產生，除了殺傷和抑制腫瘤細胞外，還可促進細胞的增殖、分化。根據其來源和結構不同可分為 Tnf-a 和 Tnf-b，同時，Tnf 還具有抗病毒及細菌，激活 T 細胞，促進 Il1、Il2、Il6 的產生及分泌，誘發炎癥反應的作用，是重要的炎癥因子[30]。研究表明，Tnf 具有體外誘導 BMSCs 向神經樣細胞分化的作用[31]。本實驗結果表明 Tnf 對神經元樣細胞的分化起負調控作用。
Sst 廣泛存在于中樞及周圍神經系統、心臟、甲狀腺、消化道及胰腺中，其中神經系統的下丘腦濃度最高。武小路[32]研究發現，Sst 對丘腦、大腦皮層和脊髓神經元具有普遍的抑制作用，注射 Sst 可抑制腦許多部位的自發性電活動，從而影響動物的行為。實驗結果表明，Sst 在紅景天苷誘導后表達下調，因此它在此過程中具有抑制作用。
前期研究結果表明，紅景天苷可誘導 BMSCs 分化為神經元樣細胞，在其分化過程中 ERK1/2 以及 PI3K/AKT/mTOR 信號通路在誘導分化過程中具有促進作用[26]，而 Ca2+/CaM 信號途徑在誘導過程中則起抑制作用。根據本實驗基因聚類分析結果可以看出，Ddit3、Hspa5、Ptgs2 和 ppp1r15a 之間，以及 Gcg、Il2、Tnf 和 Sst 之間具有相關性，說明它們是功能相似或者密切相關的一類基因。經過分析發現 Ddit3、Hspa5、Ptgs-2、Ppp1r15a 在誘導分化過程中具有正調控作用，Gcg、Il2、Tnf、Sst 則對誘導起負調控作用。綜上所述，cAMP/Ca2+ 信號通路中以上基因在誘導分化中的調控作用及它們之間的相互作用是紅景天苷誘導 BMSCs 分化為神經元樣細胞的分子學基礎。
引言
紅景天（Rhodiola）是多年生草本或亞灌木野生植物，因其花、根和莖的浸液都是紅色而得名，素有“高原人參”的美稱，是我國的傳統藏藥。藥理研究表明其主要有效成分紅景天苷（salidroside，SD）具有調節免疫、抗缺氧、降血糖、保護神經細胞、抗氧化、防輻射和保護肝臟等作用[1-2]。課題組前期研究證明，紅景天苷可誘導骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）分化為神經元細胞，而 Ca2+/鈣調蛋白（calmodulin，CaM）信號通路在其分化過程中具有一定作用[3]。
實時熒光定量 PCR 是一種檢測基因表達水平的分子生物學技術，它以準確的定量、較好的重現性等優勢，得到了全世界的公認。其基本原理是將熒光染料或熒光探針加入 PCR 反應體系中，由于熒光信號強度與 DNA 產量成正比，因此通過連續監測熒光信號強度的變化便可得到靶序列的初始濃度，由此便可推斷出目的基因的初始量。實時定量 PCR 陣列技術（real-time quantitative PCR array technique，RQ-PCR array）以實時定量 PCR 技術為核心并結合了陣列技術，具有高通量檢測基因表達水平的優勢，能夠準確、可靠地檢測大規模基因的表達，在疾病相關通路的研究中具有重要意義。美國 SABiosciences 公司生產的 RT2 Profiler PCR Array 是 RQ-PCR-array 技術的代表，在研究疾病發生的分子機制和輔助診斷方面具有重要參考意義。本實驗以 cAMP/Ca2+ 信號通路為研究對象，運用 RT2 Profiler PCR Array 方法檢測紅景天苷誘導 BMSCs 不同時間后該信號通路中差異表達的基因，進一步揭示紅景天苷誘導 BMSCs 分化為神經細胞的分子機制。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
小鼠骨髓間充質干細胞 D1 細胞株（序列號 ATCCCRL-12424），購自美國 ATCC 公司。
1.2 實驗儀器
