本文比較了不同保存方式對小鼠股骨力學性能的影響，以期從生物力學的角度尋找樣品最佳保存方式。研究選擇12周齡健康雌性C57BL/6J小鼠20只，手術分離獲得完整的左、右股骨，隨機分為新鮮對照組、4%多聚甲醛固定組、4℃冷藏組、-20℃冷凍組、-80℃冷凍組，其中后三組低溫保存組分別在各自不同溫度儲存1周、2個月、6個月，復溫后行三點彎曲測試，記錄載荷撓度等變化。結果顯示：相對于新鮮對照組的測試結果而言，4%多聚甲醛固定組，彈性模量和撓度全部明顯下降；4℃冷藏組保存1周后，樣品最大載荷和彈性模量有所降低；-20℃保存2個月，力學性能接近于新鮮對照組，6個月后，最大載荷降低；而-80℃冷凍組在彈性載荷、最大載荷、彈性模量等方面的力學屬性未發生明顯變化。因此基于本文研究結果得出結論，-80℃冷凍保存對骨組織的力學性能影響較小，適合長期保存。
引用本文： 程朋真, 寧芬茹, 李丹, 李東林, 江慧杰, 裴國獻, 楊柳. 不同保存方式對小鼠股骨力學性能的影響. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(6): 1133-1138. doi: 10.7507/1001-5515.20160180 復制
引 言
骨是承重的特殊組織，受力作用時會發生形變，形變不斷累積，超過一定閾值時即會發生骨折[1]。力學性能下降常導致骨折發生率升高[2]。因此在骨科學中，力學研究非常重要，其中三點彎曲試驗是將骨標本放在有一定距離的兩個支撐點上，在兩個支撐點中點上方，向標本施加向下的載荷，標本的3個接觸點形成相等的兩個力矩時即發生三點彎曲，繼續施加壓力，標本將于中點處發生斷裂。由于三點彎曲實驗操作簡便，目前已廣泛用于力學研究[3-4]。原則上，為了精確測量骨的力學性能，必須采用新鮮的樣本進行測試，但在實際操作中，很難在取材后第一時間完成檢測。另外，為了減少系統誤差，應當保證不同批次取材的骨組織同時間進行測試，因此從生物力學的角度探討樣品的保存方式，從而最大程度地維持骨組織的力學性能具有重要意義。20世紀90年代，有學者提出通過低溫冷凍法來保存力學測試標本并沿用至今[5-6]。但冷凍溫度和保存時間對樣品的影響缺乏系統研究。本文選擇小鼠股骨進行實驗，分別探討樣品在不同保存方式下各時間段的材料力學(彈性模量)和結構力學(彈性載荷、彈性撓度、塑性撓度、最大載荷)的性質變化。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與分組
選擇12周齡健康雌性C57BL/6J小鼠20只，清潔級，體重21~23 g，由第四軍醫大學動物實驗中心提供。手術分離獲得完整的左、右股骨共40只，共分為11組，每組3只股骨作為平行樣本進行生物力學分析，剩余7只股骨備用。其中，以新鮮股骨作為對照組(control組)；以4%多聚甲醛固定3 d作為固定組；低溫保存組則分為：4 ℃冷藏組(4 ℃組)、-20 ℃冷凍組(-20 ℃組)、-80 ℃冷凍組(-80 ℃組)，分別儲存1周、2個月、6個月。
1.2 樣品收集與保存
實驗小鼠過量麻醉，取仰臥位，從大腿內側切開股部皮膚，分離肌肉，完整切取兩側股骨，小心剔除軟組織，立即用生理鹽水潤濕的紗布包裹樣品，新鮮對照組即刻進行力學測試；其余分組樣品置于1.5 mL EP管內，分別保存并做好標記；固定組將樣品置于4%多聚甲醛內固定3 d后行力學測試。
1.3 生物力學測試
1.3.1 儀器設備
美國BOSE公司生產的3220型電子動靜態萬能材料試驗機，載荷測量精度為0.01 N，位移精度為0.000 001 mm，試驗機自動記錄載荷-撓度變化。
1.3.2 三點彎曲試驗
① 檢測前，用顯微鏡觀察股骨標本，以保證所有測試標本骨皮質完好無損，以免標本上微小裂痕影響檢測結果。② 測量前應將標本置于生理鹽水中復溫，測試過程中保持標本處于濕潤狀態。將股骨標本平穩放置在彎曲夾具上，使股骨的短軸方向與力的方向一致，兩支點的跨距為8 mm[7]，預載荷0.5 N，加載速度為0.02 mm/s[8]，行程2 mm，標本破壞后測試終止。③ 彈性模量計算：使用游標卡尺測量斷裂位點的長短軸外徑和皮質骨厚度，計算出長短軸內徑，測量3次取平均值。小鼠股骨橫截面近似于橢圓環狀，如圖 1所示。
彎曲彈性模量計算公式為[1]：
| $E=\frac{{{L}^{3}}}{48I}(\frac{\Delta F}{\Delta f})$ |
圖1
三點彎曲實驗示意圖
Figure1.
