本文主要研究腫瘤壞死因子-α（TNF-α）對圓錐角膜成纖維細胞基質金屬蛋白酶（MMPs）及其抑制劑（TIMPs）表達的影響。利用酶消化法提取正常角膜和圓錐角膜成纖維細胞并對其施加不同濃度的TNF-α作用，通過蛋白質印跡法和實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應分別檢測細胞上清夜中MMPs蛋白和細胞中TIMPs基因的表達。結果發現圓錐角膜成纖維細胞上清液中存在MMP1的活性形式，且TNF-α能使之表達上調；TNF-α能促進圓錐角膜成纖維細胞MMP2、MMP3、MMP9表達，但使其TIMP1、TIMP2表達降低。TNF-α可能通過調節MMPs和TIMPs的表達在圓錐角膜的發生發展中起著重要的作用。
引用本文： 馮鵬飛, 李曉娜, 陳維毅, 賀瑞, 王曉君. 腫瘤壞死因子對圓錐角膜成纖維細胞基質金屬蛋白酶及其抑制劑表達的影響. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(6): 1139-1144. doi: 10.7507/1001-5515.20160181 復制
引言
圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種慢性非對稱性眼部疾病，常發于青春期，臨床表現為角膜進行性變薄、擴張，向前凸起呈圓錐狀[1-3]。圓錐角膜的發生機制尚不明確，研究表明可能與遺傳和環境因素有關[4-5]，有文獻報道炎性因子可能參與了圓錐角膜的發生和發展[6-7]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作為炎性因子在干眼癥、角膜潰瘍等眼科疾病中起著重要的作用[8-9]，研究發現圓錐角膜患者淚液中TNF-α的含量顯著升高[10-13]，且圓錐角膜上皮細胞中TNF-α的表達上調[14]，但TNF-α在圓錐角膜發生過程中的作用尚不明確。
基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類活性依賴于鋅離子的蛋白水解酶，幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分[15]。基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs)作為MMPs的天然抑制劑，兩者共同作用維持細胞外基質的動態平衡[16-17]。研究發現在圓錐角膜組織中MMPs表達升高，TIMPs表達降低，動態平衡遭到破壞[18-19]。此外，體外培養的圓錐角膜成纖維細胞MMP1、MMP2、MMP9表達升高[20]，然而炎性因子TNF-α對圓錐角膜成纖維細胞MMPs和TIMPs表達的影響尚未報道。本文的主要目的是研究TNF-α對離體培養的圓錐角膜成纖維細胞MMPs和TIMPs表達的影響。
1 材料與方法
1.1 角膜成纖維細胞的提取及培養
圓錐角膜取自患者進行角膜移植術后廢棄的角膜組織，正常角膜(normal cornea，NC)取自角膜移植手術供體切去大視區后的角膜組織環，均來源于山西省眼科醫院。把得到的正常角膜和圓錐角膜分別置于含慶大霉素的磷酸鹽緩沖液中浸泡30 min，機械剝離掉角膜上皮層和內皮層，將剩余基質層用磷酸鹽緩沖液沖洗三次，然后剪碎加入含1 mg/mL Ⅱ型膠原酶的改良Eagle培養液(Dulbecco’s Modified Eagle Media: Nutrient Mixture F-12,DMEM/F12)(Hyclone,美國)，置于37 ℃二氧化碳培養箱進行消化。待組織塊消化完全后，2 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco,美國)體積分數為10%的DMEM/F12培養液，置于37 ℃二氧化碳培養箱繼續培養，細胞融合達80%時進行傳代。
1.2 TNF-α處理角膜成纖維細胞
取傳代至第三代的正常和圓錐角膜成纖維細胞以2×105個/mL的密度接種于六孔培養板，待細胞貼壁后換成含1% FBS的DMEM/F12培養液饑餓處理24 h，加入重組人TNF-α(Peprotech,美國)濃度分別為0、10、100 ng/mL的10% FBS DMEM/F12培養液繼續培養12 h。未加TNF-α處理的正常和圓錐角膜成纖維細胞分別作為各自的對照組。
1.3 蛋白質印跡法檢測MMPs的蛋白表達
細胞培養12 h后，收集細胞上清液，用以檢測細胞分泌的MMPs蛋白表達。磷酸鹽緩沖液沖洗細胞一次，加入蛋白裂解液(碧云天,中國)，至冰上充分裂解，刮取裂解蛋白于離心管中4 ℃離心，取上清為細胞蛋白，用以檢測細胞中甘油醛-3-磷酸脫氨酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的蛋白表達。
