本研究探索自組裝短肽 GFS-4 在心肌細胞三維培養中的應用效果及其對心肌梗死區域的組織修復作用。通過圓二色譜儀分析短肽 GFS-4 的二級結構，原子力顯微鏡檢測短肽 GFS-4 自組裝的微觀形態。將 GFS-4 自組裝形成的納米纖維支架作為心肌細胞三維培養材料，觀察心肌細胞的生長狀況；建立大鼠心肌梗死模型，加入水凝膠 GFS-4 研究其對心肌梗死修復的效果。結果發現，GFS-4 自組裝形成的二級結構主要為 β 折疊；自組裝 24 h 后形成致密的納米纖維支架；心肌細胞三維培養結果表明心肌細胞在 GFS-4 水凝膠中生長狀況良好；心肌梗死體外修復實驗發現，短肽 GFS-4 水凝膠支架可緩解心肌梗死區域組織壞死。自組裝短肽 GFS-4 作為新的納米支架材料，可用于細胞三維培養和心肌梗死區域組織修復。
引用本文： 陳振銀, 岳媛媛, 張慧楠, 陳春燕, 劉博, 李雪琴, 文靜, 吳書祎, 羅忠禮. 自組裝短肽 GFS-4 作為細胞三維培養及心肌梗死修復支架材料的研究. 生物醫學工程學雜志, 2017, 34(3): 388-393. doi: 10.7507/1001-5515.201605061 復制
引言
心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由冠狀動脈粥樣硬化引發血管堵塞，從而導致部分心肌組織發生缺血性壞死的疾病。臨床上主要采用冠狀動脈介入與搭橋、溶栓治療和心臟移植等治療方法，但仍存在心肌保護措施不完善、心臟移植供體數量不足、移植后排異反應發生率極高等問題。其中，心肌梗死區域組織的有效再生修復是心肌保護措施中的關鍵所在，也是亟待解決的科學問題之一[1-2]。
心肌梗死后，梗死區胞外基質（extracellular matrix，ECM）降解，心室壁變薄，微環境改變，導致細胞生長的微環境惡化[3-4]。因此，添加胞外基質生物支架材料有可能理想地模擬胞外基質的所有功能，在原位修復受損的心肌組織。心肌組織再生修復也依賴于心肌細胞的大量產生。有關研究表明，c-kit+ 心肌細胞可定向分化為心肌細胞，提示其在心肌梗死修復過程中可作為心肌細胞再生的種子細胞。
組織工程相關生物材料的快速發展，為心肌梗死區域組織修復提供了更多更好的生物支架材料。其中，自組裝短肽是一種新興的多功能生物材料，能夠在離子中自組裝形成納米纖維，模擬胞外基質微環境，影響細胞生長、遷移、分化等生物學行為。自組裝短肽在金屬陽離子中可發生自組裝形成納米纖維支架，且能形成水凝膠，與傳統的生物支架材料相比，自組裝短肽有純度高、生物相容性較好、免疫原性小、自組裝形成的支架材料有納米級的結構層次且降解產生的氨基酸易于人體吸收等優勢，所以自組裝短肽可作為新型的生物支架材料從而被深入研究。我們前期研究已建立了手性自組裝短肽研究體系和平臺，在細胞工程、組織工程、快速止血、藥物釋控和創傷修復等領域開展了廣泛研究[5-6]，同時也針對心肌梗死區組織再生修復這一挑戰性的難題，開展了探索研究工作。
本研究團隊選用的自組裝短肽 GFS-4 相對分子質量為 1 791.08，純度為 96.55%，C 端酰胺化，包含 16 個 L 型氨基酸殘基，由兩段含有 8 個相同氨基酸殘基的多肽拼接構成，其氨基酸序列為：Ac-Arg-Leu-Glu-Cys-Lys-Ala-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Cys-Lys-Ala-Asp-Ala-NH2。本文考察了短肽 GFS-4 在離子中的自組裝效果，通過體外實驗研究了原代心肌細胞及其 c-kit+ 心肌細胞在短肽 GFS-4 水凝膠中的三維培養狀況，體內實驗研究了短肽 GFS-4 對動物心肌梗死區域的修復效果等。
1 材料和方法
1.1 實驗材料與試劑
短肽 GFS-4 粉末（Sciobio，中國），高糖 DMEM 培養基（Hyclone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），胰酶（Gibco，美國），Ⅱ型膠原酶（Invitrogen，美國）；磷酸鹽緩沖劑（phosphate buffered saline，PBS）（Hyclone，美國），去離子水，20% 蔗糖溶液；剛果紅染液，HE 染料，BSA 粉末（Genview，美國），兔抗鼠 c-kit 抗體（Santa Cruz Biotechnology，sc-5535，美國），FITC-IgG 羊抗兔二抗（博士德），DAB 試劑盒（中杉金橋）。