Schematic diagram of three point bending test
其中L為跨距，ΔF為彈性段(載荷-撓度曲線的線性區間)兩點間的載荷增量，Δf為該兩點的撓度增量，I代表慣性矩，對于橢圓環狀截面，其慣性矩公式為：
| $I=\frac{\pi (B{{H}^{3}}-b{{h}^{3}})}{64}$ |
式中B和H分別代表樣本的長軸、短軸外徑，b和h為長軸、短軸的內徑，可由外徑減去皮質骨厚度得到。
1.3.3 數據采集和統計學處理
記錄彈性載荷、最大載荷、彈性撓度、塑性撓度，計算得出每個樣品的彈性模量，每個數據采集3個復樣。所有數據通過Graphpad Prism 5進行統計學分析并繪制柱形圖。
2 結果
2.1 小鼠股骨結構數據
小鼠股骨斷面外短徑H為(1.33±0.07)mm，外長徑B為(1.80±0.07)mm，內短徑h為(0.99±0.13)mm，內長徑b為(1.46±0.08)mm。
2.2 低溫保存1周對骨力學性能的影響
骨組織標本在不同溫度下保存1周的力學性能變化如圖 2所示。與新鮮對照組相比，小鼠股骨在-80 ℃與-20 ℃保存1周，材料力學和結構力學數據未發生明顯變化；在4 ℃保存1周，彈性載荷與新鮮對照組相比差異較小，但最大載荷與彈性模量均有所降低(P＜0.05)。
圖2
低溫保存1周各組力學數據(n=3)
*
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2.3 低溫保存2月對骨力學性能的影響
標本在不同溫度下冷藏2月的力學性能變化如圖 3所示。-80 ℃組和-20 ℃組力學屬性未發生明顯改變；4 ℃組保存2月，彈性載荷與新鮮對照組相比差異較小，但最大載荷與彈性模量均有明顯降低(P＜0.01)。
圖3
低溫保存2月各組力學數據(n=3)
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2.4 低溫保存6月對骨力學性能的影響
骨組織標本在不同溫度下冷藏6月的力學性能變化如圖 4所示。與新鮮對照組相比， -80 ℃組力學屬性未發生明顯變化；-20 ℃組彈性載荷、彈性模量未發生明顯改變，最大載荷有所降低(P＜0.05)；4 ℃組彈性載荷、最大載荷、彈性模量明顯降低(P＜0.01)。
圖4
低溫保存6月各組力學數據(n=3)
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2.5 化學固定對骨力學性能的影響
骨組織標本置于4%多聚甲醛溶液中固定3 d后，力學性能變化如圖 5所示。彈性載荷與最大載荷相比新鮮對照組無明顯差異，但彈性撓度、塑性撓度、彈性模量均有所降低(P＜0.05)。
圖5
4%多聚甲醛固定組力學數據(n=3)
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3 討論
骨的力學特征是反應骨質量的重要指標[9]，主要包括結構力學指標(如彈性載荷、最大載荷、撓度等) 和材料力學指標(如彈性模量及最大彎曲應力等) ，前者受骨幾何形狀的影響，后者則取決于骨的構成成分和微結構[10-12]。這些指標共同反映骨的內在質量和性能的改變，能夠表示骨的強度和抵抗外力的能力。其中，最大載荷是骨骼所能承受的極限負荷，如果所施加的外力大于最大載荷，則會發生骨折，它反映了骨抵抗破壞的能力。彈性載荷代表骨抵抗彈性變形的能力，在彈性區間內，骨組織受力發生形變，撤去外力則會回復原狀；骨骼的彈性載荷小，表明骨骼在外力作用下更易發生塑性變形，產生不可逆損傷。撓度是骨骼柔韌性的指標，大小與骨基質膠原蛋白的含量與狀態有關[13]，一般有機質含量高則撓度大，無機質含量高則撓度小。另外，本文筆者在測試過程中發現，標本的撓度數據差異頗大，部分標本極易脆斷，部分則在測試完成后仍未完全斷裂，尚有少量骨皮質相連。這種差異在新鮮對照組與4%多聚甲醛固定組比較時表現得尤為明顯。彈性模量是骨生物力學的最重要指標，它與材料的幾何形狀無關，反映了材料的內在硬度[14]。本文選擇彈性模量、彈性載荷、彈性撓度、塑性撓度、最大載荷等作為股骨標本彎曲實驗的評價指標，基本可以從材料力學和結構力學的角度全面評價樣本的剛性和韌性。
