本文采用靜電紡絲制備了負載王不留行黃酮苷的聚乙烯醇苯乙烯吡啶鹽（PVA-SbQ）/玉米醇溶蛋白（Zein）納米纖維，對納米纖維的表面形貌和結構進行了觀察，并對其進行了生物相容性評價。將負載王不留行黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維作為實驗組，以凡士林紗布為對照組，建立小鼠皮膚損傷模型，對兩種敷料在小鼠皮膚上的修復作用進行組織切片觀察。實驗結果表明，成功制備了負載王不留行黃酮苷的納米纖維并呈現良好的形貌；負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維對 L929 細胞無毒害作用，且黃酮苷的存在可以促進細胞黏附生長。基于 PVA-SbQ/Zein/黃酮苷納米纖維膜的創傷愈合材料對小鼠傷口愈合的效果要優于凡士林紗布。
引用本文： 邱玉宇, 蔡維維, 邱麗穎, 王清清, 魏取福. 負載王不留行黃酮苷納米纖維作為創傷敷料的研究. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(3): 394-400. doi: 10.7507/1001-5515.201603001 復制
引言
傷口愈合是當機體遭受外力作用后皮膚表皮層或皮下組織斷裂或缺損后的愈合過程。理想的創傷敷料可以加速此過程，并且可以防止感染和保持皮膚正常的結構和功能[1]。近年來，納米纖維在創傷愈合領域具有巨大潛力而引起廣泛關注[2]。目前，靜電紡絲工藝是制備組織工程納米纖維支架材料最有效的方法之一，靜電紡納米纖維可以模擬細胞外基質促進上皮細胞的黏附、增殖和新組織的形成。此外，納米纖維的高比表面積和高孔隙度可以促進液體的吸收、細胞的呼吸和氣體的滲透[3-5]。而靜電紡載藥納米纖維將納米纖維和藥物的優勢相結合，作為傷口愈合材料的基材，是一個新的研究熱點[6]。
本研究中應用的王不留行黃酮苷（vaccarin）是一種淡黃色顆粒狀結晶[7]，它能促進內皮細胞的生成，具有促進血管新生的作用從而促進創面愈合[8]。應用的聚乙烯醇-苯乙烯吡啶鹽（polymer poly（vinyl alcohol）-stilbazole quaternized，PVA-SbQ）和玉米醇溶蛋白（Zein）均具有良好的生物相容性，通過靜電紡絲的形式將兩種聚合物復合作為藥物黃酮苷的載體，可增大藥物表面積，使藥物逐漸釋放，從而達到不斷促進內皮細胞增殖以加速創面愈合的目的[9-10]，這不僅具有重要的科學意義，而且在將來有望產生較大的實際應用價值。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
玉米醇溶蛋白（Zein），Mw=35 000，Sigma-Aldrich（St. Louis，MO）Company；冰乙酸，分析純（AR），上海申翔化學試劑有限公司；聚乙烯醇-苯乙烯吡啶鹽（PVA-SbQ），168-H 型，上海光毅印刷器材科技有限公司；王不留行黃酮苷（Vaccarin），實驗室用級，上海士峰生物科技有限公司；DMEM 培養液、優等胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶、谷氨酰胺，GIBCO 公司；L929 小鼠成纖維細胞，中國科學院細胞庫；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），Sigma 公司；酒精、戊二醛、生理鹽水，國藥集團化學試劑有限公司；凡士林紗布，新鄉市華西衛材有限公司；ICR（Institute of Cancer Research）雄性小鼠，上海實驗動物研究中心。
AL204 型電子天平、pH 計，Mettler Toledo 公司；85-2A 數顯測速恒溫磁力攪拌器，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；自制靜電紡絲裝置；DZF-6210 真空干燥箱，南京沃環科技實業有限公司；醫用超凈工作臺，青島丹佳凈化設備有限公司；全自動酶標儀，長沙鍵源醫療科技有限公司；細胞培養瓶、細胞培養板，CORNING 公司；SY18-WJ2/3 CO2 細胞培養箱，Thermo Format 公司。
1.2 靜電紡載藥納米纖維膜的制備
將 PVA-SbQ、Zein 質量比為 1∶1 的混合體系 4 g 加入到 12 g 冰乙酸中，常溫下攪拌 1 h 后再加入藥物黃酮苷 0.05 g，制得包含藥物的 PVA-SbQ/Zein 前驅體溶液。將前驅體溶液倒入 20 mL 的注射器內，常溫下進行靜電紡絲，滾筒轉速 200 r/min，紡絲條件為：電壓 15 kV，速度 1 mL/h，接收距離 20 cm[11]。后將樣品在 60℃ 下干燥 12 h，即得到 PVA-SbQ/Zein 載藥復合納米纖維膜。
1.3 評價方法