1.2 實驗方法
1.2.1 短肽 GFS-4 溶液的配制 稱取 10 mg 短肽凍干粉，溶解于 1 mL 去離子水中，配制成母液于 4 ℃ 保存，取等體積的 PBS 和濃度為 10 mg/mL 短肽母液混合后，可使短肽發生自組裝，且自組裝短肽終濃度為 5 mg/mL。
1.2.2 圓二色譜（circular dichroism，CD）分析短肽 GFS-4 二級結構 采用圓二色譜儀（AVIV 400 CD spectrometer）對濃度為 100 μmol/L 的短肽 GFS-4 溶液進行 CD 檢測，參數設置：掃描波長 190～260 nm，波長間隔 0.5 s，光徑 2 mm。
1.2.3 微觀分析短肽 GFS-4 自組裝效果 將終濃度為 5 mg/mL 的自組裝短肽 GFS-4 在 37 ℃ 自組裝 24 h 后測試，檢測過程中，在云母片表面滴加 10 μL 短肽溶液，室溫放置 1 min，用 PBS 沖洗 3 遍，自然晾干后，原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）（Hitachi SPM400，日本）觀察，掃描模式為敲打模式。
1.2.4 宏觀觀察短肽 GFS-4 自組裝效果 將終濃度為 5 mg/mL 的自組裝短肽 GFS-4 在 37 ℃ 自組裝 24 h，分別在 0、4、12 和 24 h 取 10 μL 短肽溶液滴到載玻片上，剛果紅染色 30 s，普通光學顯微鏡（OLYMPUS IX71，日本）觀察。
1.2.5 原代心肌細胞在水凝膠中生長情況 采用混合酶（胰酶+Ⅱ型膠原酶）消化法提取 Sprague Dawley（SD）乳鼠心肌細胞（10 只乳鼠由重慶醫科大學動物中心提供，手術過程遵守動物實驗國家標準）。將細胞懸浮于 20% 蔗糖溶液中，計數；將細胞懸液與短肽溶液等體積混合，形成短肽水凝膠，在 96 孔板中滴加 50 μL 細胞混合液，并確定每孔細胞量為 1.5×104 個；靜止 15 min 后，加入 100 μL 培養液（90% 高糖 DMEM 培養基+10% 胎牛血清）。在 96 孔板每孔中加入約 1.5×104 個細胞并補加培養液到 150 μL 作為細胞二維培養對照，細胞活性用 Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測，酶標儀測試。
1.2.6 c-kit+ 心肌細胞在水凝膠中生長分析 將 1.2.5 中生長在水凝膠第 7 天的心肌細胞，用 PBS 小心洗 3 次，每次 5 min；4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；5% BSA 封閉，4 ℃ 過夜，吸出封閉液；滴加 80 μL 稀釋比為 1∶50 的 c-kit 兔抗鼠一抗，4℃ 孵育過夜，吸出一抗，PBS 洗 5 次，每次 2 h，最后在 PBS 中靜止，4℃ 過夜；吸出 PBS，滴加 80 μL 稀釋比為 1∶50 的 FITC 標記羊抗兔 IgG 二抗，避光室溫孵育 4 h，吸出二抗，PBS 洗 5 次，每次 2 h，最后在 PBS 中避光靜止，4℃ 過夜；吸出 PBS，滴加 50 μL DAPI 染液，避光室溫孵育 30 min，PBS 洗 3 次，每次 10 min；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71，日本）觀察。在二維對照組中免疫熒光實驗方法與上述步驟相同，只是 PBS 清洗時間由 2 h 縮短到 3 min。
1.2.7 建立心肌梗死修復模型 取體重約 250 g Sprague Dawley（SD）大鼠（24 只，雌雄各 12 只，重慶醫科大學動物中心提供，手術過程遵守動物實驗國家標準），左冠狀動脈降支結扎，建立心肌梗死修復模型，在結扎部位心肌層微量注射 20 μL 新配制的 500 μmol/L 短肽溶液，對照組注射等量生理鹽水。在術后第 1、7 和 12 天，獲取心肌梗死區域心肌組織，在福爾馬林中固定 48 h 后石蠟包埋，切片做蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，普通光學顯微鏡拍照觀察。