用蛋白定量試劑盒(C503021,生工,上海)分別對細胞上清液和細胞蛋白進行定量、分類。將分裝后的細胞培養上清液和細胞蛋白變性后直接進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，無需進行蛋白濃縮，濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和8%。電泳完畢后將膠上蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美國)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜，用含Tween-20的Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜5次(5 min/次)，加入二抗室溫孵育2 h，洗膜5次(5 min/次)，加入化學發光試劑后暗盒曝光。實驗中所選一抗為MMP1(MAB3307,Millipore,美國)、MMP2(ab80737,Abcam,英國)、MMP3(ab17790,Abcam,英國)、MMP9(ab3159,Abcam,英國)、GAPDH(BM1623,博士德,中國)，稀釋比例分別為1/1 000、 1/1 000、 1/1 000、 1/1 000、 1/100； 二抗(ab6789,Abcam,英國)，稀釋比例1/7 000。 選取GAPDH為內參校正。
1.4 實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應檢測TIMPs基因的表達
收集各組細胞，加入Trizol(D9108A,Takara,大連)提取總RNA，用反轉錄試劑盒(RR047A,Takara,大連)將RNA反轉錄成與其互補的單鏈DNA。用實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應儀(Steponeplus,ABI,美國)檢測TIMPs基因的表達。檢測基因的引物序列為：GAPDH上游序列為5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游序列為5′-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3′；TIMP1上游序列為5′-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3′，下游序列為5′-GGTATAAGGTGGTCTGGTTGA-CT-3′；TIMP2上游序列為5′-CCACCCAGAA-GAAGAGCCTGA-3′，下游序列為5′-GTGACCC-AGTCCATCCAGAG-3′，以GAPDH作為內參對目的基因進行校正。實驗選用的反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸 30 s，共40個循環。
1.5 統計學分析
用圖像分析軟件Image-pro 5.1對蛋白條帶進行灰度分析，結果以均數±標準差(x±s)表示。用SPSS19.0統計軟件在組內進行單因素方差分析，兩組間采用t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 TNF-α對角膜成纖維細胞MMPs蛋白表達的影響
利用蛋白質印跡法對角膜成纖維細胞上清液中MMPs的蛋白檢測結果如圖 1所示。TNF-α能使正常角膜成纖維細胞上清液中MMP1的表達升高，而使圓錐角膜成纖維細胞上清液中MMP1的表達降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。在圓錐角膜成纖維細胞上清液中能檢測到MMP1的活性形式，其表達能被TNF-α上調 (P＜0.05)。TNF-α使正常角膜和圓錐角膜成纖維細胞上清液中MMP2、MMP3、MMP9的表達升高，且在相同濃度下圓錐角膜成纖維細胞上清液MMP2、MMP3、MMP9的表達高于正常角膜，差異具有統計學意義(P＜0.05)。
圖1
TNF-α對角膜成纖維細胞上清液中MMPs蛋白表達的影響
*
*
2.2 TNF-α對角膜成纖維細胞TIMPs基因表達的影響
利用實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應儀對角膜成纖維細胞TIMPs基因的檢測結果如圖 2所示。TNF-α使正常角膜成纖維細胞TIMP1的表達升高，而使圓錐角膜成纖維TIMP1的表達降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。當TNF-α濃度為0 ng/mL時，圓錐角膜成纖維細胞TIMP1的表達高于正常角膜成纖維細胞(P＜0.05)；當TNF-α濃度為10 ng/mL和100 ng/mL時，圓錐角膜成纖維細胞TIMP1的表達低于正常角膜成纖維細胞(P＜0.05)。TNF-α使正常角膜和圓錐角膜成纖維細胞TIMP2的表達都降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。
