觀察腹主動脈灌注瑞芬太尼聚己內酯(REM-PCL)對脊髓缺血再灌注損傷(SCIRI)的作用。36只新西蘭大白兔隨機分為假手術組(S組)、對照組(C組)和REM-PCL組(R組), 每組12只。采用腎下腹主動脈阻斷法, 建立SCIRI模型。分別于缺血前、再灌注15 min、再灌注30 min、再灌注60 min及再灌注120 min監測脊髓微循環血流量(SCMBF)及血流速度(BFR)變化, 并于缺血前、再灌注6 h、12 h和24 h進行神經功能評分。分別于缺血前、缺血45 min、再灌注30 min、60 min、6 h、12 h及24 h監測血清神經特異性烯醇化酶濃度(NSE)、白細胞介素-lβ(IL-lβ)及白細胞介素-8(IL-8)濃度變化。分別于缺血前、缺血45 min、再灌注30 min和60 min時測定脊髓神經細胞線粒體超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、丙二醛(MDA)、總抗氧化能力(T-AOC)、線粒體腫脹度(MSD)水平并觀察其運動神經元異常率改變。結果顯示C組缺血后MSD、NSE、IL-lβ、IL-8、ROS、MDA水平及運動神經元異常率均升高(P＜0.01), 脊髓神經細胞線粒體SOD、GSH-PX及T-AOC水平均降低(P＜0.01)。R組運動神經元異常率損害明顯輕于C組(P＜0.01), NSE、IL-lβ、IL-8、ROS、MDA和MSD水平均明顯低于C組(P＜0.01), SOD、GSH-PX及T-AOC水平均高于C組(P＜0.01), 再灌注期間神經功能評分較C組恢復迅速(P＜0.01)。研究表明, 腹主動脈灌注REM-PCL可以通過抑制炎性反應及提高線粒體抗氧化能力減輕SCIRI。
引用本文： 方華, 李華鳳, 張偉晶, 楊淼, 章放香, 章建平, 王泉云, 王儒蓉, 劉進. 腹主動脈灌注瑞芬太尼聚己內酯減輕脊髓缺血再灌注損傷的實驗研究. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(4): 735-740. doi: 10.7507/1001-5515.20160120 復制
引言
有文獻報道，脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)期間炎性反應引起的線粒體膜結構改變及抗氧化能力下降與脊髓微循環功能障礙的發生有密切的聯系[1-2]。瑞芬太尼聚己內酯(remifentanil-poly-caprolactone, REM-PCL)是一種新型阿片類麻醉藥物[3]。我們的前期研究已證實SCIRI期間REM-PCL可通過激動Mu阿片類受體(Mu-opioid receptor，MOR)發揮其藥理作用，其中腹主動脈灌注0.1 mg/kg REM-PCL可通過改善脊髓能量代謝促進脊髓后肢神經功能的恢復[4-5]。為進一步探討REM-PCL的脊髓保護機制，本研究應用激光多普勒血流儀實時監測腹主動脈灌注REM-PCL預處理缺血脊髓后的兔L3-L4脊髓微循環功能的變化規律，并觀察REM-PCL對缺血再灌注損傷脊髓線粒體抗氧化能力以及炎性反應的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
REM-PCL(發明專利號：200810045272.8，貴州省人民醫院麻醉實驗室合成)[3]；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、總抗氧化能力(total anti-oxidation capacity，T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒與活性氧(reactive oxygen species，ROS)活力試劑盒均購自中國上海研吉生物科技有限公司；白細胞介素-lβ(interleukin-lβ，IL-lβ)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)及白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)ELISA試劑盒均購自美國USCNLIFE公司。