紫外分光光度計（G1115A）購自美國 HP 公司；實時熒光定量 PCR 儀（73000）購自美國 ABI 公司；CO2 細胞培養箱（Forma371）購自美國 Thermo Revco 公司；超凈工作臺（SW-CJ-1FD）購自蘇州蘇潔凈化設備有限公司；臺式高速冷凍離心機（Primo R）購自德國 Heraeus 公司；微量高速離心機（TG16-W）購自湖南儀器儀表總廠興華儀器廠；自動純水蒸餾器（SCD-Ⅱ）購自天津銳馬蘭盾科技有限公司；熒光顯微鏡（倒置1×71）購自日本 OLYMPUS 公司；壓力蒸汽滅菌器（YXP-LS-50A）購自上海博迅實業有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（ZX-GF101-BS2）購自上海躍進醫療器械廠。
1.3 主要試劑
紅景天苷標準品購自中國藥品生物制品檢定所，純度≥98%；D/F12 培養基購自美國 GIBCO 公司；胎牛血清購自蘭州榮曄生物公司；全反式維甲酸（Retinoids acid，RA）購自美國 Sigma 公司；反轉錄試劑盒（Prime ScriptTM reagentKit、RNeasy Mini Kit 和 RT2 First strand kit）購自德國 QIAGEN 公司。
2 實驗方法
2.1 D1 細胞的培養
用含 10% 胎牛血清的 D/F12 完全培養液常規培養 D1 細胞，每 2～3 天更換一次培養液，待 80% 細胞融合后，用 0.25% 的胰酶對其消化傳代，繼續培養。
2.2 神經細胞標志分子相關基因表達的檢測
實驗分為空白對照組、紅景天苷誘導組和維甲酸誘導組（陽性對照組），分別使用 D/F12 完全培養液、含有 100 mg·L–1 紅景天苷的 D/F12 完全培養液、5 μg·L–1 維甲酸誘導 D1 細胞 12 h，通過凝膠電泳檢測神經細胞標志分子相關基因神經元特異性烯醇化酶（neuron-specific enolase，NSE）、β 微管蛋白 Ⅲ（β-Tubulin Ⅲ）和微管結合蛋白 2（microtubule- associated protein 2，MAP2）的表達情況。將 1×TAE 電泳緩沖液加至液面覆蓋瓊脂糖凝膠，在超凈工作臺上，吸取總 RNA 樣品 4 μL 于封口膜上。在實驗臺上再加入 5 μL 1×TAE 電泳緩沖液及 1 μL 的 10×載樣緩沖液，混勻后，小心加入點樣孔。打開電源開關，調節電壓至 100 V，使 RNA 由負極向正極電泳，約 30 min 后將凝膠放入 EB 染液中染色 5 min，用清水稍微漂洗。在紫外透射檢測儀上觀察 RNA 電泳結果，所有實驗重復 3 次。
2.3 cAMP/Ca2+ Signaling PathwayFinder PCR Array 檢測
實驗分為紅景天苷誘導組和空白對照組，誘導組細胞加入含有 100 mg·L–1 紅景天苷的 D/F12 完全培養液，空白對照組細胞加入不含藥物的等量 D/F12 完全培養液，分別作用 D1 細胞 24、48 和 72 h。按照 RNeasy Mini Kit 試劑使用說明提取細胞總 RNA，紫外分光光度計測定 RNA 純度和濃度，采用 G1115A 紫外分光光度計分別測定各組總 RNA 在 260、280、320 nm 波長的 OD 值，并用甲醛變性凝膠電泳做進一步的 RNA 質量檢測。各組總 RNA 純度應符合：OD260/OD280 Ratio 值在 1.8～2.0 之間。取 1 μg 總 RNA，RT2 First Strand Kit 合成 cDNA，反應體系 10 μL，反應條件：42℃，15 min；95℃，5 min；采用熒光定量 PCR-7300 兩步法擴增，反應體系 25 μL，PCR 反應條件：95℃ 預變性 10 min；95℃ 變性 15 s；60℃ 退火 1 min，40 個循環。分別檢測信號通路中相關基因 mRNA 的表達水平，基因的相對表達采用 2–ΔΔct 公式計算，所有實驗重復 3 次。
2.4 統計學分析
凝膠電泳檢測結果使用單因素方差分析進行統計，RT2 Profiler PCR Array 所得數據運用 RT2 Profiler PCR Array Data Analysis version 3.5 軟件在線進行分析（http://pcrdataanalysis.sabiosciences. com/pcr/array analysis.php），上調或下調顯著的判定標準為實驗組比對照組表達量≥2 倍。
