肺癌死亡率居世界腫瘤首位, 5年生存率不足15%, 順鉑耐藥是死亡率居高不下的重要原因, 本文將探討光敏劑MPPa介導的光動力療法誘導人非小細胞肺癌順鉑耐藥株A549/DDP發生凋亡的現象及其機制。課題組分別給予不同濃度光敏劑MPPa(0、1、2、4、8、16 μmol/L)、不同能量光照(0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2)處理細胞, CCK-8法檢測細胞活性。將細胞分為對照組、MPPa組(2 μmol/L MPPa)、光照組(2.4 J/cm2光能量密度)和MPPa介導光動力組(PDT組)(2 μmol/L MPPa、2.4 J/cm2光能量密度)。應用Anne-V/PI雙染流式細胞技術檢測細胞凋亡; DCFH-DA染色觀察細胞內活性氧產生; 蛋白質印跡法(Western blot)檢測B淋巴細胞瘤-2(Bcl-2)蛋白和Bcl-2相關X蛋白(Bax)的表達。實驗結果顯示, 單純光照及MPPa對細胞生長無抑制作用; MPPa介導光動力卻對人肺癌耐順鉑細胞A549/DDP有顯著殺傷作用, 其殺傷作用呈明顯的劑量效應關系(P＜0.05);PDT組發生凋亡率均高于各對照組(P＜0.05);DCFH-DA染色發現PDT組細胞內活性氧明顯高于各對照組; Western blot檢測發現PDT組Bax蛋白表達升高, Bcl-2蛋白表達降低。實驗證實MPPa介導的光動力療法可抑制肺癌順鉑耐藥細胞A549/DDP活性, 并誘導其凋亡。
引用本文： 羅麗, 于廷和, 白定群, 胡麗娜. MPPa光動力療法誘導人肺癌順鉑耐藥細胞凋亡. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(4): 729-734. doi: 10.7507/1001-5515.20160119 復制
引言
肺癌發病率及致死率位居全世界癌癥之首[1-2], 即使近三十年來靶向治療等手段用于臨床，但其五年生存率仍只有15%[3]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80％以上，其一線化療方案是以順鉑為基礎的聯合化療[4-5]，但耐藥性的產生會導致治療失敗，因此尋找治療耐藥肺癌的手段迫在眉睫。光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種物理治療[6]，其原理是將光敏劑富集于腫瘤細胞后，經過特定波長的光激發，產生具有細胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，從而導致腫瘤細胞死亡[7]。MPPa(pyropheophorbide-a methyl ester)是第二代光敏劑，性質穩定, 量子產率較高[8]。MPPa介導PDT對順鉑耐藥細胞的效應報道較少，本課題將探討MPPa介導的PDT對順鉑耐藥的人非小細胞肺癌細胞A549/DDP的殺傷作用，為其應用于肺癌耐藥的治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑
半導體發生二極管(light emitting diode, LED)光源由本課題組自行研制(波長630 nm、連續輸出方式、光功率密度30 mW/cm2)，光能量密度(J/cm2)=光功率密度(mW/cm2)×光照時間(s)。光敏劑MPPa：美國Sigma-Aldrich公司；RMPI 1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶：美國HyClone公司；CCK-8：日本同仁公司；Anne-V/PI雙染檢測試劑盒：美國凱基生物技術有限公司；B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗體：美國Abcam公司。
1.2 細胞
人非小細胞肺癌順鉑耐藥株A549/DDP由重慶醫科大學生命科學院廖飛教授惠贈(耐藥指數＞4)，采用RPMI 1640細胞培養基(含10%胎牛血清、50 μg/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素)置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。培養基中加入2 μg/mL順鉑共同培養以保持耐藥性，細胞用于實驗前常規脫藥7天。
1.3 CCK-8檢測細胞活性
1.3.1 檢測單純光照對細胞活性影響