1.2 動物分組及模型建立
四川大學實驗動物中心提供新西蘭大白兔36只(動物合格證號為:SCXK(川)2009-045)，體重2~2.5 kg，雌雄不限，每組12只，隨機分為3組：對照組(簡稱C組)、REM-PCL組(簡稱R組)及假手術組(簡稱S組)。參照文獻[5]建立SCIRI動物模型，耳緣靜脈注射30 mg/kg的1.5%戊巴比妥鈉和0.25 mg/kg維庫溴銨麻醉氣管插管后機械通氣，消毒鋪巾左側腹股溝區，左側股動脈穿刺置入硬膜外導管至左腎動脈起始點下方2 cm處。腹部消毒鋪巾后逐層進入腹腔，生理鹽水紗墊覆蓋腹腔臟器，分離顯露腹主動脈至左腎動脈始點下方約0.5 cm處，耳緣靜脈注射1 mg/kg肝素后使用中號動脈夾暫時夾閉腹主動脈，確定夾閉點以下腹主動脈搏動停止，阻斷腹主動脈血流45 min后移除動脈夾開放腹主動脈血流，建立腰段脊髓缺血再灌注損傷；術中監測平均動脈壓、脈搏氧飽和度、心電圖、動脈血氣及維持肛門溫度36~37 ℃。R組于阻斷腹主動脈即刻，經導管腹主動脈內局部灌注0.1 mg/kg REM-PCL預處理缺血脊髓組織5 min[4-5]。C組灌注等容量生理鹽水。S組未阻斷腹主動脈，僅進行開腹手術操作，于對應時間點測定各觀察指標。其中每組隨機選取6只動物于缺血前及再灌注期間進行后肢神經功能評分(neurologic function scores，NFS)。
1.3 觀察指標
1.3.1 后肢神經功能評分
由不了解分組情況的兩名觀測者分別于缺血前、再灌注6 h、12 h和24 h進行NFS，包括：①后肢反射功能評分，參照Reuter標準[6]測定后肢反射功能；②后肢運動功能評分，參照Jacobs分級標準[7]測定后肢運動功能。
1.3.2 血液指標檢測
參照試劑盒說明書，采用Elx800酶標儀(美國Bio-TEK公司)于缺血前、缺血45 min、再灌注30 min、再灌注60 min、再灌注6 h、再灌注12 h及再灌注24 h各時間點采集股靜脈血2 mL，雙抗體夾心ELISA法檢測NSE、IL-lβ及IL-8濃度。
1.3.3 脊髓微循環測量
參照文獻[8], 采用Peri Flux System 5001型多通道系統激光多普勒血流儀(瑞典PERIMED公司)分別于缺血前、再灌注15 min、再灌注30 min、再灌注60 min及再灌注120 min各時間點測定L3-L4脊髓微循環功能：消毒鋪巾L3-L4背部區域，逐層切開皮膚、皮下、肌肉及去除L3-L4腰椎椎板后顯露L3-L4段脊髓；將無菌血流儀激光掃描探頭置于L3-L4硬脊膜上，保持探頭與硬脊膜接觸良好以測量脊髓微循環血流參數，包括以灌注單位(perfusion unit，PU)表示的脊髓微循環血流量(spinal cord microcirculatory blood flow，SCMBF)及以速度單位(velocity unit, VU)表示的血流速度(blood flow rate，BFR)。
1.3.4 脊髓組織指標檢測
分別于缺血前、缺血45 min、再灌注30 min和60 min時取脊髓L3-L4節段脊髓組織, 一部分脊髓組織固定于10%福爾馬林中用于脊髓神經元異常率檢測；參照文獻[9-10]，另一部分脊髓組織用于制備脊髓組織神經細胞線粒體：在0～4℃冰浴條件下的脊髓組織中分別加入1：9(w/v)比例的分離液(0.225 mol/L D-mannitol pH 7.4、0.075 mol/L sucrose、10 mol/L Tris-HCl及0.05 mol/L EDTA)超聲勻漿后600 r/min離心5 min后，再將分離液懸浮沉淀進行超聲勻漿，4 ℃中600×g離心5 min，所得上清液再于4 ℃環境下10 000 r/min離心10 min，采用考馬斯亮藍法測定線粒體懸液蛋白濃度。按照試劑盒操作說明書，6405型紫外分光光度計(英國JENWAY公司)測定脊髓組織神經細胞線粒體ROS、MDA、GSH-PX、SOD及T-AOC，并檢測線粒體懸液520 nm處吸光度值作為線粒體腫脹度(mitochondrial swelling degree，MSD)指標[10]。參照文獻[5, 8]測量Ⅷ-Ⅸ區脊髓前角神經元異常率：神經元異常率(%)=每張切片的所選視野中的異常神經元數/該視野中神經元總數×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0軟件統計處理，正態分布的計量資料以均數±標準差(