1.3.1 表面形貌觀察 剪取小塊 PVA-SbQ/Zein 載藥復合納米纖維膜制樣，經噴金處理后，使用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）（HITACHT SU1510）對其表面形貌進行觀察。利用 Adobe Acro-bat 7.0 Professional 軟件測量纖維直徑，每個樣品隨機選取 100～200 根纖維測量，最后計算纖維的平均直徑和標準差系數（CV 值）從而得到纖維直徑分布。
1.3.2 傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，FTIR） 取純 Zein、PVA-SbQ、黃酮苷和復合納米纖維膜，以壓片法和衰減全反射分別制樣，采用 FTIR（Nicoletis10）測其紅外光譜從而對樣品表面進行結構分析。
1.3.3 生物相容性評價 ① 細胞活性實驗：選取 DMEM 培養基作為浸提介質，根據《GB/T 16886.12-2005/ISO 10993-12:2002 醫療器械生物學評價第 12 部分：樣品制備與參照樣品》標準，將滅菌（酒精浸泡 1 h 和紫外照射 2 h）后的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜按 3、6、9 cm2/mL 裁剪分別浸入 DMEM 培養基，置 5% CO2、37℃ 培養箱中浸提 24 h 和 72 h，制備低濃度、中濃度、高濃度的材料浸提液。將兩組實驗材料 24 h、72 h 的浸提液作為實驗材料組，DMEM 培養基作為陰性對照組，進行 L929 細胞培養，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。根據《GB/T 16175-1996，醫用有機硅材料生物評價實驗方法》，采用 MTT 法進行細胞毒性檢測，使用全自動酶標儀以 570 nm 為測定波長，測量各孔的光密度（optical density，OD）值，實驗數據采用 SPSS13.0 統計軟件包進行數據處理分析，以均數±標準差表示。采用 t 檢驗進行統計學差異比較，P<0.05 為有統計學意義。計算得到的相對生長速率（relative growth rate，RGR）來評定材料的細胞毒性等級[12]，使用 Origin 軟件繪制相對生長速率圖，RGR 的計算如下：RGR（%）=實驗材料組均值/陰性對照組均值×100%。② 細胞黏附實驗：PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜經酒精熏蒸過夜，紫外正反面照射 2 h，平鋪于 24 孔板內，每組設置 4 個復孔。經傳代的 L929 細胞以 1×104 個細胞/孔，種于鋪有纖維膜的 24 孔板內培養 24 h 后，將處理后的材料-細胞取出，經噴金處理，在掃描電鏡下觀察 L929 細胞在納米纖維膜上的生長情況。
1.3.4 動物評價 ICR 雄性小鼠 60 只，6～8 周，體重 20～25 g，隨機分為 6 組，每組 10 只。將負載黃酮苷藥物的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維作為實驗組材料，以無菌凡士林紗布為對照組材料。實驗組材料用 75% 酒精正反面熏蒸 24 h，并用紫外照射 2 h。實驗鼠腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉（80 mg/kg）生理鹽水溶液麻醉。背部皮膚備皮，安爾碘消毒后組織剪剪取背部全層皮膚及深筋膜層，制成直徑為 1.5 cm 的圓形創面，將相應大小的實驗組材料和對照組材料敷于創面。術畢創面用自粘繃帶包扎固定，分別于第 3、7、14 天大體觀察愈合情況。采用乙醚麻醉法將小鼠致死，取下局部皮膚組織，投入 10% 甲醛固定液，浸泡 48 h 后進行石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，在光鏡下觀察。
2 結果與討論
2.1 表面形貌
圖 1 所示為未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜的掃描電鏡圖和直徑分布圖。未載藥納米纖維直徑為（145±59）nm，纖維表面光滑，沒有串珠。在此基礎上負載黃酮苷得到靜電紡載藥 PVA-SbQ/Zein 納米纖維，雖然肉眼觀察到的纖維膜平整光滑，但放大后看到纖維形貌改變，出現溶脹現象，直徑為（378±71）nm。負載藥物后纖維表面形貌變化很大，這可能是由于負載藥物后紡絲液的黏度和電導率不同導致的[11]。
圖1
未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維的掃描電鏡與直徑分布圖
Figure1.