為了精確測量骨標本的力學數據，同時考慮到實際操作的可行性，必須從力學角度尋找一種合適的保存方法。目前，多數學者采用低溫冷藏或組織固定的方法保存標本[5-6]，但保存溫度和時間對標本的影響缺少系統研究。因此，本文選擇體成熟小鼠的股骨作為研究對象，檢測其在-80 ℃、-20 ℃、4 ℃分別保存1周、2個月、6個月后的力學性質變化，并與新鮮標本進行比較，探討最佳保存條件。
申才良等[15]將截肢的脛骨干制成骨塊，置于-80 ℃冰箱中保存3周，發現其抗壓強度較新鮮骨無明顯變化。本文將骨組織低溫保存的時間延長至6個月，測試結果也進一步證實-80 ℃保存幾乎不影響骨組織的力學性能。而-20 ℃保存2個月也對樣本影響不大，僅彈性模量少量降低；冷凍6個月后彈性載荷、彈性模量未發生明顯改變，但最大載荷有所降低，表明樣品強度下降，抵抗破壞的能力變弱。而將實驗條件設置為在4 ℃保存1周，則最大載荷與彈性模量均有所降低，提示樣品的微結構可能已經發生變化；冷藏6個月，樣品的力學參數已經全面降低。另一方面，在組織學研究中，多聚甲醛固定是標本保存的常用方法，其原理是甲醛可與蛋白質的氨基結合，形成分子內交聯，但長時間固定會使標本硬化，脆性增加[16]。通過本文測試結果可以看出，樣品固定后彈、塑性撓度和彈性模量均有所降低，推測固定后骨組織的有機質發生改變，進而影響其剛性和韌性，使標本發生脆斷。
綜上所述，-80 ℃冷凍對骨組織的力學性能影響最小，可以保存6月甚至更長時間；-20 ℃可以短期保存(2月內)。需要注意的是在取材、儲存、復溫、測試的整個過程中應當保持標本的濕潤，并盡量剔除軟組織，降低黏彈性影響。
本文從靜態力學的角度探討不同保存方式對骨標本的影響，對骨科生物力學研究具有一定的參考意義。不足之處在于，骨是一個循環加載的組織，靜態測試不能完全模擬生理狀態下的受力過程。因此為了更科學地評價保存方式對骨的影響，尚需進行動態疲勞測試。
引 言
骨是承重的特殊組織，受力作用時會發生形變，形變不斷累積，超過一定閾值時即會發生骨折[1]。力學性能下降常導致骨折發生率升高[2]。因此在骨科學中，力學研究非常重要，其中三點彎曲試驗是將骨標本放在有一定距離的兩個支撐點上，在兩個支撐點中點上方，向標本施加向下的載荷，標本的3個接觸點形成相等的兩個力矩時即發生三點彎曲，繼續施加壓力，標本將于中點處發生斷裂。由于三點彎曲實驗操作簡便，目前已廣泛用于力學研究[3-4]。原則上，為了精確測量骨的力學性能，必須采用新鮮的樣本進行測試，但在實際操作中，很難在取材后第一時間完成檢測。另外，為了減少系統誤差，應當保證不同批次取材的骨組織同時間進行測試，因此從生物力學的角度探討樣品的保存方式，從而最大程度地維持骨組織的力學性能具有重要意義。20世紀90年代，有學者提出通過低溫冷凍法來保存力學測試標本并沿用至今[5-6]。但冷凍溫度和保存時間對樣品的影響缺乏系統研究。本文選擇小鼠股骨進行實驗，分別探討樣品在不同保存方式下各時間段的材料力學(彈性模量)和結構力學(彈性載荷、彈性撓度、塑性撓度、最大載荷)的性質變化。
1 材料與方法
1.1 實驗動物與分組
選擇12周齡健康雌性C57BL/6J小鼠20只，清潔級，體重21~23 g，由第四軍醫大學動物實驗中心提供。手術分離獲得完整的左、右股骨共40只，共分為11組，每組3只股骨作為平行樣本進行生物力學分析，剩余7只股骨備用。其中，以新鮮股骨作為對照組(control組)；以4%多聚甲醛固定3 d作為固定組；低溫保存組則分為：4 ℃冷藏組(4 ℃組)、-20 ℃冷凍組(-20 ℃組)、-80 ℃冷凍組(-80 ℃組)，分別儲存1周、2個月、6個月。