1.2.8 免疫組化分析 c-kit+ 心肌細胞分布情況 取 1.2.7 中術后第 1、7 和 12 天的石蠟切片，石蠟切片脫蠟后，蒸餾水沖洗 2 次，檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復，PBS 清洗 3 次，每次 3 min；滴加 50 μL 濃度為 3% 的 H2O2，室溫孵育 20 min，PBS 清洗 3 次，每次 3 min；滴加 50 μL 10% BSA 溶液，37℃ 封閉 30 min，吸出溶液；滴加 50 μL 稀釋比為 1∶50 的 c-kit 兔抗鼠一抗，4℃ 過夜孵育，PBS 洗 3 次，每次 2 min；滴加 50 μL 羊抗兔二抗，37 ℃ 孵育 1 h，PBS 清洗 3 次，每次 3 min；滴加 50 μL 鏈霉素-過氧化物酶，37 ℃ 孵育 30 min，PBS 清洗 3 次，每次 3 min；DAB 顯色 10 min，PBS 洗 3 次，每次 2 min；蘇木素復染 1 min，水洗 5 次，烘干表面水分，脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片；普通光學顯微鏡拍照觀察。
1.2.9 統計學分析 實驗結果采用 t 檢驗進行數據分析，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 短肽 GFS-4 二級結構特征
經過 CD 分析，自組裝短肽 GFS-4 在 37 ℃ 下的二級結構是在 190～212 nm 呈下降趨勢，在 212 nm 處有一強負峰，以后平穩上升趨于穩定（見圖 1）。結果表明，自組裝短肽 GFS-4 的二級結構主要為 β 折疊。
圖1
37 ℃ 下短肽 GFS-4 的圓二色譜圖
Figure1.
CD spectra of peptide GFS-4 at 37 ℃
2.2 短肽 GFS-4 自組裝形態及其效果
自組裝短肽 GFS-4 在鹽離子中進行自組裝，原子力顯微鏡結果顯示，500 μmol/L 的短肽溶液在鹽離子中自組裝 24 h 后，形成納米纖維（見圖 2a）。剛果紅染色動態觀察自組裝短肽宏觀自組裝過程，500 μmol/L 的短肽溶液在鹽離子中開始自組裝時形成多層薄膜（見圖 2b）；自組裝 4 h 后，形成片狀松散薄膜（見圖 2c）；12 h 后，片狀薄膜厚度有所增加，同時片狀薄膜相互連接（見圖 2d）；24 h 后，短肽形成單層較為致密的膜狀結構（見圖 2e）。
圖2
37 ℃ 下短肽 GFS-4 的自組裝效果
a. GFS-4 短肽在鹽離子中自組裝 24 h 后的原子力顯微鏡圖；b-e. 分別為自組裝 0、4、12、24 h 的 GFS-4 水凝膠剛果紅染色圖（圖中標尺=200 μm）
Figure2. Self-assembling effect of peptide GFS-4 at 37 ℃a. AFM image of peptide GFS-4 in salt ion after 24 h; b-e. typical images of hydrogel GFS-4 self-assembling at 0, 4, 12, 24 h, respectively (bar=200 μm)
2.3 GFS-4 水凝膠原代心肌細胞三維培養
在傳統二維原代心肌細胞培養過程中發現，心肌細胞呈長梭形（見圖 3），細胞與細胞之間相互連接，成片搏動。原代心肌細胞在 GFS-4 水凝膠中生長良好，絕大部分細胞呈圓球形，邊界清晰，部分心肌細胞在 GFS-4 水凝膠中自律性搏動。連續培養 5 d，CCK-8 檢測發現，在細胞鋪板初期，心肌細胞在 GFS-4 水凝膠中活性略低于二維培養中細胞活性，隨著培養時間的延長，心肌細胞在三維環境中的細胞活性逐漸高于二維環境中的細胞活性（見圖 4）。該結果表明，心肌細胞可在 GFS-4 形成的三維支架中生長，且狀態良好。
圖3
原代心肌細胞在 GFS-4 三維支架和傳統二維培養中的倒置顯微鏡圖
Figure3.