SEM and diameter distribution images of PVA-SbQ/Zein composite nanofibers with and without drug vaccarin
2.2 紅外光譜分析
圖 2 為負載黃酮苷納米纖維的紅外光譜分析圖。a 是藥物黃酮苷的紅外光譜圖，3 303、1 614 和 1 450 cm—1處分別為 O-H、酰基鍵（C=O）和 C=C 的彈性振動峰。b 為 Zein 納米纖維紅外光譜圖，1 651、1 542、3 298 和 1 247 cm—1 處分別為 C=O 在酰胺 Ⅰ 帶的伸縮振動峰，N-H、O-H 在酰胺 Ⅱ 帶的伸縮振動峰和 C-N 在酰胺 Ⅲ 帶的伸縮振動峰 7[13]。c 中 1 374 cm—1 處為 PVA-SbQ 中 SbQ 基團鏈末端 δ（–CH3）吸收峰，1 247 cm—1 處為 δ（O-H）吸收峰，835 cm—1 處的吸收峰是 SbQ 基團上苯環的面外彎曲振動峰 8[14]。d 是未載藥的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維的紅外光譜圖，e 為負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜的紅外光譜圖，可以看出酰胺 Ⅱ 帶處的峰紅移至 1 532 cm—1，這些結果表明，穩定的二級結構被軟化，這是由于 Zein、黃酮苷中的氨基和羰基基團形成的氫鍵作用減弱導致的，這可以證明藥物與復合纖維具有較好的相容性。
圖2
藥物黃酮苷（a）、Zein（b）、PVA-SbQ（c）、未載藥（d）和負載黃酮苷（e）PVA-SbQ/Zein納米纖維的紅外光譜圖
Figure2.
FTIR of vaccarin (a), Zein (b), PVA-SbQ (c), PVA-SbQ/Zein nanofibers without (d) and with drug drug vaccarin (e)
2.3 生物相容性評價
2.3.1 細胞活性實驗（見圖 3） 傷口愈合的材料必須具有良好的生物相容性，這是材料在特定環境下使用時必須具備的條件[15]。細胞毒性實驗是檢測材料和器械接觸機體組織后生物學反應的體外實驗，它是生物學評價體系中最重要的檢測指標之一[16]。其中，MTT 比色法是定量測定細胞毒性的首選方法之一，可以全面、客觀地反映被測材料對細胞生長及活性的影響，計算細胞 RGR，反映材料的細胞毒性。一般認為，RGR>75% 的生物材料對細胞沒有毒性影響[17]。如圖 3 所示，倒置光學顯微鏡下觀察，L929 細胞在未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維浸提液中均表現為較好的增殖和形貌。同時，未載藥和 PVA-SbQ/Zein/黃酮苷納米纖維 RGR 均>75%，提示未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維均無細胞毒性。表 1 為 PVA-SbQ/Zein 和 PVA-SbQ/Zein/黃酮苷納米纖維不同濃度浸提液在細胞培養 24 h 和 72 h 后的吸光值比較，從表中可看出，細胞培養 24 h 各濃度和培養 72 h 后中濃度的兩組間吸光值差異無統計學意義（P>0.05）。細胞培養 72 h 后，與未載藥組相比，載藥組低濃度組、高濃度組吸光值均有明顯差異（P<0.01），這可能是由于黃酮苷的釋放可以促進細胞增殖，而不同濃度的材料浸提液所釋放的藥物含量為細胞的生長提供了不同的生存條件。
圖3
未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維不同濃度浸提液培養 24 h 和 72 h 鏡下細胞形態圖和 RGR 結果統計
Figure3.