3 實驗結果
3.1 凝膠電泳檢測結果
紅景天苷誘導 12 h 后，可見在 NSE、β-Tubulin Ⅲ 和 MAP2 mRNA 的表達上（見圖 1），陽性對照組上述基因的表達豐度均低于紅景天苷誘導組，差異具有統計學意義（P<0.01）；而空白對照組未見上述基因的表達。
圖1
不同誘導組中神經相關基因的表達 1：紅景天苷誘導組；2：維甲酸誘導組；3：空白對照組；M：分子量標記。與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與維甲酸誘導組相比，#P<0.05
Figure1.
Expression of neuron related genes in different induced groups 1: salidroside induction group; 2: retinoic acid induction group; 3: control group; M: marker. Compared with the blank control group, *P<0.05, **P<0.01; compared with the retinoic acid induction group, #P<0.05
3.2 PCR Array 檢測結果
將實時熒光定量 PCR 所得數據使用 QIAGEN 公司在線軟件進行分析，24、48、72 h 誘導組分別與對照組比較，誘導后 cAMP/Ca2+ 信號通路中 84 個相關基因的表達情況如表 1 所示。
表1
誘導組與對照組基因表達的比較（n=3）
Table1.
Genes expression of induction groups compared with that of control group (n=3)
與對照組比較，各誘導組基因變化情況如圖 2 所示。其中 24 h 誘導組與空白對照組比較基因變化情況，上調基因有 12 個，下調基因 19 個（上圖）；48 h 誘導組與空白對照組比較基因變化情況，上調基因 17 個，下調基因 12 個（中圖）；72 h 誘導組與空白對照組比較基因變化情況，上調基因 14 個，下調基因 13 個（下圖）。
圖2
24 h、48 h、72 h 誘導組基因變化散點圖Group 1：24 h 誘導組；Group 2：48 h 誘導組；Group 3：72 h 誘導組；Control：空白對照組
Figure2.
Scatter diagram of induction groups compared with that of control group Group 1: 24 h induction group; Group 2: 48 h induction group; Group 3: 72 h induction group; Control: blank control group
綜合以上結果，與對照組比較，誘導組中均表達上調且差異較顯著的基因有 4 個，依次是：DNA 損傷誘導轉錄因子 3（DNA damage-inducible tran-script 3，Ddit3），變化在 20 倍以上；蛋白磷酸酶 1 調節亞單位 15a（protein phosphatase 1 regulatory subunit 15A，Ppp1r15a），變化在 13 倍以上；前列腺素內過氧化物合酶（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，Ptgs2），變化量在 9 倍以上；熱休克蛋白 5（heat shock protein 5，Hspa5），變化量 6 倍以上；其余基因在 2～5 倍之間，見圖 3。
圖3
根據差異倍數篩選的上調、下調基因 與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01
Figure3.