取對數生長期的A549/DDP細胞按5×103個/孔接種于96孔板，細胞貼壁后給予不同能量光照(0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2)，24 h后加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h，測量細胞活性。
1.3.2 檢測單純MPPa對細胞活性影響
種板同上，細胞貼壁后各孔加入含不同濃度MPPa(0、1、2、4、8、16 μmol/L)的完全培養基，繼續培養12 h后換液，培養基中加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h后測量細胞活性。
1.3.3 檢測PDT對細胞活性影響
種板同上，細胞貼壁后加入2 μmol/L MPPa孵育12 h后換液，給予2.4 J/cm2能量密度光照，24 h后加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h，測細胞活性。
1.3.4 細胞活性計算方式
應用酶標儀在450 nm處檢測各孔光密度值[D(450)]，計算細胞活性。細胞活性=[實驗組D(450)值－本底組D(450)值]∕[對照組D(450)值－本底組D(450)值]。本底組僅加入完全培養基，對照組含細胞和完全培養基，實驗組分別按上述方法給予光照、MPPa或PDT進行處理。每組重復3次。
1.4 細胞分組
取對數生長期的A549/DDP細胞按5×103個/孔接種于96孔板，貼壁后隨機分為對照組、MPPa組、光照組和PDT組，各組設復孔5個。對照組：給予完全培養基常規培養。MPPa組：給予2 μmol/L MPPa處理12 h。光照組：給予2.4 J/cm2光能量密度光照。PDT組：予2 μmol/L MPPa孵育12 h后換液再給予2.4 J/cm2光能量密度光照。
1.5 Anne-V/PI檢測細胞凋亡
按1.4節所述細胞分組及處理，24 h后棄去培養液，PBS緩沖液輕柔洗滌細胞兩遍，胰酶消化收集細胞。在每個處理組中加入200 μL binding buffer液重懸細胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染料，混勻，室溫下避光反應15 min，隨即用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。
1.6 DCFH-DA染色檢測細胞內ROS
按1.4節所述細胞分組及處理，1 h后棄去培養基，PBS洗滌2遍，加入含10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養基，避光孵育30 min，PBS漂洗2遍，倒置熒光顯微鏡下觀察并照相。顯示綠色熒光則代表產生ROS。
1.7 Western blot檢測蛋白表達
按1.4節所述細胞分組及處理，24 h后棄去培養基，4 ℃預冷的PBS輕柔漂洗2遍，加入裂解液(RAPI：PMSF=1：100)冰浴10 min，提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度，繪制標準曲線，計算各個蛋白樣品濃度，并配平。按體積比6×蛋白Loading Buffer：蛋白=1：5的比例，將6×蛋白Loading Buffer及蛋白混勻，沸水浴15 min。根據各蛋白分子量選擇并配置適宜濃度的分離膠及濃縮膠。加樣時第一孔加入Marker 5 μL，再依次加入各組蛋白(等濃度)20μL；恒壓電泳(濃縮膠80 V、1 h，分離膠100 V、 1 h)，見溴酚藍到達分離膠底端，電泳結束。250 mA、 100 V恒壓轉入PVDF膜，2 h。5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入一抗(1：1 000稀釋)4 ℃過夜，TBST漂洗3×10 min，加入二抗(1：1 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST漂洗3×10 min，ECL化學發光法顯示條帶，GAPDH為內參。
1.8 統計學分析
實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 光照、MPPa及PDT分別對細胞活性的影響
單純光照在能量密度為0～28.8 J/cm2范圍內對A549/DDP細胞生長無抑制作用。MPPa對細胞活性的抑制作用呈劑量依賴性，當MPPa濃度＜2 μmol/L時，細胞活性＞85%，說明低濃度MPPa無細胞暗毒性。PDT對細胞活性隨能量密度增加，細胞活性降低；當能量密度為2.4 J/cm2時，細胞活性為45.51%±0.47%，如圖 1所示。
圖1
光照、MPPa及PDT對細胞活性的影響
Figure1.