Microphotographs and RGR of L929 cells with different concentrations of extract from PVA-SbQ/Zein nanofibers and PVA-SbQ/Zein/vaccarin nanofibers cultured for 24 h and 72 h respectively
表1
未載藥組與負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維組不同濃度浸提液中細胞 OD 值
Table1.
OD value of PVA-SbQ/Zein nanofibers and PVA-SbQ/Zein/vaccarin nanofibers with different concentrations of DMEM
2.3.2 細胞黏附實驗 未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維對細胞的直接接觸試驗結果如圖 4 所示。左圖為 PVA-SbQ/Zein 納米纖維的細胞黏附掃描電鏡圖，從圖中可以看出細胞黏附生長于纖維表面并呈現良好的形態結構。右圖是 PVA-SbQ/Zein/黃酮苷納米纖維的細胞黏附掃描電鏡圖，可以看出細胞黏附生長于纖維表面，部分已生長于纖維內部，且細胞數量較多，這可能是因為藥物黃酮苷的存在可以促進細胞的黏附生長。
圖4
未載藥和負載黃酮苷 PVA-SbQ/Zein 納米纖維表面細胞的黏附生長掃描電鏡圖
Figure4.
SEM of cell attachment on PVA-SbQ/Zein nano-fibers with and without drug vaccarin
從材料浸提液和直接接觸試驗結果中可以看到未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維均具有良好的生物相容性，而負載黃酮苷的納米纖維浸提液中 L929 細胞生長活性更好，細胞黏附生長的數量也更多，可以說明黃酮苷載藥成功并發揮了其藥物釋放的作用，可以作為創傷愈合材料使用[11]。
2.4 動物評價
2.4.1 傷口愈合觀察 圖 5 是小鼠傷口愈合情況大體觀察圖。實驗組（PVA-SbQ/Zein/黃酮苷組）3 天后傷口開始縮小，表面平整、濕潤，創面無分泌物。7 天時實驗組創面明顯縮小，創面干燥，無明顯傷口滲出，傷口邊緣和周圍皮膚組織顏色淺紅、彈性好。對照組（凡士林紗布組）7 天時，當新生組織長入紗布后，直接取出紗布出現傷口的再次損傷。從圖中可看到經去除凡士林紗布的傷口有輕度膿性及血性分泌物黏附。14 天時實驗組出現結痂，傷口基本愈合。
圖5
負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維組（實驗組）與無菌凡士林紗布組（對照組）不同時間肉眼觀察小鼠皮膚傷口愈合
Figure5.
Macroscopic observation of rat skin wound healing by PVA-SbQ/Zein/vaccarin (trial group) and petrolatum gauze (control group)
2.4.2 組織切片觀察 圖 6 是 200 倍顯微鏡下觀察到的小鼠傷口組織切片圖。從圖中可以看到，在第 3 天時，對照組（凡士林紗布組）和實驗組（PVA-SbQ/Zein/黃酮苷組）傷口均有明顯的炎癥反應，中性粒細胞是早期進入損傷部位的主要炎癥細胞。在第 7 天時，從圖中可以明顯看到實驗組出現較多的新生血管和成纖維細胞，創面膠原纖維增生明顯，而對照組也會有新生血管的形成，但相對較少。而在第 14 天時，新生復層扁平上皮，皮下組織致密，膠原纖維出現，纖維結締組織增生，小鼠損傷皮膚已基本愈合[18]。
圖6
負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維組（實驗組）與無菌凡士林紗布組（對照組）小鼠損傷皮膚組織切片觀察（HE染色，200×）
Figure6.