Up-regulated and down-regulated genes according to fold changes Compared with the blank control group, *P<0.05, **P<0.01
誘導組表達下調且差異顯著的基因有 4 個，依次是：胰高血糖素（glucagon，Gcg），變化倍數 8～16 倍；白細胞介素 2（interleukin 2，Il2）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，Tnf），變化倍數 5～10 倍；生長激素抑制素（somatostatin，Sst），變化 5～8 倍，見圖 3。
基因聚類圖顯示（圖 4），Ptgs-2、Ddit3、Hspa5 等基因相關性較強，Gcg、Il2 相關性較強，Sst、Tnf 相關性較強。
圖4
不同時間誘導組與對照組基因變化聚類圖 Group 1：24 h 誘導組；Group 2：48 h 誘導組；Group 3：72 h 誘導組；Control：空白對照組
Figure4.
Cluster analysis of different time induction groups compared with that of control group Group 1: 24 h induction group; Group 2: 48 h induction group; Group 3: 72 h induction group; Control: blank control group
4 討論
紅景天味甘性寒，歸脾、肺經，具有補腎養心、調經活血、明目安神、扶正固本之功效。紅景天苷是紅景天的主要有效成分，研究表明，紅景天苷具有調節免疫、抗缺氧、保護神經細胞、抗氧化等作用[2]。本實驗結果顯示，紅景天能顯著上調神經細胞相關基因 NSE、β-Tubulin Ⅲ 和 MAP2 的 mRNA 表達。NSE 是神經元和神經內分泌細胞所特有的標志分子，在鑒定神經細胞方面具有重要意義。β-Tubulin Ⅲ 是神經分化相關的一種微管蛋白。MAP2 的表達與與神經元的生長和損傷后修復有關。由此可知，紅景天苷可誘導 BMSCs 向神經元樣細胞分化。
細胞分化是指相同類型的細胞在分裂的過程中逐漸形成的在形態、結構和功能上都具有穩定性差異的細胞。其核心是通過基因的調控使細胞內合成了不同的專一蛋白質。
本實驗將紅景天苷作用 D1 細胞不同時間后，對表達差異具有統計學意義的基因進行篩選，涉及到的生物學功能主要包括細胞周期、細胞應激、炎癥反應、DNA 損傷修復等各方面。我們從中挑選出上調較顯著的基因 Ddit3、Hspa5、Ppp1r15a 和 Ptgs-2，以及下調較顯著的基因 Gcg、Il2、Tnf 和 Sst，對其作用機制進行分析研究，以探討 cAMP/Ca2+ 信號通路在紅景天苷誘導 BMSCs 向神經元樣細胞分化中的作用機制。
Ddit3 是內質網應激反應中的多功能轉錄因子，研究顯示，它可上調 Ppp1r15a 基因[4]與內質網氧化還原酶 1（endoplasmic reticulum oxidoreductase 1，EROlα）基因的表達[5]，而后者又可激活磷脂酰肌醇 3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，IP3R），從而促進大量的 Ca2+ 從內質網轉運至胞質，使胞內 Ca2+ 濃度升高[6]。研究發現內質網應激可上調 Ddit3 的表達[7]，實驗結果表明，Ddit3 在誘導 48 h 時上調較為顯著，說明 Ddit3 在紅景天苷誘導前期對 BMSCs 的神經向分化具有促進作用。