Effects of light, MPPa and PDT on cell viability
2.2 PDT誘導凋亡
如圖 2所示，對照組、光照組、MPPa組及PDT組的凋亡率分別為5.91%±2.49%、5.80%±3.81%、6.14%±1.14%、30.60%±3.52%。PDT組凋亡率明顯高于對照組、光照組及MPPa組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；對照組、光照組和MPPa組組間差異無統計學意義(P＞0.05)。
圖2
流式檢測細胞凋亡
Figure2.
Cell apoptotic detected with flow cytometry
2.3 PDT誘導A549/DDP細胞內ROS產生
綠色熒光代表產生ROS，如圖 3所示，對照組、光照組、MPPa組幾乎無綠色熒光表達，而PDT組綠色熒光較強，明顯高于對照組、光照組及MPPa組，說明對照組、光照組、MPPa組無ROS產生，PDT促使A549/DDP細胞內ROS含量明顯增加(如圖 3所示)。
圖3
DCFH-DA染色檢測細胞內ROS(綠色熒光標記ROS)
Figure3.
Detection of ROS with DCFH-DA staining
2.4 PDT對凋亡相關蛋白表達的影響
如圖 4所示，在對照組、光照組和MPPa組中，促凋亡蛋白Bax呈低表達，PDT組Bax表達明顯高于對照組、光照組和MPPa組；Bax表達在對照組、光照組和MPPa組組間差異無統計學意義。抑制凋亡蛋白Bcl-2在對照組、光照組和MPPa組中呈高表達，而在PDT組中表達明顯降低；Bcl-2表達在對照組、光照組及MPPa組組間差異無統計學意義(如圖 4所示)。
圖4
蛋白印跡法檢測Bax、Bcl-2的表達
Figure4.
Expression of Bax and Bcl-2 proteins assessed by Western blot analysis
3 討論
目前肺癌嚴重威脅著人類生命健康，而傳統的治療方法均存在一定局限性。以鉑類為基礎的聯合化療是治療肺癌的標準化療方案。順鉑通過與DNA發生加合，損傷DNA，誘導細胞凋亡從而發揮抗腫瘤作用。然而NSCLC順鉑耐藥發生率高，且順鉑耐藥機制復雜，主要包括：細胞內順鉑含量減少、DNA修復能力增強和藥物去活作用增加等[9]。基于以上原因，要尋找到合適的耐藥修飾劑困難，目前尚無理想的順鉑耐藥逆轉劑應用于臨床。PDT是一種非侵入性的物理療法，可用于殺傷腫瘤細胞、細菌、病毒和其他微生物，其三大要素是光、光敏劑和氧。本實驗旨在探討PDT對順鉑耐藥肺癌細胞增殖的影響及可能的機制，為治療順鉑耐藥肺癌提供實驗室依據。
PDT具有安全無毒、副作用小的優點[10]。本實驗結果表明單獨光照或低劑量MPPa對細胞生長無抑制作用，這就避免了光照和光敏劑對正常組織產生毒性。光敏劑進入體內會相對富集于腫瘤組織，經局部光照激發形成級聯反應，產生ROS，導致細胞死亡，從而實現局部靶向性[11]。在本實驗中，PDT能有效抑制順鉑耐藥細胞增殖，PDT組凋亡率明顯高于對照組、光照組及MPPa組。同時我們對PDT誘導凋亡的機制進行了研究。MPPa經光照射后從單線基態(S0)激發到第一激發單重態(S1)并快速回到基態；或激發形成較長時間存在的激發三重態(T1)，通過能量躍遷產生ROS[12]。實驗結果顯示，PDT組ROS產量明顯增加。有研究表明PDT介導的細胞死亡主要是因為具有強氧化性的ROS損傷線粒體，細胞勢能下降，細胞色素C釋放入胞質，細胞色素C聯合Apf-1和procaspase-9產生凋亡小體，激活caspase-9，-2，-3，-6，-7和水解酶，導致細胞蛋白水解、DNA斷裂，最終引起細胞死亡[13]。也有研究認為細胞應激時內質網和線粒體接觸部位P53增加，通過ER-Ca2+-ATP酶增加Ca2+水平，Ca2+超負荷引起線粒體通透性增加，線粒體發生腫脹、破裂，釋放促凋亡因子，激活caspase級聯反應，從而誘發凋亡[14]。于是我們檢測了線粒體凋亡途徑相關蛋白的表達情況，發現PDT組促凋亡蛋白Bax表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達降低。Bcl-2與Bax的表達在線粒體凋亡途徑中至關重要。