Inverted microscope images of cardiac cell cultured in GFS-4 micro-environment of three-dimensional scaffolds and traditional two-dimensional cell culture model
圖4
心肌細胞在 GFS-4 溶液中的細胞活性實驗（*P<0.05）
Figure4.
Activity tests of myocardial cells in GFS-4 solution (*P<0.05)
2.4 GFS-4 水凝膠對體外 c-kit+ 心肌細胞的影響
在體外細胞培養實驗中，熒光倒置顯微鏡觀察發現，GFS-4 水凝膠存在 c-kit+ 心肌細胞，而 c-kit+ 心肌細胞數量略少于傳統二維體系中 c-kit+ 心肌細胞的數量（見圖 5）；結果表明，c-kit+ 心肌細胞能在水凝膠中較好地生長。
圖5
c-kit+ 心肌細胞免疫熒光圖（×400，圖中標尺=50 μm）
Figure5.
Immunofluorescence of c-kit+ cardiac cell (×400, bar=50 μm)
2.5 GFS-4 水凝膠對心肌梗死區的修復作用
在動物心肌梗死修復實驗中，通過HE染色發現：在手術后的 1～7 d 內，對照組與實驗組的梗死面積不嚴重，且沒有太大差別；在第 12 天時，對照組的梗死面積擴大明顯，心肌組織空泡化嚴重，結構疏松，心室壁變薄，而實驗組中新生血管增多，膠原沉淀減少，心肌結構排列相對有序，沒有出現嚴重空泡化（見圖 6）。
圖6
大鼠心肌梗死區域HE染色圖（×200，圖中標尺=100 μm）
Figure6.
HE stain of rat myocardial infarction area (×200, bar=100 μm)
2.6 GFS-4 水凝膠對心肌梗死區 c-kit+ 心肌細胞的作用
在心肌梗死修復實驗中，實驗組注射 GFS-4 短肽溶液，對照組注射等量生理鹽水。結果發現（見圖 7、8），手術后的第 1 天，GFS-4 組和對照組中，心臟中的 c-kit+ 心肌細胞數量均較少，但 GFS-4 組中 c-kit+ 心肌細胞比值明顯高于對照組；在第 7 天和 12 天可以明顯看到 GFS-4 組中的 c-kit+ 心肌細胞數量增多，且 c-kit+ 心肌細胞比值高于對照組。
圖7
心肌梗死區域 c-kit+ 心肌細胞免疫組化圖（×200，圖中標尺=100 μm）
Figure7.
Immunohistochemical stain of c-kit+ cardiac cell in myocardial infarction area (×200, bar=100 μm)
圖8
心肌梗死區域 c-kit+ 心肌細胞比值（*P<0.05）
Figure8.
Ratio of c-kit+ cardiac cell in myocardial infarction area (*P<0.05)
3 討論
心肌梗死是一種對人類健康有嚴重危害的重大疾病，而往往經過手術治療后幸存的患者，其心肌組織微環境發生較大改變，最終導致心功能逐步地惡化。如何限制心肌梗死區周圍的受損組織區域不再擴大，以及如何修復心肌梗死組織和改善心功能已成為醫學難題。近幾年，越來越多的生物醫學材料對心肌梗死的治療相繼得到報道，而傳統生物材料與人體內的細胞外微環境相差甚遠，部分生物材料的降解產物還有可能引發炎癥反應等問題。而自組裝短肽由于其自組裝形成的納米纖維支架可較好地模擬體內細胞外微環境，且其降解產物為氨基酸，有利于人體吸收和排放，與傳統生物醫學材料相比有一定優勢[7-10]。
本文所研究的自組裝短肽 GFS-4，其在 37 ℃ 下的二級結構主要為 β 折疊；在鹽離子中可自組裝形成網狀納米纖維支架結構，其形成的水凝膠支架可以模擬細胞外基質，也可以作為細胞三維培養的生物材料，能夠為 c-kit+ 心肌細胞的生長及其增殖提供較好的微環境；在心肌梗死修復過程中，研究發現自組裝短肽 GFS-4 可以較好地延緩心肌梗死區域細胞的死亡，能促進部分新生血管的形成，并使 c-kit+ 心肌細胞在梗死區域保持較強的存留趨勢。