熱休克蛋白是生物界中高度保守的一種蛋白質，細胞在受到某些刺激（如缺氧、高熱、感染、缺血及化學物質等）時，機體在很短的時間內大量合成熱休克蛋白，熱休克蛋白的出現標志著細胞自身保護機制的啟動。熱休克蛋白還具有神經保護作用，許多神經系統疾病如癲癇、阿爾茨海默癥、多發性硬化等，都與熱休克蛋白有關[8]。Hspa5 是熱休克蛋 白70（heat shock protein 70，HSP70）家族的成員之一[9]，該家族包含 21 種蛋白質，它們在進化上保持高度同源性。大體可分為 4 種類型：HSP70、HSC70、GRP78 和 GRP75[10-11]。張霞等[12]實驗研究顯示，熱休克狀態時，小鼠胚胎成纖維細胞中 CaM 和 HSP70 的表達量顯著增加，若阻斷 CaM 則 HSP70 的表達量也降低。Holmberg 等[13]報道，鈣調蛋白依賴性蛋白激酶 Ⅱ（calmodulin dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）能促使 HeLa 細胞中熱休克因子 1（heat shock factor 1，HSF1）的 Ser230 位點磷酸化，而 HSF1 可在熱休克狀態時被活化，并誘導 HSP70 基因的轉錄[14]。CaMKⅡ 是 Ca2+/CaM 信號下游的一種重要蛋白激酶，可直接被 Ca2+/CaM 激活[15]，并參與乙酰膽堿依賴性鈣離子通道的激活[16]和神經傳導[17]等生理過程。因此，Ca2+ 濃度的增加可激活 HSP70 的表達。實驗顯示，隨著紅景天苷誘導時間的增加，細胞內 Ca2+ 濃度在 48 h 時出現峰值，同樣 HSP70 在 48 h 時表達量最高，結果表明 HSP70 在誘導中起正調控作用，48 h 時較為顯著。
Ppp1r15a，又稱為 GADD34（DNA 損傷誘導蛋白 34）。PP1 是一種細胞周期蛋白，是真核生物中的一種重要的蛋白磷酸酶，參與細胞的生長、分化、轉錄、翻譯等生理過程[18]。PP1 和 CaMKⅡ 是一對去磷酸化與磷酸化蛋白質，它們可直接或間接參與 Ca2+ 及 Ca2+-ATPase 活性的調控[19]。研究表明，內質網應激在腦缺血預處理后引起的神經保護中發揮著重要作用[20]，Ppp1r15a 在實驗中表達升高，說明其對神經分化起正調控作用，48 h 時較顯著。
Ptgs2 又名環氧化酶 2（cyclooxygenase 2，COX-2），是一種重要的炎性介質，參與中樞神經系統多種病理過程，參與炎癥反應、神經元死亡、神經元超興奮性、星形細胞活化，也與細胞增殖有關[21]。它是前列腺素合成的限速酶，在正常體細胞中不表達，僅在細胞受到某種刺激（如生長因子、細胞因子、維甲酸和熱休克蛋白等）時才會迅速合成并分泌，被稱為“快速反應基因”。Ptgs2 啟動子上含有兩個核轉錄因子 κB（nuclear transcription factor，NF-κB）位點序列，該序列可誘導 Ptgs2 轉錄激活，當它與特異性抑制因子結合后，以 IκB 非活性形式存在。核轉錄因子 κB 激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）是 NF-κB 信號傳導通路的關鍵性激酶，當細胞外信號作用于細胞時，可激活 IKK，使 IκB 磷酸化，并釋放出有活性的 NF-κB，活化的 NF-κB 進入細胞核后可調節許多基因的轉錄[如神經黏附分子、誘導型一氧化氮合酶、腦源性神經營養因子（brain-derived neurotmphic factor，BDNF）、Ptgs2 和 CaMKⅡ][22]，參與細胞的增殖、分化、炎癥反應、凋亡等過程。研究表明[23]，神經元細胞的胞外 Ca2+ 可通過 L-型鈣離子通道進入細胞內，進而激活 CaMKⅡ，后者又經過自體磷酸化而激活 NF-κB，NF-κB 在神經突觸可塑性中具有重要作用。Ptgs2 在誘導過程中表達上調，表明它對神經元樣細胞的誘導分化具有促進作用，48 h 時較顯著。