Histological observation of skin traumatism by PVA-SbQ/Zein/vaccarin (trial group) and petrolatum gauze (control group) (HE, 200×)
實驗結果表明，實驗組 PVA-SbQ/Zein/黃酮苷納米纖維對小鼠損傷皮膚的愈合效果更好，隨著時間的推移，小鼠傷口周圍細胞、纖維組織和血管逐漸形成。一方面是因為納米纖維結構可以模擬細胞外基質從而促進上皮細胞的增殖和新組織的形成，并且納米纖維的高比表面積和高孔隙度可以促進液體的吸收、細胞的代謝和氣體的滲透從而利于傷口的愈合；另一方面是由于藥物黃酮苷的作用，它可以通過促進內皮細胞的生成和血管新生從而促進創面愈合[4，11]。
3 結論
負載王不留行黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維具有良好的生物相容性，對小鼠傷口愈合效果比普通凡士林紗布類敷料好，傷口愈合速度快，說明藥物黃酮苷和納米纖維的結合對傷口愈合有促進作用，且不會對傷口造成再次損傷，是理想的創傷敷料，有望將來用作醫用敷料。
引言
傷口愈合是當機體遭受外力作用后皮膚表皮層或皮下組織斷裂或缺損后的愈合過程。理想的創傷敷料可以加速此過程，并且可以防止感染和保持皮膚正常的結構和功能[1]。近年來，納米纖維在創傷愈合領域具有巨大潛力而引起廣泛關注[2]。目前，靜電紡絲工藝是制備組織工程納米纖維支架材料最有效的方法之一，靜電紡納米纖維可以模擬細胞外基質促進上皮細胞的黏附、增殖和新組織的形成。此外，納米纖維的高比表面積和高孔隙度可以促進液體的吸收、細胞的呼吸和氣體的滲透[3-5]。而靜電紡載藥納米纖維將納米纖維和藥物的優勢相結合，作為傷口愈合材料的基材，是一個新的研究熱點[6]。
本研究中應用的王不留行黃酮苷（vaccarin）是一種淡黃色顆粒狀結晶[7]，它能促進內皮細胞的生成，具有促進血管新生的作用從而促進創面愈合[8]。應用的聚乙烯醇-苯乙烯吡啶鹽（polymer poly（vinyl alcohol）-stilbazole quaternized，PVA-SbQ）和玉米醇溶蛋白（Zein）均具有良好的生物相容性，通過靜電紡絲的形式將兩種聚合物復合作為藥物黃酮苷的載體，可增大藥物表面積，使藥物逐漸釋放，從而達到不斷促進內皮細胞增殖以加速創面愈合的目的[9-10]，這不僅具有重要的科學意義，而且在將來有望產生較大的實際應用價值。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
玉米醇溶蛋白（Zein），Mw=35 000，Sigma-Aldrich（St. Louis，MO）Company；冰乙酸，分析純（AR），上海申翔化學試劑有限公司；聚乙烯醇-苯乙烯吡啶鹽（PVA-SbQ），168-H 型，上海光毅印刷器材科技有限公司；王不留行黃酮苷（Vaccarin），實驗室用級，上海士峰生物科技有限公司；DMEM 培養液、優等胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）、胰蛋白酶、谷氨酰胺，GIBCO 公司；L929 小鼠成纖維細胞，中國科學院細胞庫；四甲基偶氮唑鹽（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）試劑、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），Sigma 公司；酒精、戊二醛、生理鹽水，國藥集團化學試劑有限公司；凡士林紗布，新鄉市華西衛材有限公司；ICR（Institute of Cancer Research）雄性小鼠，上海實驗動物研究中心。
AL204 型電子天平、pH 計，Mettler Toledo 公司；85-2A 數顯測速恒溫磁力攪拌器，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；自制靜電紡絲裝置；DZF-6210 真空干燥箱，南京沃環科技實業有限公司；醫用超凈工作臺，青島丹佳凈化設備有限公司；全自動酶標儀，長沙鍵源醫療科技有限公司；細胞培養瓶、細胞培養板，CORNING 公司；SY18-WJ2/3 CO2 細胞培養箱，Thermo Format 公司。
1.2 靜電紡載藥納米纖維膜的制備
將 PVA-SbQ、Zein 質量比為 1∶1 的混合體系 4 g 加入到 12 g 冰乙酸中，常溫下攪拌 1 h 后再加入藥物黃酮苷 0.05 g，制得包含藥物的 PVA-SbQ/Zein 前驅體溶液。將前驅體溶液倒入 20 mL 的注射器內，常溫下進行靜電紡絲，滾筒轉速 200 r/min，紡絲條件為：電壓 15 kV，速度 1 mL/h，接收距離 20 cm[11]。后將樣品在 60℃ 下干燥 12 h，即得到 PVA-SbQ/Zein 載藥復合納米纖維膜。