1.2 樣品收集與保存
實驗小鼠過量麻醉，取仰臥位，從大腿內側切開股部皮膚，分離肌肉，完整切取兩側股骨，小心剔除軟組織，立即用生理鹽水潤濕的紗布包裹樣品，新鮮對照組即刻進行力學測試；其余分組樣品置于1.5 mL EP管內，分別保存并做好標記；固定組將樣品置于4%多聚甲醛內固定3 d后行力學測試。
1.3 生物力學測試
1.3.1 儀器設備
美國BOSE公司生產的3220型電子動靜態萬能材料試驗機，載荷測量精度為0.01 N，位移精度為0.000 001 mm，試驗機自動記錄載荷-撓度變化。
1.3.2 三點彎曲試驗
① 檢測前，用顯微鏡觀察股骨標本，以保證所有測試標本骨皮質完好無損，以免標本上微小裂痕影響檢測結果。② 測量前應將標本置于生理鹽水中復溫，測試過程中保持標本處于濕潤狀態。將股骨標本平穩放置在彎曲夾具上，使股骨的短軸方向與力的方向一致，兩支點的跨距為8 mm[7]，預載荷0.5 N，加載速度為0.02 mm/s[8]，行程2 mm，標本破壞后測試終止。③ 彈性模量計算：使用游標卡尺測量斷裂位點的長短軸外徑和皮質骨厚度，計算出長短軸內徑，測量3次取平均值。小鼠股骨橫截面近似于橢圓環狀，如圖 1所示。
彎曲彈性模量計算公式為[1]：
| $E=\frac{{{L}^{3}}}{48I}(\frac{\Delta F}{\Delta f})$ |
圖1
三點彎曲實驗示意圖
Figure1.
Schematic diagram of three point bending test
其中L為跨距，ΔF為彈性段(載荷-撓度曲線的線性區間)兩點間的載荷增量，Δf為該兩點的撓度增量，I代表慣性矩，對于橢圓環狀截面，其慣性矩公式為：
| $I=\frac{\pi (B{{H}^{3}}-b{{h}^{3}})}{64}$ |
式中B和H分別代表樣本的長軸、短軸外徑，b和h為長軸、短軸的內徑，可由外徑減去皮質骨厚度得到。
1.3.3 數據采集和統計學處理
記錄彈性載荷、最大載荷、彈性撓度、塑性撓度，計算得出每個樣品的彈性模量，每個數據采集3個復樣。所有數據通過Graphpad Prism 5進行統計學分析并繪制柱形圖。
2 結果
2.1 小鼠股骨結構數據
小鼠股骨斷面外短徑H為(1.33±0.07)mm，外長徑B為(1.80±0.07)mm，內短徑h為(0.99±0.13)mm，內長徑b為(1.46±0.08)mm。
2.2 低溫保存1周對骨力學性能的影響
骨組織標本在不同溫度下保存1周的力學性能變化如圖 2所示。與新鮮對照組相比，小鼠股骨在-80 ℃與-20 ℃保存1周，材料力學和結構力學數據未發生明顯變化；在4 ℃保存1周，彈性載荷與新鮮對照組相比差異較小，但最大載荷與彈性模量均有所降低(P＜0.05)。
圖2
低溫保存1周各組力學數據(n=3)
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2.3 低溫保存2月對骨力學性能的影響
標本在不同溫度下冷藏2月的力學性能變化如圖 3所示。-80 ℃組和-20 ℃組力學屬性未發生明顯改變；4 ℃組保存2月，彈性載荷與新鮮對照組相比差異較小，但最大載荷與彈性模量均有明顯降低(P＜0.01)。
圖3
低溫保存2月各組力學數據(n=3)
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2.4 低溫保存6月對骨力學性能的影響
骨組織標本在不同溫度下冷藏6月的力學性能變化如圖 4所示。與新鮮對照組相比， -80 ℃組力學屬性未發生明顯變化；-20 ℃組彈性載荷、彈性模量未發生明顯改變，最大載荷有所降低(P＜0.05)；4 ℃組彈性載荷、最大載荷、彈性模量明顯降低(P＜0.01)。