本研究屬于交叉學科的前沿領域，以自組裝短肽納米材料為載體，探索尋找對心肌梗死組織再生修復的有效辦法和策略。由于臨床上能快速檢測到梗死區域，也存在治療心肌梗死的黃金時間點，且給藥途徑、技術和器械設備較成熟。本基礎研究成果可能服務于臨床實踐，具有潛在的應用前景，也拓寬了對心肌梗死區組織再生修復過程的認識，為臨床治療提供更多的理論基礎和實驗依據，有非常重要的科學意義和研究價值。
引言
心肌梗死（myocardial infarction，MI）是由冠狀動脈粥樣硬化引發血管堵塞，從而導致部分心肌組織發生缺血性壞死的疾病。臨床上主要采用冠狀動脈介入與搭橋、溶栓治療和心臟移植等治療方法，但仍存在心肌保護措施不完善、心臟移植供體數量不足、移植后排異反應發生率極高等問題。其中，心肌梗死區域組織的有效再生修復是心肌保護措施中的關鍵所在，也是亟待解決的科學問題之一[1-2]。
心肌梗死后，梗死區胞外基質（extracellular matrix，ECM）降解，心室壁變薄，微環境改變，導致細胞生長的微環境惡化[3-4]。因此，添加胞外基質生物支架材料有可能理想地模擬胞外基質的所有功能，在原位修復受損的心肌組織。心肌組織再生修復也依賴于心肌細胞的大量產生。有關研究表明，c-kit+ 心肌細胞可定向分化為心肌細胞，提示其在心肌梗死修復過程中可作為心肌細胞再生的種子細胞。
組織工程相關生物材料的快速發展，為心肌梗死區域組織修復提供了更多更好的生物支架材料。其中，自組裝短肽是一種新興的多功能生物材料，能夠在離子中自組裝形成納米纖維，模擬胞外基質微環境，影響細胞生長、遷移、分化等生物學行為。自組裝短肽在金屬陽離子中可發生自組裝形成納米纖維支架，且能形成水凝膠，與傳統的生物支架材料相比，自組裝短肽有純度高、生物相容性較好、免疫原性小、自組裝形成的支架材料有納米級的結構層次且降解產生的氨基酸易于人體吸收等優勢，所以自組裝短肽可作為新型的生物支架材料從而被深入研究。我們前期研究已建立了手性自組裝短肽研究體系和平臺，在細胞工程、組織工程、快速止血、藥物釋控和創傷修復等領域開展了廣泛研究[5-6]，同時也針對心肌梗死區組織再生修復這一挑戰性的難題，開展了探索研究工作。
本研究團隊選用的自組裝短肽 GFS-4 相對分子質量為 1 791.08，純度為 96.55%，C 端酰胺化，包含 16 個 L 型氨基酸殘基，由兩段含有 8 個相同氨基酸殘基的多肽拼接構成，其氨基酸序列為：Ac-Arg-Leu-Glu-Cys-Lys-Ala-Asp-Ala-Arg-Leu-Glu-Cys-Lys-Ala-Asp-Ala-NH2。本文考察了短肽 GFS-4 在離子中的自組裝效果，通過體外實驗研究了原代心肌細胞及其 c-kit+ 心肌細胞在短肽 GFS-4 水凝膠中的三維培養狀況，體內實驗研究了短肽 GFS-4 對動物心肌梗死區域的修復效果等。
1 材料和方法
1.1 實驗材料與試劑
短肽 GFS-4 粉末（Sciobio，中國），高糖 DMEM 培養基（Hyclone，美國），胎牛血清（Gibco，美國），胰酶（Gibco，美國），Ⅱ型膠原酶（Invitrogen，美國）；磷酸鹽緩沖劑（phosphate buffered saline，PBS）（Hyclone，美國），去離子水，20% 蔗糖溶液；剛果紅染液，HE 染料，BSA 粉末（Genview，美國），兔抗鼠 c-kit 抗體（Santa Cruz Biotechnology，sc-5535，美國），FITC-IgG 羊抗兔二抗（博士德），DAB 試劑盒（中杉金橋）。
1.2 實驗方法
1.2.1 短肽 GFS-4 溶液的配制 稱取 10 mg 短肽凍干粉，溶解于 1 mL 去離子水中，配制成母液于 4 ℃ 保存，取等體積的 PBS 和濃度為 10 mg/mL 短肽母液混合后，可使短肽發生自組裝，且自組裝短肽終濃度為 5 mg/mL。