1.3 評價方法
1.3.1 表面形貌觀察 剪取小塊 PVA-SbQ/Zein 載藥復合納米纖維膜制樣，經噴金處理后，使用掃描電鏡（scanning electron microscope，SEM）（HITACHT SU1510）對其表面形貌進行觀察。利用 Adobe Acro-bat 7.0 Professional 軟件測量纖維直徑，每個樣品隨機選取 100～200 根纖維測量，最后計算纖維的平均直徑和標準差系數（CV 值）從而得到纖維直徑分布。
1.3.2 傅里葉紅外光譜（Fourier transform infrared spectrum，FTIR） 取純 Zein、PVA-SbQ、黃酮苷和復合納米纖維膜，以壓片法和衰減全反射分別制樣，采用 FTIR（Nicoletis10）測其紅外光譜從而對樣品表面進行結構分析。
1.3.3 生物相容性評價 ① 細胞活性實驗：選取 DMEM 培養基作為浸提介質，根據《GB/T 16886.12-2005/ISO 10993-12:2002 醫療器械生物學評價第 12 部分：樣品制備與參照樣品》標準，將滅菌（酒精浸泡 1 h 和紫外照射 2 h）后的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜按 3、6、9 cm2/mL 裁剪分別浸入 DMEM 培養基，置 5% CO2、37℃ 培養箱中浸提 24 h 和 72 h，制備低濃度、中濃度、高濃度的材料浸提液。將兩組實驗材料 24 h、72 h 的浸提液作為實驗材料組，DMEM 培養基作為陰性對照組，進行 L929 細胞培養，在倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況。根據《GB/T 16175-1996，醫用有機硅材料生物評價實驗方法》，采用 MTT 法進行細胞毒性檢測，使用全自動酶標儀以 570 nm 為測定波長，測量各孔的光密度（optical density，OD）值，實驗數據采用 SPSS13.0 統計軟件包進行數據處理分析，以均數±標準差表示。采用 t 檢驗進行統計學差異比較，P<0.05 為有統計學意義。計算得到的相對生長速率（relative growth rate，RGR）來評定材料的細胞毒性等級[12]，使用 Origin 軟件繪制相對生長速率圖，RGR 的計算如下：RGR（%）=實驗材料組均值/陰性對照組均值×100%。② 細胞黏附實驗：PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜經酒精熏蒸過夜，紫外正反面照射 2 h，平鋪于 24 孔板內，每組設置 4 個復孔。經傳代的 L929 細胞以 1×104 個細胞/孔，種于鋪有纖維膜的 24 孔板內培養 24 h 后，將處理后的材料-細胞取出，經噴金處理，在掃描電鏡下觀察 L929 細胞在納米纖維膜上的生長情況。
1.3.4 動物評價 ICR 雄性小鼠 60 只，6～8 周，體重 20～25 g，隨機分為 6 組，每組 10 只。將負載黃酮苷藥物的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維作為實驗組材料，以無菌凡士林紗布為對照組材料。實驗組材料用 75% 酒精正反面熏蒸 24 h，并用紫外照射 2 h。實驗鼠腹腔注射 3% 戊巴比妥鈉（80 mg/kg）生理鹽水溶液麻醉。背部皮膚備皮，安爾碘消毒后組織剪剪取背部全層皮膚及深筋膜層，制成直徑為 1.5 cm 的圓形創面，將相應大小的實驗組材料和對照組材料敷于創面。術畢創面用自粘繃帶包扎固定，分別于第 3、7、14 天大體觀察愈合情況。采用乙醚麻醉法將小鼠致死，取下局部皮膚組織，投入 10% 甲醛固定液，浸泡 48 h 后進行石蠟包埋、切片，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，在光鏡下觀察。
2 結果與討論
2.1 表面形貌
圖 1 所示為未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜的掃描電鏡圖和直徑分布圖。未載藥納米纖維直徑為（145±59）nm，纖維表面光滑，沒有串珠。在此基礎上負載黃酮苷得到靜電紡載藥 PVA-SbQ/Zein 納米纖維，雖然肉眼觀察到的纖維膜平整光滑，但放大后看到纖維形貌改變，出現溶脹現象，直徑為（378±71）nm。負載藥物后纖維表面形貌變化很大，這可能是由于負載藥物后紡絲液的黏度和電導率不同導致的[11]。
圖1
未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維的掃描電鏡與直徑分布圖
Figure1.