2 結果
2.1 一般情況
實驗過程中，實驗動物均無意外死亡，手術結束2 h內實驗動物均完全清醒，術后均無感染。
2.2 再灌注各時間點后肢NFS變化
2.2.1 Reuter評分
運動反射功能障礙越嚴重其Reuter分值越高。3組實驗動物缺血前Reuter分值均為0分。C組與缺血前及S組比較Reuter分值明顯增加(P＜0.01)。R組Reuter分值明顯低于C組，組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，如表 1所示。
表1
三組后肢NFS的變化(2.2.2 Jacobs評分
運動反射功能障礙越嚴重其Jacobs分值越低。3組實驗動物缺血前Jacobs分值均為5分。C組與缺血前及S組比較Jacobs分值明顯下降(P＜0.01)。C組Jacobs分值明顯低于于R組，組組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，如表 1所示。
2.3 血清IL-lβ、IL-8及NSE濃度變化
S組IL-lβ、IL-8及NSE均無明顯變化。與缺血前及S組比較，C組的IL-lβ、IL-8及NSE濃度在缺血45 min及再灌注各時間點明顯升高(P＜0.01)。再灌注60 min時R組IL-lβ、IL-8及NSE濃度恢復至缺血前水平，缺血45 min及再灌注各時間點R組IL-lβ、IL-8及NSE濃度均明顯低于C組(P＜0.01)，如表 2所示。
表2
3組血清NSE、IL-lβ及IL-8的變化(2.4 脊髓微循環參數變化
S組SCMBF與BFR值均無明顯變化。缺血后C組SCMBF與BFR值均迅速下降。開放腹主動脈后，隨著再灌注時間延長C組SCMBF與BFR值逐漸恢復，再灌注期間各時間點SCMBF與BFR值均明顯低于缺血前和S組水平，與缺血前和S組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)。再灌注15 min時R組SCMBF與BFR值恢復至缺血前水平，再灌注期間各時間點與C組組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，表現為SCMBF與BFR值均明顯高于C組，如表 3所示。
表3
BFR及SCMBF變化
Table3.
Changes of BFR and SCMBF
2.5 脊髓神經細胞線粒體MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD的變化
S組MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD值均無明顯變化。線粒體腫脹表現為520 nm處吸光值的降低。與缺血前及S組比較，C組脊髓缺血后MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD均明顯降低(P＜0.01)，再灌注期間MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD進一步降低(P＜0.01)；R組MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD在缺血45 min時均降低(P＜0.05)，再灌注30 min時R組MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD恢復至缺血前水平。缺血45 min、再灌注30 min和60 min時R組MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD均明顯高于C組，組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，如表 4所示。
表4
脊髓神經細胞線粒體MSD、T-AOC、GSH-PX、SOD、MDA、MSD、ROS和運動神經元異常率變化
Table4.