1.2.2 圓二色譜（circular dichroism，CD）分析短肽 GFS-4 二級結構 采用圓二色譜儀（AVIV 400 CD spectrometer）對濃度為 100 μmol/L 的短肽 GFS-4 溶液進行 CD 檢測，參數設置：掃描波長 190～260 nm，波長間隔 0.5 s，光徑 2 mm。
1.2.3 微觀分析短肽 GFS-4 自組裝效果 將終濃度為 5 mg/mL 的自組裝短肽 GFS-4 在 37 ℃ 自組裝 24 h 后測試，檢測過程中，在云母片表面滴加 10 μL 短肽溶液，室溫放置 1 min，用 PBS 沖洗 3 遍，自然晾干后，原子力顯微鏡（atomic force microscope，AFM）（Hitachi SPM400，日本）觀察，掃描模式為敲打模式。
1.2.4 宏觀觀察短肽 GFS-4 自組裝效果 將終濃度為 5 mg/mL 的自組裝短肽 GFS-4 在 37 ℃ 自組裝 24 h，分別在 0、4、12 和 24 h 取 10 μL 短肽溶液滴到載玻片上，剛果紅染色 30 s，普通光學顯微鏡（OLYMPUS IX71，日本）觀察。
1.2.5 原代心肌細胞在水凝膠中生長情況 采用混合酶（胰酶+Ⅱ型膠原酶）消化法提取 Sprague Dawley（SD）乳鼠心肌細胞（10 只乳鼠由重慶醫科大學動物中心提供，手術過程遵守動物實驗國家標準）。將細胞懸浮于 20% 蔗糖溶液中，計數；將細胞懸液與短肽溶液等體積混合，形成短肽水凝膠，在 96 孔板中滴加 50 μL 細胞混合液，并確定每孔細胞量為 1.5×104 個；靜止 15 min 后，加入 100 μL 培養液（90% 高糖 DMEM 培養基+10% 胎牛血清）。在 96 孔板每孔中加入約 1.5×104 個細胞并補加培養液到 150 μL 作為細胞二維培養對照，細胞活性用 Cell Counting Kit-8（CCK-8）檢測，酶標儀測試。
1.2.6 c-kit+ 心肌細胞在水凝膠中生長分析 將 1.2.5 中生長在水凝膠第 7 天的心肌細胞，用 PBS 小心洗 3 次，每次 5 min；4% 多聚甲醛固定 30 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；5% BSA 封閉，4 ℃ 過夜，吸出封閉液；滴加 80 μL 稀釋比為 1∶50 的 c-kit 兔抗鼠一抗，4℃ 孵育過夜，吸出一抗，PBS 洗 5 次，每次 2 h，最后在 PBS 中靜止，4℃ 過夜；吸出 PBS，滴加 80 μL 稀釋比為 1∶50 的 FITC 標記羊抗兔 IgG 二抗，避光室溫孵育 4 h，吸出二抗，PBS 洗 5 次，每次 2 h，最后在 PBS 中避光靜止，4℃ 過夜；吸出 PBS，滴加 50 μL DAPI 染液，避光室溫孵育 30 min，PBS 洗 3 次，每次 10 min；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS IX71，日本）觀察。在二維對照組中免疫熒光實驗方法與上述步驟相同，只是 PBS 清洗時間由 2 h 縮短到 3 min。
1.2.7 建立心肌梗死修復模型 取體重約 250 g Sprague Dawley（SD）大鼠（24 只，雌雄各 12 只，重慶醫科大學動物中心提供，手術過程遵守動物實驗國家標準），左冠狀動脈降支結扎，建立心肌梗死修復模型，在結扎部位心肌層微量注射 20 μL 新配制的 500 μmol/L 短肽溶液，對照組注射等量生理鹽水。在術后第 1、7 和 12 天，獲取心肌梗死區域心肌組織，在福爾馬林中固定 48 h 后石蠟包埋，切片做蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，普通光學顯微鏡拍照觀察。