圖4
低溫保存6月各組力學數據(n=3)
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2.5 化學固定對骨力學性能的影響
骨組織標本置于4%多聚甲醛溶液中固定3 d后，力學性能變化如圖 5所示。彈性載荷與最大載荷相比新鮮對照組無明顯差異，但彈性撓度、塑性撓度、彈性模量均有所降低(P＜0.05)。
圖5
4%多聚甲醛固定組力學數據(n=3)
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3 討論
骨的力學特征是反應骨質量的重要指標[9]，主要包括結構力學指標(如彈性載荷、最大載荷、撓度等) 和材料力學指標(如彈性模量及最大彎曲應力等) ，前者受骨幾何形狀的影響，后者則取決于骨的構成成分和微結構[10-12]。這些指標共同反映骨的內在質量和性能的改變，能夠表示骨的強度和抵抗外力的能力。其中，最大載荷是骨骼所能承受的極限負荷，如果所施加的外力大于最大載荷，則會發生骨折，它反映了骨抵抗破壞的能力。彈性載荷代表骨抵抗彈性變形的能力，在彈性區間內，骨組織受力發生形變，撤去外力則會回復原狀；骨骼的彈性載荷小，表明骨骼在外力作用下更易發生塑性變形，產生不可逆損傷。撓度是骨骼柔韌性的指標，大小與骨基質膠原蛋白的含量與狀態有關[13]，一般有機質含量高則撓度大，無機質含量高則撓度小。另外，本文筆者在測試過程中發現，標本的撓度數據差異頗大，部分標本極易脆斷，部分則在測試完成后仍未完全斷裂，尚有少量骨皮質相連。這種差異在新鮮對照組與4%多聚甲醛固定組比較時表現得尤為明顯。彈性模量是骨生物力學的最重要指標，它與材料的幾何形狀無關，反映了材料的內在硬度[14]。本文選擇彈性模量、彈性載荷、彈性撓度、塑性撓度、最大載荷等作為股骨標本彎曲實驗的評價指標，基本可以從材料力學和結構力學的角度全面評價樣本的剛性和韌性。
為了精確測量骨標本的力學數據，同時考慮到實際操作的可行性，必須從力學角度尋找一種合適的保存方法。目前，多數學者采用低溫冷藏或組織固定的方法保存標本[5-6]，但保存溫度和時間對標本的影響缺少系統研究。因此，本文選擇體成熟小鼠的股骨作為研究對象，檢測其在-80 ℃、-20 ℃、4 ℃分別保存1周、2個月、6個月后的力學性質變化，并與新鮮標本進行比較，探討最佳保存條件。
申才良等[15]將截肢的脛骨干制成骨塊，置于-80 ℃冰箱中保存3周，發現其抗壓強度較新鮮骨無明顯變化。本文將骨組織低溫保存的時間延長至6個月，測試結果也進一步證實-80 ℃保存幾乎不影響骨組織的力學性能。而-20 ℃保存2個月也對樣本影響不大，僅彈性模量少量降低；冷凍6個月后彈性載荷、彈性模量未發生明顯改變，但最大載荷有所降低，表明樣品強度下降，抵抗破壞的能力變弱。而將實驗條件設置為在4 ℃保存1周，則最大載荷與彈性模量均有所降低，提示樣品的微結構可能已經發生變化；冷藏6個月，樣品的力學參數已經全面降低。另一方面，在組織學研究中，多聚甲醛固定是標本保存的常用方法，其原理是甲醛可與蛋白質的氨基結合，形成分子內交聯，但長時間固定會使標本硬化，脆性增加[16]。通過本文測試結果可以看出，樣品固定后彈、塑性撓度和彈性模量均有所降低，推測固定后骨組織的有機質發生改變，進而影響其剛性和韌性，使標本發生脆斷。
綜上所述，-80 ℃冷凍對骨組織的力學性能影響最小，可以保存6月甚至更長時間；-20 ℃可以短期保存(2月內)。需要注意的是在取材、儲存、復溫、測試的整個過程中應當保持標本的濕潤，并盡量剔除軟組織，降低黏彈性影響。
本文從靜態力學的角度探討不同保存方式對骨標本的影響，對骨科生物力學研究具有一定的參考意義。不足之處在于，骨是一個循環加載的組織，靜態測試不能完全模擬生理狀態下的受力過程。因此為了更科學地評價保存方式對骨的影響，尚需進行動態疲勞測試。