Changes of MSD, T-AOC, GSH-PX, SOD, MDA, MSD, ROS and abnormal rate of motor neuron
2.6 運動神經元異常率、脊髓神經細胞線粒體MDA與ROS的變化
S組運動神經元異常率、MDA與ROS值均無明顯變化。與缺血前及S組比較，C組脊髓缺血后運動神經元異常率、MDA與ROS均顯著升高(P＜0.01)，再灌注期間運動神經元異常率、MDA與ROS均持續升高(P＜0.01)；R組運動神經元異常率(P＜0.01)、MDA與ROS在缺血45 min均升高(P＜0.05)，MDA與ROS于再灌注30 min時均恢復至缺血前水平。在缺血45 min、再灌注30 min和60 min各時間點R組與C組組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，R組運動神經元異常率、MDA與ROS均明顯低于C組，如表 4所示。
3 討論
研究發現，脊髓微循環血液流變學與血流動力學的改變影響著SCIRI的發生、發展及藥物治療效果[8]。SCMBF與BFR變化是反映脊髓組織微循環功能狀態的兩個重要指標，可較好地反映脊髓微循環功能的損害和(或)恢復程度[11]。本次實驗中，阻斷腹主動脈后SCMBF與BFR迅速下降，反映神經細胞破壞程度NSE濃度明顯升高，開放腹主動脈后NSE濃度升高更為明顯；與此同時，SCMBF與BFR明顯低于阻斷腹主動脈前水平，表現為脊髓微循環功能障礙以及術后后肢運動功能障礙，提示阻斷與開放腹主動脈引起的脊髓微循環功能障礙與后肢運動功能的損害程度密切相關；而腹主動脈灌注REM-PCL預處理缺血脊髓組織后，SCMBF與BFR均明顯增加，脊髓運動神經元異常率明顯降低，并且后肢運動功能得到一定的恢復，說明SCIRI中REM-PCL可通過改善脊髓微循環功能起到脊髓保護的作用。
微循環是組織血流灌注的基本單位，缺血再灌注誘發的炎性反應可能引起嚴重的微循環功能障礙[12-13]。在SCIRI期間，阻斷與開放腹主動脈引起的脊髓缺血-再灌注是產生IL-lβ、IL-8、MDA和ROS等炎性介質的重要因素[14]，這些炎性介質可以直接對脊髓神經細胞線粒體膜造成炎性損傷[15]。而本研究觀察到阻斷與開放腹主動脈后，隨著再灌注時間延長，反映脊髓神經細胞線粒體內抗氧化能力的重要指標GSH-PX、SOD和T-AOC[16-17]均明顯降低，而反映線粒體膜通透性和流動性損傷程度的MSD[18-19]、反映神經細胞破壞程度的NSE[12]以及反映炎性反應程度的IL-lβ、IL-8、MDA和ROS[14, 20]水平均升高，與此同時，再灌注過程中SCMBF與BFR恢復程度較差，從而證實脊髓炎性反應通過破壞線粒體膜結構與抗氧化能力而加重脊髓微循環功能障礙，提示SCIRI中抑制炎性反應對于減輕脊髓微循環功能障礙有著重要的治療意義。
MOR屬G蛋白偶聯的受體，MOR結合G蛋白膜受體后可通過調控線粒體ATP敏感性鉀通道開放/關閉狀態來減少炎性介質釋放[21-22]。我們既往的動物實驗結果表明，REM-PCL可通過調節MOR信號通路轉導提升心肌細胞線粒體抗氧化能力[23]。而本次研究中，在炎性反應和氧化應激兩個方面均觀察到SCIRI中腹主動脈灌注MOR特異性激動劑REM-PCL預處理缺血脊髓組織后NSE濃度明顯降低直至恢復到缺血前水平，且在開放腹主動脈后的再灌注過程中發現REM-PCL對神經細胞線粒體膜結構起到較好的保護效應；應用REM-PCL預處理缺血脊髓后神經細胞線粒體SOD及GSH-PX水平明顯上升，MSD、IL-lβ、IL-8、ROS及MDA水平明顯下降，說明REM-PCL在一定程度上抑制了IL-lβ、IL-8、MDA和ROS等炎性介質引起的炎性反應，并促進神經細胞線粒體抗氧化能力迅速恢復；此外，在脊髓微循環功能監測及后肢運動功能實驗兩個方面本實驗還觀察到，腹主動脈灌注REM-PCL后脊髓微循環功能恢復較迅速，SCMBF與BFR均表現為明顯上升，這種改變與再灌注期間后肢運動功能改善同步變化。