Choudhary 等[24]研究發現 Ca2+ 誘導 Ptgs2 mRNA 的表達啟動子的活性不依賴于蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）而依賴于蛋白激酶 A（protein kinase A，PKA）信號通路。Ogata 等[25]采用下頜骨成纖維細胞研究 Ca2+ 敏感性受體的作用時發現，細胞外 Ca2+ 可能通過 Ca2+ 敏感性受體激活細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）1/2、p38MAPK 和 c-jun N 端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK），增加 Ptgs2 的表達。而陳亞男[26]研究發現，紅景天苷可通過激活 ERK1/2 和 PI3K/AKT/mTOR 信號通路，促進 BMSCs 向神經細胞定向分化。
Gcg 又名胰增血糖素或抗胰島素，是胰島 α 細胞分泌的一種激素，具有促進糖原分解和糖異生的作用。Gcg 作用初期首先與胞細胞膜上的受體特異性結合，將腺苷酸環化酶活化，cAMP 成為第二信使活化磷酸化酶，促進糖原分解。研究表明[27]，細胞內鈣離子濃度的升高可促使 Gcg 的釋放。這是由于血糖濃度的下降能促使胰島 α 細胞釋放谷氨酸鹽，谷氨酸鹽作用于 α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）和 kainate 型促離子型谷氨酸受體，使細胞膜去極化，鈣離子通道被打開，細胞質中的自由鈣離子濃度增加，從而促進 Gcg 的釋放。Gcg 在誘導分化中表達下調，表明其對 BMSCs 的神經向分化起負調控作用。
Il2 是一種具有多向性作用的細胞因子，主要由活化的 T 細胞產生，對機體的免疫應答和抗病毒感染等有重要作用。研究表明[28]，Il2 與其受體結合后主要通過三條信號通路進行信號轉導：JAK/STAT5、PI3K/Akt/mTOR 以及絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路。實驗已證實，在離體神經細胞培養中，Il2 可促進鼠海馬細胞、皮質細胞、紋狀體、小腦及交感神經元的存活。Il2 可影響神經元的形態如軸突的分支及長度。目前認為其對神經軸突起的外生作用是直接的，而對神經元存活的影響可能為間接的，還可能參與影響少突膠質細胞的增生及成熟分化及星形膠質細胞、小膠質細胞的生長[29]。實驗結果表明 Il2 表達下調，說明它對神經向分化具有抑制作用。
Tnf 是一種抗腫瘤作用最強的細胞因子，主要由活化的單核/巨噬細胞產生，除了殺傷和抑制腫瘤細胞外，還可促進細胞的增殖、分化。根據其來源和結構不同可分為 Tnf-a 和 Tnf-b，同時，Tnf 還具有抗病毒及細菌，激活 T 細胞，促進 Il1、Il2、Il6 的產生及分泌，誘發炎癥反應的作用，是重要的炎癥因子[30]。研究表明，Tnf 具有體外誘導 BMSCs 向神經樣細胞分化的作用[31]。本實驗結果表明 Tnf 對神經元樣細胞的分化起負調控作用。
Sst 廣泛存在于中樞及周圍神經系統、心臟、甲狀腺、消化道及胰腺中，其中神經系統的下丘腦濃度最高。武小路[32]研究發現，Sst 對丘腦、大腦皮層和脊髓神經元具有普遍的抑制作用，注射 Sst 可抑制腦許多部位的自發性電活動，從而影響動物的行為。實驗結果表明，Sst 在紅景天苷誘導后表達下調，因此它在此過程中具有抑制作用。
前期研究結果表明，紅景天苷可誘導 BMSCs 分化為神經元樣細胞，在其分化過程中 ERK1/2 以及 PI3K/AKT/mTOR 信號通路在誘導分化過程中具有促進作用[26]，而 Ca2+/CaM 信號途徑在誘導過程中則起抑制作用。根據本實驗基因聚類分析結果可以看出，Ddit3、Hspa5、Ptgs2 和 ppp1r15a 之間，以及 Gcg、Il2、Tnf 和 Sst 之間具有相關性，說明它們是功能相似或者密切相關的一類基因。經過分析發現 Ddit3、Hspa5、Ptgs-2、Ppp1r15a 在誘導分化過程中具有正調控作用，Gcg、Il2、Tnf、Sst 則對誘導起負調控作用。綜上所述，cAMP/Ca2+ 信號通路中以上基因在誘導分化中的調控作用及它們之間的相互作用是紅景天苷誘導 BMSCs 分化為神經元樣細胞的分子學基礎。