SEM and diameter distribution images of PVA-SbQ/Zein composite nanofibers with and without drug vaccarin
2.2 紅外光譜分析
圖 2 為負載黃酮苷納米纖維的紅外光譜分析圖。a 是藥物黃酮苷的紅外光譜圖，3 303、1 614 和 1 450 cm—1處分別為 O-H、酰基鍵（C=O）和 C=C 的彈性振動峰。b 為 Zein 納米纖維紅外光譜圖，1 651、1 542、3 298 和 1 247 cm—1 處分別為 C=O 在酰胺 Ⅰ 帶的伸縮振動峰，N-H、O-H 在酰胺 Ⅱ 帶的伸縮振動峰和 C-N 在酰胺 Ⅲ 帶的伸縮振動峰 7[13]。c 中 1 374 cm—1 處為 PVA-SbQ 中 SbQ 基團鏈末端 δ（–CH3）吸收峰，1 247 cm—1 處為 δ（O-H）吸收峰，835 cm—1 處的吸收峰是 SbQ 基團上苯環的面外彎曲振動峰 8[14]。d 是未載藥的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維的紅外光譜圖，e 為負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維膜的紅外光譜圖，可以看出酰胺 Ⅱ 帶處的峰紅移至 1 532 cm—1，這些結果表明，穩定的二級結構被軟化，這是由于 Zein、黃酮苷中的氨基和羰基基團形成的氫鍵作用減弱導致的，這可以證明藥物與復合纖維具有較好的相容性。
圖2
藥物黃酮苷（a）、Zein（b）、PVA-SbQ（c）、未載藥（d）和負載黃酮苷（e）PVA-SbQ/Zein納米纖維的紅外光譜圖
Figure2.
FTIR of vaccarin (a), Zein (b), PVA-SbQ (c), PVA-SbQ/Zein nanofibers without (d) and with drug drug vaccarin (e)
2.3 生物相容性評價
2.3.1 細胞活性實驗（見圖 3） 傷口愈合的材料必須具有良好的生物相容性，這是材料在特定環境下使用時必須具備的條件[15]。細胞毒性實驗是檢測材料和器械接觸機體組織后生物學反應的體外實驗，它是生物學評價體系中最重要的檢測指標之一[16]。其中，MTT 比色法是定量測定細胞毒性的首選方法之一，可以全面、客觀地反映被測材料對細胞生長及活性的影響，計算細胞 RGR，反映材料的細胞毒性。一般認為，RGR>75% 的生物材料對細胞沒有毒性影響[17]。如圖 3 所示，倒置光學顯微鏡下觀察，L929 細胞在未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維浸提液中均表現為較好的增殖和形貌。同時，未載藥和 PVA-SbQ/Zein/黃酮苷納米纖維 RGR 均>75%，提示未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維均無細胞毒性。表 1 為 PVA-SbQ/Zein 和 PVA-SbQ/Zein/黃酮苷納米纖維不同濃度浸提液在細胞培養 24 h 和 72 h 后的吸光值比較，從表中可看出，細胞培養 24 h 各濃度和培養 72 h 后中濃度的兩組間吸光值差異無統計學意義（P>0.05）。細胞培養 72 h 后，與未載藥組相比，載藥組低濃度組、高濃度組吸光值均有明顯差異（P<0.01），這可能是由于黃酮苷的釋放可以促進細胞增殖，而不同濃度的材料浸提液所釋放的藥物含量為細胞的生長提供了不同的生存條件。
圖3
未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維不同濃度浸提液培養 24 h 和 72 h 鏡下細胞形態圖和 RGR 結果統計
Figure3.
Microphotographs and RGR of L929 cells with different concentrations of extract from PVA-SbQ/Zein nanofibers and PVA-SbQ/Zein/vaccarin nanofibers cultured for 24 h and 72 h respectively
表1
未載藥組與負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維組不同濃度浸提液中細胞 OD 值
Table1.