綜上所述，SCIRI是胸降及胸腹主動脈瘤等手術過程中可能出現的并發癥，MOR激動劑是臨床麻醉中廣泛應用的鎮痛藥物，本研究不僅對阿片類藥物在臨床應用研究中具有重要的意義，還可促進阿片類藥物的神經保護研究及新型藥物研發。SCIRI期間發生的炎性反應可引起神經細胞線粒體膜結構的完整性損害及抗氧化能力降低，而腹主動脈灌注REM-PCL可通過抑制炎性反應及線粒體氧化應激程度來改善脊髓微循環功能，并促進后肢運動功能恢復。當前研究還存在不足之處，首先，本研究并未采用其他分子生物學方法檢測REM-PCL對脊髓炎性反應的影響；其次，本研究并未觀察MOR特異性拮抗劑GSK1521498是否可以取消REM-PCL的抑制炎性反應作用。因此，本課題的進一步研究方向包括SCIRI中MOR及其信號轉導途徑如何調控炎性反應。
引言
有文獻報道，脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia reperfusion injury，SCIRI)期間炎性反應引起的線粒體膜結構改變及抗氧化能力下降與脊髓微循環功能障礙的發生有密切的聯系[1-2]。瑞芬太尼聚己內酯(remifentanil-poly-caprolactone, REM-PCL)是一種新型阿片類麻醉藥物[3]。我們的前期研究已證實SCIRI期間REM-PCL可通過激動Mu阿片類受體(Mu-opioid receptor，MOR)發揮其藥理作用，其中腹主動脈灌注0.1 mg/kg REM-PCL可通過改善脊髓能量代謝促進脊髓后肢神經功能的恢復[4-5]。為進一步探討REM-PCL的脊髓保護機制，本研究應用激光多普勒血流儀實時監測腹主動脈灌注REM-PCL預處理缺血脊髓后的兔L3-L4脊髓微循環功能的變化規律，并觀察REM-PCL對缺血再灌注損傷脊髓線粒體抗氧化能力以及炎性反應的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑
REM-PCL(發明專利號：200810045272.8，貴州省人民醫院麻醉實驗室合成)[3]；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)試劑盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒、總抗氧化能力(total anti-oxidation capacity，T-AOC)試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒與活性氧(reactive oxygen species，ROS)活力試劑盒均購自中國上海研吉生物科技有限公司；白細胞介素-lβ(interleukin-lβ，IL-lβ)、神經元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)及白細胞介素-8(interleukin-8，IL-8)ELISA試劑盒均購自美國USCNLIFE公司。
1.2 動物分組及模型建立
四川大學實驗動物中心提供新西蘭大白兔36只(動物合格證號為:SCXK(川)2009-045)，體重2~2.5 kg，雌雄不限，每組12只，隨機分為3組：對照組(簡稱C組)、REM-PCL組(簡稱R組)及假手術組(簡稱S組)。參照文獻[5]建立SCIRI動物模型，耳緣靜脈注射30 mg/kg的1.5%戊巴比妥鈉和0.25 mg/kg維庫溴銨麻醉氣管插管后機械通氣，消毒鋪巾左側腹股溝區，左側股動脈穿刺置入硬膜外導管至左腎動脈起始點下方2 cm處。腹部消毒鋪巾后逐層進入腹腔，生理鹽水紗墊覆蓋腹腔臟器，分離顯露腹主動脈至左腎動脈始點下方約0.5 cm處，耳緣靜脈注射1 mg/kg肝素后使用中號動脈夾暫時夾閉腹主動脈，確定夾閉點以下腹主動脈搏動停止，阻斷腹主動脈血流45 min后移除動脈夾開放腹主動脈血流，建立腰段脊髓缺血再灌注損傷；術中監測平均動脈壓、脈搏氧飽和度、心電圖、動脈血氣及維持肛門溫度36~37 ℃。R組于阻斷腹主動脈即刻，經導管腹主動脈內局部灌注0.1 mg/kg REM-PCL預處理缺血脊髓組織5 min[4-5]。C組灌注等容量生理鹽水。S組未阻斷腹主動脈，僅進行開腹手術操作，于對應時間點測定各觀察指標。其中每組隨機選取6只動物于缺血前及再灌注期間進行后肢神經功能評分(neurologic function scores，NFS)。