1.2.8 免疫組化分析 c-kit+ 心肌細胞分布情況 取 1.2.7 中術后第 1、7 和 12 天的石蠟切片，石蠟切片脫蠟后，蒸餾水沖洗 2 次，檸檬酸鹽緩沖液進行抗原修復，PBS 清洗 3 次，每次 3 min；滴加 50 μL 濃度為 3% 的 H2O2，室溫孵育 20 min，PBS 清洗 3 次，每次 3 min；滴加 50 μL 10% BSA 溶液，37℃ 封閉 30 min，吸出溶液；滴加 50 μL 稀釋比為 1∶50 的 c-kit 兔抗鼠一抗，4℃ 過夜孵育，PBS 洗 3 次，每次 2 min；滴加 50 μL 羊抗兔二抗，37 ℃ 孵育 1 h，PBS 清洗 3 次，每次 3 min；滴加 50 μL 鏈霉素-過氧化物酶，37 ℃ 孵育 30 min，PBS 清洗 3 次，每次 3 min；DAB 顯色 10 min，PBS 洗 3 次，每次 2 min；蘇木素復染 1 min，水洗 5 次，烘干表面水分，脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片；普通光學顯微鏡拍照觀察。
1.2.9 統計學分析 實驗結果采用 t 檢驗進行數據分析，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 短肽 GFS-4 二級結構特征
經過 CD 分析，自組裝短肽 GFS-4 在 37 ℃ 下的二級結構是在 190～212 nm 呈下降趨勢，在 212 nm 處有一強負峰，以后平穩上升趨于穩定（見圖 1）。結果表明，自組裝短肽 GFS-4 的二級結構主要為 β 折疊。
圖1
37 ℃ 下短肽 GFS-4 的圓二色譜圖
Figure1.
CD spectra of peptide GFS-4 at 37 ℃
2.2 短肽 GFS-4 自組裝形態及其效果
自組裝短肽 GFS-4 在鹽離子中進行自組裝，原子力顯微鏡結果顯示，500 μmol/L 的短肽溶液在鹽離子中自組裝 24 h 后，形成納米纖維（見圖 2a）。剛果紅染色動態觀察自組裝短肽宏觀自組裝過程，500 μmol/L 的短肽溶液在鹽離子中開始自組裝時形成多層薄膜（見圖 2b）；自組裝 4 h 后，形成片狀松散薄膜（見圖 2c）；12 h 后，片狀薄膜厚度有所增加，同時片狀薄膜相互連接（見圖 2d）；24 h 后，短肽形成單層較為致密的膜狀結構（見圖 2e）。
圖2
37 ℃ 下短肽 GFS-4 的自組裝效果
a. GFS-4 短肽在鹽離子中自組裝 24 h 后的原子力顯微鏡圖；b-e. 分別為自組裝 0、4、12、24 h 的 GFS-4 水凝膠剛果紅染色圖（圖中標尺=200 μm）
Figure2. Self-assembling effect of peptide GFS-4 at 37 ℃a. AFM image of peptide GFS-4 in salt ion after 24 h; b-e. typical images of hydrogel GFS-4 self-assembling at 0, 4, 12, 24 h, respectively (bar=200 μm)
2.3 GFS-4 水凝膠原代心肌細胞三維培養
在傳統二維原代心肌細胞培養過程中發現，心肌細胞呈長梭形（見圖 3），細胞與細胞之間相互連接，成片搏動。原代心肌細胞在 GFS-4 水凝膠中生長良好，絕大部分細胞呈圓球形，邊界清晰，部分心肌細胞在 GFS-4 水凝膠中自律性搏動。連續培養 5 d，CCK-8 檢測發現，在細胞鋪板初期，心肌細胞在 GFS-4 水凝膠中活性略低于二維培養中細胞活性，隨著培養時間的延長，心肌細胞在三維環境中的細胞活性逐漸高于二維環境中的細胞活性（見圖 4）。該結果表明，心肌細胞可在 GFS-4 形成的三維支架中生長，且狀態良好。
圖3
原代心肌細胞在 GFS-4 三維支架和傳統二維培養中的倒置顯微鏡圖
Figure3.
Inverted microscope images of cardiac cell cultured in GFS-4 micro-environment of three-dimensional scaffolds and traditional two-dimensional cell culture model
圖4
心肌細胞在 GFS-4 溶液中的細胞活性實驗（*P<0.05）
Figure4.