OD value of PVA-SbQ/Zein nanofibers and PVA-SbQ/Zein/vaccarin nanofibers with different concentrations of DMEM
2.3.2 細胞黏附實驗 未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維對細胞的直接接觸試驗結果如圖 4 所示。左圖為 PVA-SbQ/Zein 納米纖維的細胞黏附掃描電鏡圖，從圖中可以看出細胞黏附生長于纖維表面并呈現良好的形態結構。右圖是 PVA-SbQ/Zein/黃酮苷納米纖維的細胞黏附掃描電鏡圖，可以看出細胞黏附生長于纖維表面，部分已生長于纖維內部，且細胞數量較多，這可能是因為藥物黃酮苷的存在可以促進細胞的黏附生長。
圖4
未載藥和負載黃酮苷 PVA-SbQ/Zein 納米纖維表面細胞的黏附生長掃描電鏡圖
Figure4.
SEM of cell attachment on PVA-SbQ/Zein nano-fibers with and without drug vaccarin
從材料浸提液和直接接觸試驗結果中可以看到未載藥和負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維均具有良好的生物相容性，而負載黃酮苷的納米纖維浸提液中 L929 細胞生長活性更好，細胞黏附生長的數量也更多，可以說明黃酮苷載藥成功并發揮了其藥物釋放的作用，可以作為創傷愈合材料使用[11]。
2.4 動物評價
2.4.1 傷口愈合觀察 圖 5 是小鼠傷口愈合情況大體觀察圖。實驗組（PVA-SbQ/Zein/黃酮苷組）3 天后傷口開始縮小，表面平整、濕潤，創面無分泌物。7 天時實驗組創面明顯縮小，創面干燥，無明顯傷口滲出，傷口邊緣和周圍皮膚組織顏色淺紅、彈性好。對照組（凡士林紗布組）7 天時，當新生組織長入紗布后，直接取出紗布出現傷口的再次損傷。從圖中可看到經去除凡士林紗布的傷口有輕度膿性及血性分泌物黏附。14 天時實驗組出現結痂，傷口基本愈合。
圖5
負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維組（實驗組）與無菌凡士林紗布組（對照組）不同時間肉眼觀察小鼠皮膚傷口愈合
Figure5.
Macroscopic observation of rat skin wound healing by PVA-SbQ/Zein/vaccarin (trial group) and petrolatum gauze (control group)
2.4.2 組織切片觀察 圖 6 是 200 倍顯微鏡下觀察到的小鼠傷口組織切片圖。從圖中可以看到，在第 3 天時，對照組（凡士林紗布組）和實驗組（PVA-SbQ/Zein/黃酮苷組）傷口均有明顯的炎癥反應，中性粒細胞是早期進入損傷部位的主要炎癥細胞。在第 7 天時，從圖中可以明顯看到實驗組出現較多的新生血管和成纖維細胞，創面膠原纖維增生明顯，而對照組也會有新生血管的形成，但相對較少。而在第 14 天時，新生復層扁平上皮，皮下組織致密，膠原纖維出現，纖維結締組織增生，小鼠損傷皮膚已基本愈合[18]。
圖6
負載黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維組（實驗組）與無菌凡士林紗布組（對照組）小鼠損傷皮膚組織切片觀察（HE染色，200×）
Figure6.
Histological observation of skin traumatism by PVA-SbQ/Zein/vaccarin (trial group) and petrolatum gauze (control group) (HE, 200×)
實驗結果表明，實驗組 PVA-SbQ/Zein/黃酮苷納米纖維對小鼠損傷皮膚的愈合效果更好，隨著時間的推移，小鼠傷口周圍細胞、纖維組織和血管逐漸形成。一方面是因為納米纖維結構可以模擬細胞外基質從而促進上皮細胞的增殖和新組織的形成，并且納米纖維的高比表面積和高孔隙度可以促進液體的吸收、細胞的代謝和氣體的滲透從而利于傷口的愈合；另一方面是由于藥物黃酮苷的作用，它可以通過促進內皮細胞的生成和血管新生從而促進創面愈合[4，11]。
3 結論
負載王不留行黃酮苷的 PVA-SbQ/Zein 納米纖維具有良好的生物相容性，對小鼠傷口愈合效果比普通凡士林紗布類敷料好，傷口愈合速度快，說明藥物黃酮苷和納米纖維的結合對傷口愈合有促進作用，且不會對傷口造成再次損傷，是理想的創傷敷料，有望將來用作醫用敷料。