1.3 觀察指標
1.3.1 后肢神經功能評分
由不了解分組情況的兩名觀測者分別于缺血前、再灌注6 h、12 h和24 h進行NFS，包括：①后肢反射功能評分，參照Reuter標準[6]測定后肢反射功能；②后肢運動功能評分，參照Jacobs分級標準[7]測定后肢運動功能。
1.3.2 血液指標檢測
參照試劑盒說明書，采用Elx800酶標儀(美國Bio-TEK公司)于缺血前、缺血45 min、再灌注30 min、再灌注60 min、再灌注6 h、再灌注12 h及再灌注24 h各時間點采集股靜脈血2 mL，雙抗體夾心ELISA法檢測NSE、IL-lβ及IL-8濃度。
1.3.3 脊髓微循環測量
參照文獻[8], 采用Peri Flux System 5001型多通道系統激光多普勒血流儀(瑞典PERIMED公司)分別于缺血前、再灌注15 min、再灌注30 min、再灌注60 min及再灌注120 min各時間點測定L3-L4脊髓微循環功能：消毒鋪巾L3-L4背部區域，逐層切開皮膚、皮下、肌肉及去除L3-L4腰椎椎板后顯露L3-L4段脊髓；將無菌血流儀激光掃描探頭置于L3-L4硬脊膜上，保持探頭與硬脊膜接觸良好以測量脊髓微循環血流參數，包括以灌注單位(perfusion unit，PU)表示的脊髓微循環血流量(spinal cord microcirculatory blood flow，SCMBF)及以速度單位(velocity unit, VU)表示的血流速度(blood flow rate，BFR)。
1.3.4 脊髓組織指標檢測
分別于缺血前、缺血45 min、再灌注30 min和60 min時取脊髓L3-L4節段脊髓組織, 一部分脊髓組織固定于10%福爾馬林中用于脊髓神經元異常率檢測；參照文獻[9-10]，另一部分脊髓組織用于制備脊髓組織神經細胞線粒體：在0～4℃冰浴條件下的脊髓組織中分別加入1：9(w/v)比例的分離液(0.225 mol/L D-mannitol pH 7.4、0.075 mol/L sucrose、10 mol/L Tris-HCl及0.05 mol/L EDTA)超聲勻漿后600 r/min離心5 min后，再將分離液懸浮沉淀進行超聲勻漿，4 ℃中600×g離心5 min，所得上清液再于4 ℃環境下10 000 r/min離心10 min，采用考馬斯亮藍法測定線粒體懸液蛋白濃度。按照試劑盒操作說明書，6405型紫外分光光度計(英國JENWAY公司)測定脊髓組織神經細胞線粒體ROS、MDA、GSH-PX、SOD及T-AOC，并檢測線粒體懸液520 nm處吸光度值作為線粒體腫脹度(mitochondrial swelling degree，MSD)指標[10]。參照文獻[5, 8]測量Ⅷ-Ⅸ區脊髓前角神經元異常率：神經元異常率(%)=每張切片的所選視野中的異常神經元數/該視野中神經元總數×100%。
1.4 統計學方法
采用SPSS 16.0軟件統計處理，正態分布的計量資料以均數±標準差(
2 結果
2.1 一般情況
實驗過程中，實驗動物均無意外死亡，手術結束2 h內實驗動物均完全清醒，術后均無感染。
2.2 再灌注各時間點后肢NFS變化
2.2.1 Reuter評分
運動反射功能障礙越嚴重其Reuter分值越高。3組實驗動物缺血前Reuter分值均為0分。C組與缺血前及S組比較Reuter分值明顯增加(P＜0.01)。R組Reuter分值明顯低于C組，組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，如表 1所示。