圖2
TNF-α對角膜成纖維細胞TIMPs基因表達的影響
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3 討論
本文通過對正常角膜和圓錐角膜成纖維細胞施加不同濃度的TNF-α刺激，研究了角膜成纖維細胞上清液中MMPs蛋白表達和細胞中TIMPs基因表達的變化。結果發現在圓錐角膜成纖維細胞的上清液中存在MMP1的活性形式，TNF-α能使之表達上調。角膜基質層占整個角膜厚度的90%以上[21]，主要由Ⅰ型膠原組成[22]，MMP1表達上調將導致Ⅰ型膠原的降解增加。Mackiewicz等[23]在圓錐角膜的免疫組化中也發現MMP1表達升高。IL-6可能介導了TNF-α引起的圓錐角膜成纖維細胞MMP1的升高[24]。同時本文發現TNF-α能促進角膜成纖維細胞MMP2、MMP3、MMP9表達升高，在前交叉韌帶成纖維細胞、牙周膜成纖維細胞、視網膜色素上皮細胞等其他類型的細胞中也存在類似的情況[25-27]。MMP2、MMP9又稱為明膠酶，可以降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原[15, 28]，MMP2、MMP9的表達升高將會導致Ⅳ型膠原降解增多。Ⅳ型膠原是基底膜的主要成分[22]，在臨床上發現圓錐角膜患者的基底膜遭受破壞[29]。在圓錐角膜組織中也發現MMP2、MMP9表達升高[19, 30]。MMP3雖不能直接降解膠原，但可以通過調節MMP9的表達來發揮作用[31]。Shetty等[32]發現對圓錐角膜患者用環孢霉素A治療可以減少炎癥反應，降低淚液中MMP9的含量，并延緩圓錐角膜的發生。因此如果通過控制炎癥反應來降低MMPs的表達，可為延緩圓錐角膜的發展提供新的方向。
細胞外基質的分解在細胞外基質重塑中起著關鍵的作用，而該分解過程的實現需要MMPs/TIMPs的精確調控[33]，MMPs/TIMPs失衡將導致細胞外基質的降解[34]。我們的研究發現，相同濃度TNF-α作用下，圓錐角膜成纖維細胞MMPs的表達明顯高于正常角膜，TIMPs的表達隨TNF-α濃度的升高而降低。這將使圓錐角膜成纖維細胞對MMPs的抑制作用減弱，細胞外基質降解增多。Ihalainen等[20]在離體培養的圓錐角膜細胞中發現MMP1、MMP2、MMP9的表達升高。Smith等[18]也發現圓錐角膜成纖維細胞TIMP1的表達升高，本文結果與之前研究報道相符。
綜上所述，TNF-α能促進圓錐角膜成纖維細胞MMPs的表達，而使其TIMPs的表達降低。MMPs/TIMPs的表達失衡將導致圓錐角膜成纖維細胞外基質的降解增多，進而可能導致角膜組織結構的完整性遭受破壞。
引言
圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種慢性非對稱性眼部疾病，常發于青春期，臨床表現為角膜進行性變薄、擴張，向前凸起呈圓錐狀[1-3]。圓錐角膜的發生機制尚不明確，研究表明可能與遺傳和環境因素有關[4-5]，有文獻報道炎性因子可能參與了圓錐角膜的發生和發展[6-7]。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)作為炎性因子在干眼癥、角膜潰瘍等眼科疾病中起著重要的作用[8-9]，研究發現圓錐角膜患者淚液中TNF-α的含量顯著升高[10-13]，且圓錐角膜上皮細胞中TNF-α的表達上調[14]，但TNF-α在圓錐角膜發生過程中的作用尚不明確。
基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是一類活性依賴于鋅離子的蛋白水解酶，幾乎能降解細胞外基質中的各種蛋白成分[15]。基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs)作為MMPs的天然抑制劑，兩者共同作用維持細胞外基質的動態平衡[16-17]。研究發現在圓錐角膜組織中MMPs表達升高，TIMPs表達降低，動態平衡遭到破壞[18-19]。此外，體外培養的圓錐角膜成纖維細胞MMP1、MMP2、MMP9表達升高[20]，然而炎性因子TNF-α對圓錐角膜成纖維細胞MMPs和TIMPs表達的影響尚未報道。本文的主要目的是研究TNF-α對離體培養的圓錐角膜成纖維細胞MMPs和TIMPs表達的影響。
1 材料與方法
1.1 角膜成纖維細胞的提取及培養