Activity tests of myocardial cells in GFS-4 solution (*P<0.05)
2.4 GFS-4 水凝膠對體外 c-kit+ 心肌細胞的影響
在體外細胞培養實驗中，熒光倒置顯微鏡觀察發現，GFS-4 水凝膠存在 c-kit+ 心肌細胞，而 c-kit+ 心肌細胞數量略少于傳統二維體系中 c-kit+ 心肌細胞的數量（見圖 5）；結果表明，c-kit+ 心肌細胞能在水凝膠中較好地生長。
圖5
c-kit+ 心肌細胞免疫熒光圖（×400，圖中標尺=50 μm）
Figure5.
Immunofluorescence of c-kit+ cardiac cell (×400, bar=50 μm)
2.5 GFS-4 水凝膠對心肌梗死區的修復作用
在動物心肌梗死修復實驗中，通過HE染色發現：在手術后的 1～7 d 內，對照組與實驗組的梗死面積不嚴重，且沒有太大差別；在第 12 天時，對照組的梗死面積擴大明顯，心肌組織空泡化嚴重，結構疏松，心室壁變薄，而實驗組中新生血管增多，膠原沉淀減少，心肌結構排列相對有序，沒有出現嚴重空泡化（見圖 6）。
圖6
大鼠心肌梗死區域HE染色圖（×200，圖中標尺=100 μm）
Figure6.
HE stain of rat myocardial infarction area (×200, bar=100 μm)
2.6 GFS-4 水凝膠對心肌梗死區 c-kit+ 心肌細胞的作用
在心肌梗死修復實驗中，實驗組注射 GFS-4 短肽溶液，對照組注射等量生理鹽水。結果發現（見圖 7、8），手術后的第 1 天，GFS-4 組和對照組中，心臟中的 c-kit+ 心肌細胞數量均較少，但 GFS-4 組中 c-kit+ 心肌細胞比值明顯高于對照組；在第 7 天和 12 天可以明顯看到 GFS-4 組中的 c-kit+ 心肌細胞數量增多，且 c-kit+ 心肌細胞比值高于對照組。
圖7
心肌梗死區域 c-kit+ 心肌細胞免疫組化圖（×200，圖中標尺=100 μm）
Figure7.
Immunohistochemical stain of c-kit+ cardiac cell in myocardial infarction area (×200, bar=100 μm)
圖8
心肌梗死區域 c-kit+ 心肌細胞比值（*P<0.05）
Figure8.
Ratio of c-kit+ cardiac cell in myocardial infarction area (*P<0.05)
3 討論
心肌梗死是一種對人類健康有嚴重危害的重大疾病，而往往經過手術治療后幸存的患者，其心肌組織微環境發生較大改變，最終導致心功能逐步地惡化。如何限制心肌梗死區周圍的受損組織區域不再擴大，以及如何修復心肌梗死組織和改善心功能已成為醫學難題。近幾年，越來越多的生物醫學材料對心肌梗死的治療相繼得到報道，而傳統生物材料與人體內的細胞外微環境相差甚遠，部分生物材料的降解產物還有可能引發炎癥反應等問題。而自組裝短肽由于其自組裝形成的納米纖維支架可較好地模擬體內細胞外微環境，且其降解產物為氨基酸，有利于人體吸收和排放，與傳統生物醫學材料相比有一定優勢[7-10]。
本文所研究的自組裝短肽 GFS-4，其在 37 ℃ 下的二級結構主要為 β 折疊；在鹽離子中可自組裝形成網狀納米纖維支架結構，其形成的水凝膠支架可以模擬細胞外基質，也可以作為細胞三維培養的生物材料，能夠為 c-kit+ 心肌細胞的生長及其增殖提供較好的微環境；在心肌梗死修復過程中，研究發現自組裝短肽 GFS-4 可以較好地延緩心肌梗死區域細胞的死亡，能促進部分新生血管的形成，并使 c-kit+ 心肌細胞在梗死區域保持較強的存留趨勢。
本研究屬于交叉學科的前沿領域，以自組裝短肽納米材料為載體，探索尋找對心肌梗死組織再生修復的有效辦法和策略。由于臨床上能快速檢測到梗死區域，也存在治療心肌梗死的黃金時間點，且給藥途徑、技術和器械設備較成熟。本基礎研究成果可能服務于臨床實踐，具有潛在的應用前景，也拓寬了對心肌梗死區組織再生修復過程的認識，為臨床治療提供更多的理論基礎和實驗依據，有非常重要的科學意義和研究價值。