表1
三組后肢NFS的變化(2.2.2 Jacobs評分
運動反射功能障礙越嚴重其Jacobs分值越低。3組實驗動物缺血前Jacobs分值均為5分。C組與缺血前及S組比較Jacobs分值明顯下降(P＜0.01)。C組Jacobs分值明顯低于于R組，組組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，如表 1所示。
2.3 血清IL-lβ、IL-8及NSE濃度變化
S組IL-lβ、IL-8及NSE均無明顯變化。與缺血前及S組比較，C組的IL-lβ、IL-8及NSE濃度在缺血45 min及再灌注各時間點明顯升高(P＜0.01)。再灌注60 min時R組IL-lβ、IL-8及NSE濃度恢復至缺血前水平，缺血45 min及再灌注各時間點R組IL-lβ、IL-8及NSE濃度均明顯低于C組(P＜0.01)，如表 2所示。
表2
3組血清NSE、IL-lβ及IL-8的變化(2.4 脊髓微循環參數變化
S組SCMBF與BFR值均無明顯變化。缺血后C組SCMBF與BFR值均迅速下降。開放腹主動脈后，隨著再灌注時間延長C組SCMBF與BFR值逐漸恢復，再灌注期間各時間點SCMBF與BFR值均明顯低于缺血前和S組水平，與缺血前和S組比較差異均有統計學意義(P＜0.01)。再灌注15 min時R組SCMBF與BFR值恢復至缺血前水平，再灌注期間各時間點與C組組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，表現為SCMBF與BFR值均明顯高于C組，如表 3所示。
表3
BFR及SCMBF變化
Table3.
Changes of BFR and SCMBF
2.5 脊髓神經細胞線粒體MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD的變化
S組MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD值均無明顯變化。線粒體腫脹表現為520 nm處吸光值的降低。與缺血前及S組比較，C組脊髓缺血后MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD均明顯降低(P＜0.01)，再灌注期間MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD進一步降低(P＜0.01)；R組MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD在缺血45 min時均降低(P＜0.05)，再灌注30 min時R組MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD恢復至缺血前水平。缺血45 min、再灌注30 min和60 min時R組MSD、T-AOC、GSH-PX和SOD均明顯高于C組，組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，如表 4所示。
表4
脊髓神經細胞線粒體MSD、T-AOC、GSH-PX、SOD、MDA、MSD、ROS和運動神經元異常率變化
Table4.
Changes of MSD, T-AOC, GSH-PX, SOD, MDA, MSD, ROS and abnormal rate of motor neuron
2.6 運動神經元異常率、脊髓神經細胞線粒體MDA與ROS的變化
S組運動神經元異常率、MDA與ROS值均無明顯變化。與缺血前及S組比較，C組脊髓缺血后運動神經元異常率、MDA與ROS均顯著升高(P＜0.01)，再灌注期間運動神經元異常率、MDA與ROS均持續升高(P＜0.01)；R組運動神經元異常率(P＜0.01)、MDA與ROS在缺血45 min均升高(P＜0.05)，MDA與ROS于再灌注30 min時均恢復至缺血前水平。在缺血45 min、再灌注30 min和60 min各時間點R組與C組組間比較差異有統計學意義(P＜0.01)，R組運動神經元異常率、MDA與ROS均明顯低于C組，如表 4所示。