圓錐角膜取自患者進行角膜移植術后廢棄的角膜組織，正常角膜(normal cornea，NC)取自角膜移植手術供體切去大視區后的角膜組織環，均來源于山西省眼科醫院。把得到的正常角膜和圓錐角膜分別置于含慶大霉素的磷酸鹽緩沖液中浸泡30 min，機械剝離掉角膜上皮層和內皮層，將剩余基質層用磷酸鹽緩沖液沖洗三次，然后剪碎加入含1 mg/mL Ⅱ型膠原酶的改良Eagle培養液(Dulbecco’s Modified Eagle Media: Nutrient Mixture F-12,DMEM/F12)(Hyclone,美國)，置于37 ℃二氧化碳培養箱進行消化。待組織塊消化完全后，2 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)(Gibco,美國)體積分數為10%的DMEM/F12培養液，置于37 ℃二氧化碳培養箱繼續培養，細胞融合達80%時進行傳代。
1.2 TNF-α處理角膜成纖維細胞
取傳代至第三代的正常和圓錐角膜成纖維細胞以2×105個/mL的密度接種于六孔培養板，待細胞貼壁后換成含1% FBS的DMEM/F12培養液饑餓處理24 h，加入重組人TNF-α(Peprotech,美國)濃度分別為0、10、100 ng/mL的10% FBS DMEM/F12培養液繼續培養12 h。未加TNF-α處理的正常和圓錐角膜成纖維細胞分別作為各自的對照組。
1.3 蛋白質印跡法檢測MMPs的蛋白表達
細胞培養12 h后，收集細胞上清液，用以檢測細胞分泌的MMPs蛋白表達。磷酸鹽緩沖液沖洗細胞一次，加入蛋白裂解液(碧云天,中國)，至冰上充分裂解，刮取裂解蛋白于離心管中4 ℃離心，取上清為細胞蛋白，用以檢測細胞中甘油醛-3-磷酸脫氨酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的蛋白表達。
用蛋白定量試劑盒(C503021,生工,上海)分別對細胞上清液和細胞蛋白進行定量、分類。將分裝后的細胞培養上清液和細胞蛋白變性后直接進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，無需進行蛋白濃縮，濃縮膠和分離膠的濃度分別為5%和8%。電泳完畢后將膠上蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜(Millipore,美國)，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗4 ℃過夜，用含Tween-20的Tris-HCl緩沖鹽溶液洗膜5次(5 min/次)，加入二抗室溫孵育2 h，洗膜5次(5 min/次)，加入化學發光試劑后暗盒曝光。實驗中所選一抗為MMP1(MAB3307,Millipore,美國)、MMP2(ab80737,Abcam,英國)、MMP3(ab17790,Abcam,英國)、MMP9(ab3159,Abcam,英國)、GAPDH(BM1623,博士德,中國)，稀釋比例分別為1/1 000、 1/1 000、 1/1 000、 1/1 000、 1/100； 二抗(ab6789,Abcam,英國)，稀釋比例1/7 000。 選取GAPDH為內參校正。
1.4 實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應檢測TIMPs基因的表達
收集各組細胞，加入Trizol(D9108A,Takara,大連)提取總RNA，用反轉錄試劑盒(RR047A,Takara,大連)將RNA反轉錄成與其互補的單鏈DNA。用實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應儀(Steponeplus,ABI,美國)檢測TIMPs基因的表達。檢測基因的引物序列為：GAPDH上游序列為5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游序列為5′-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3′；TIMP1上游序列為5′-GCTTCTGGCATCCTGTTGTT-3′，下游序列為5′-GGTATAAGGTGGTCTGGTTGA-CT-3′；TIMP2上游序列為5′-CCACCCAGAA-GAAGAGCCTGA-3′，下游序列為5′-GTGACCC-AGTCCATCCAGAG-3′，以GAPDH作為內參對目的基因進行校正。實驗選用的反應條件為：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火、延伸 30 s，共40個循環。
1.5 統計學分析