3 討論
研究發現，脊髓微循環血液流變學與血流動力學的改變影響著SCIRI的發生、發展及藥物治療效果[8]。SCMBF與BFR變化是反映脊髓組織微循環功能狀態的兩個重要指標，可較好地反映脊髓微循環功能的損害和(或)恢復程度[11]。本次實驗中，阻斷腹主動脈后SCMBF與BFR迅速下降，反映神經細胞破壞程度NSE濃度明顯升高，開放腹主動脈后NSE濃度升高更為明顯；與此同時，SCMBF與BFR明顯低于阻斷腹主動脈前水平，表現為脊髓微循環功能障礙以及術后后肢運動功能障礙，提示阻斷與開放腹主動脈引起的脊髓微循環功能障礙與后肢運動功能的損害程度密切相關；而腹主動脈灌注REM-PCL預處理缺血脊髓組織后，SCMBF與BFR均明顯增加，脊髓運動神經元異常率明顯降低，并且后肢運動功能得到一定的恢復，說明SCIRI中REM-PCL可通過改善脊髓微循環功能起到脊髓保護的作用。
微循環是組織血流灌注的基本單位，缺血再灌注誘發的炎性反應可能引起嚴重的微循環功能障礙[12-13]。在SCIRI期間，阻斷與開放腹主動脈引起的脊髓缺血-再灌注是產生IL-lβ、IL-8、MDA和ROS等炎性介質的重要因素[14]，這些炎性介質可以直接對脊髓神經細胞線粒體膜造成炎性損傷[15]。而本研究觀察到阻斷與開放腹主動脈后，隨著再灌注時間延長，反映脊髓神經細胞線粒體內抗氧化能力的重要指標GSH-PX、SOD和T-AOC[16-17]均明顯降低，而反映線粒體膜通透性和流動性損傷程度的MSD[18-19]、反映神經細胞破壞程度的NSE[12]以及反映炎性反應程度的IL-lβ、IL-8、MDA和ROS[14, 20]水平均升高，與此同時，再灌注過程中SCMBF與BFR恢復程度較差，從而證實脊髓炎性反應通過破壞線粒體膜結構與抗氧化能力而加重脊髓微循環功能障礙，提示SCIRI中抑制炎性反應對于減輕脊髓微循環功能障礙有著重要的治療意義。
MOR屬G蛋白偶聯的受體，MOR結合G蛋白膜受體后可通過調控線粒體ATP敏感性鉀通道開放/關閉狀態來減少炎性介質釋放[21-22]。我們既往的動物實驗結果表明，REM-PCL可通過調節MOR信號通路轉導提升心肌細胞線粒體抗氧化能力[23]。而本次研究中，在炎性反應和氧化應激兩個方面均觀察到SCIRI中腹主動脈灌注MOR特異性激動劑REM-PCL預處理缺血脊髓組織后NSE濃度明顯降低直至恢復到缺血前水平，且在開放腹主動脈后的再灌注過程中發現REM-PCL對神經細胞線粒體膜結構起到較好的保護效應；應用REM-PCL預處理缺血脊髓后神經細胞線粒體SOD及GSH-PX水平明顯上升，MSD、IL-lβ、IL-8、ROS及MDA水平明顯下降，說明REM-PCL在一定程度上抑制了IL-lβ、IL-8、MDA和ROS等炎性介質引起的炎性反應，并促進神經細胞線粒體抗氧化能力迅速恢復；此外，在脊髓微循環功能監測及后肢運動功能實驗兩個方面本實驗還觀察到，腹主動脈灌注REM-PCL后脊髓微循環功能恢復較迅速，SCMBF與BFR均表現為明顯上升，這種改變與再灌注期間后肢運動功能改善同步變化。
綜上所述，SCIRI是胸降及胸腹主動脈瘤等手術過程中可能出現的并發癥，MOR激動劑是臨床麻醉中廣泛應用的鎮痛藥物，本研究不僅對阿片類藥物在臨床應用研究中具有重要的意義，還可促進阿片類藥物的神經保護研究及新型藥物研發。SCIRI期間發生的炎性反應可引起神經細胞線粒體膜結構的完整性損害及抗氧化能力降低，而腹主動脈灌注REM-PCL可通過抑制炎性反應及線粒體氧化應激程度來改善脊髓微循環功能，并促進后肢運動功能恢復。當前研究還存在不足之處，首先，本研究并未采用其他分子生物學方法檢測REM-PCL對脊髓炎性反應的影響；其次，本研究并未觀察MOR特異性拮抗劑GSK1521498是否可以取消REM-PCL的抑制炎性反應作用。因此，本課題的進一步研究方向包括SCIRI中MOR及其信號轉導途徑如何調控炎性反應。