用圖像分析軟件Image-pro 5.1對蛋白條帶進行灰度分析，結果以均數±標準差(x±s)表示。用SPSS19.0統計軟件在組內進行單因素方差分析，兩組間采用t檢驗分析，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 TNF-α對角膜成纖維細胞MMPs蛋白表達的影響
利用蛋白質印跡法對角膜成纖維細胞上清液中MMPs的蛋白檢測結果如圖 1所示。TNF-α能使正常角膜成纖維細胞上清液中MMP1的表達升高，而使圓錐角膜成纖維細胞上清液中MMP1的表達降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)。在圓錐角膜成纖維細胞上清液中能檢測到MMP1的活性形式，其表達能被TNF-α上調 (P＜0.05)。TNF-α使正常角膜和圓錐角膜成纖維細胞上清液中MMP2、MMP3、MMP9的表達升高，且在相同濃度下圓錐角膜成纖維細胞上清液MMP2、MMP3、MMP9的表達高于正常角膜，差異具有統計學意義(P＜0.05)。
圖1
TNF-α對角膜成纖維細胞上清液中MMPs蛋白表達的影響
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2.2 TNF-α對角膜成纖維細胞TIMPs基因表達的影響
利用實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應儀對角膜成纖維細胞TIMPs基因的檢測結果如圖 2所示。TNF-α使正常角膜成纖維細胞TIMP1的表達升高，而使圓錐角膜成纖維TIMP1的表達降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。當TNF-α濃度為0 ng/mL時，圓錐角膜成纖維細胞TIMP1的表達高于正常角膜成纖維細胞(P＜0.05)；當TNF-α濃度為10 ng/mL和100 ng/mL時，圓錐角膜成纖維細胞TIMP1的表達低于正常角膜成纖維細胞(P＜0.05)。TNF-α使正常角膜和圓錐角膜成纖維細胞TIMP2的表達都降低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。
圖2
TNF-α對角膜成纖維細胞TIMPs基因表達的影響
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3 討論
本文通過對正常角膜和圓錐角膜成纖維細胞施加不同濃度的TNF-α刺激，研究了角膜成纖維細胞上清液中MMPs蛋白表達和細胞中TIMPs基因表達的變化。結果發現在圓錐角膜成纖維細胞的上清液中存在MMP1的活性形式，TNF-α能使之表達上調。角膜基質層占整個角膜厚度的90%以上[21]，主要由Ⅰ型膠原組成[22]，MMP1表達上調將導致Ⅰ型膠原的降解增加。Mackiewicz等[23]在圓錐角膜的免疫組化中也發現MMP1表達升高。IL-6可能介導了TNF-α引起的圓錐角膜成纖維細胞MMP1的升高[24]。同時本文發現TNF-α能促進角膜成纖維細胞MMP2、MMP3、MMP9表達升高，在前交叉韌帶成纖維細胞、牙周膜成纖維細胞、視網膜色素上皮細胞等其他類型的細胞中也存在類似的情況[25-27]。MMP2、MMP9又稱為明膠酶，可以降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原[15, 28]，MMP2、MMP9的表達升高將會導致Ⅳ型膠原降解增多。Ⅳ型膠原是基底膜的主要成分[22]，在臨床上發現圓錐角膜患者的基底膜遭受破壞[29]。在圓錐角膜組織中也發現MMP2、MMP9表達升高[19, 30]。MMP3雖不能直接降解膠原，但可以通過調節MMP9的表達來發揮作用[31]。Shetty等[32]發現對圓錐角膜患者用環孢霉素A治療可以減少炎癥反應，降低淚液中MMP9的含量，并延緩圓錐角膜的發生。因此如果通過控制炎癥反應來降低MMPs的表達，可為延緩圓錐角膜的發展提供新的方向。
細胞外基質的分解在細胞外基質重塑中起著關鍵的作用，而該分解過程的實現需要MMPs/TIMPs的精確調控[33]，MMPs/TIMPs失衡將導致細胞外基質的降解[34]。我們的研究發現，相同濃度TNF-α作用下，圓錐角膜成纖維細胞MMPs的表達明顯高于正常角膜，TIMPs的表達隨TNF-α濃度的升高而降低。這將使圓錐角膜成纖維細胞對MMPs的抑制作用減弱，細胞外基質降解增多。Ihalainen等[20]在離體培養的圓錐角膜細胞中發現MMP1、MMP2、MMP9的表達升高。Smith等[18]也發現圓錐角膜成纖維細胞TIMP1的表達升高，本文結果與之前研究報道相符。
綜上所述，TNF-α能促進圓錐角膜成纖維細胞MMPs的表達，而使其TIMPs的表達降低。MMPs/TIMPs的表達失衡將導致圓錐角膜成纖維細胞外基質的降解增多，進而可能導致角膜組織結構的完整性遭受破壞。