在氧化應激狀態下，ROS可激活p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK), 氨基端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK), 細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)和Akt通路，從而改變Bcl-2家族成員功能[15]。過氧化氫(H2O2)通過形成Cys-62/Cys-126二硫鍵誘導Bax形成同型二聚體，增加線粒體通透性，促進細胞色素C及促凋亡因子釋放，誘導凋亡[16]。
綜上所述，本研究證實MPPa介導的光動力學療法能夠通過產生ROS、激活線粒體凋亡通路從而抑制順鉑耐藥的肺癌細胞A549/DDP增殖，誘導其發生凋亡。因光照激發光敏劑產生的ROS半衰期極短，擴散距離＜100 nm，故光損傷的部位取決于所用光敏劑在細胞中的亞定位[17]。有研究認為富集于線粒體和內質網的光敏劑常誘發凋亡, 富集于細胞膜或溶酶體的光敏劑常誘發壞死[18]。PDT還可誘導自噬的發生[19]。細胞的死亡形式不是單因素決定的，它取決于細胞類型、光敏劑濃度、光的類型和劑量[20]。無論何種細胞死亡方式，PDT都為腫瘤治療提供了一種新方法。研究報道吲哚菁綠介導的PDT與VP-16聯用具有協同效應，與鉑類藥物聯用具有加和或協同效應[21]。這表明PDT將有望增敏化療，對于無法承受常規化療劑量的病例具有深遠的意義。在下一步工作中，我們將對PDT與化療藥物之間的相互作用進行深入探討，為其在降低治療副反應、降低化療藥物劑量、克服耐藥等方面提供更有力的證據。
引言
肺癌發病率及致死率位居全世界癌癥之首[1-2], 即使近三十年來靶向治療等手段用于臨床，但其五年生存率仍只有15%[3]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)占肺癌的80％以上，其一線化療方案是以順鉑為基礎的聯合化療[4-5]，但耐藥性的產生會導致治療失敗，因此尋找治療耐藥肺癌的手段迫在眉睫。光動力療法(photodynamic therapy，PDT)是一種物理治療[6]，其原理是將光敏劑富集于腫瘤細胞后，經過特定波長的光激發，產生具有細胞毒性的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，從而導致腫瘤細胞死亡[7]。MPPa(pyropheophorbide-a methyl ester)是第二代光敏劑，性質穩定, 量子產率較高[8]。MPPa介導PDT對順鉑耐藥細胞的效應報道較少，本課題將探討MPPa介導的PDT對順鉑耐藥的人非小細胞肺癌細胞A549/DDP的殺傷作用，為其應用于肺癌耐藥的治療提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 主要儀器與試劑
半導體發生二極管(light emitting diode, LED)光源由本課題組自行研制(波長630 nm、連續輸出方式、光功率密度30 mW/cm2)，光能量密度(J/cm2)=光功率密度(mW/cm2)×光照時間(s)。光敏劑MPPa：美國Sigma-Aldrich公司；RMPI 1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶：美國HyClone公司；CCK-8：日本同仁公司；Anne-V/PI雙染檢測試劑盒：美國凱基生物技術有限公司；B淋巴細胞瘤-2(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗體：美國Abcam公司。
1.2 細胞
人非小細胞肺癌順鉑耐藥株A549/DDP由重慶醫科大學生命科學院廖飛教授惠贈(耐藥指數＞4)，采用RPMI 1640細胞培養基(含10%胎牛血清、50 μg/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素)置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。培養基中加入2 μg/mL順鉑共同培養以保持耐藥性，細胞用于實驗前常規脫藥7天。
1.3 CCK-8檢測細胞活性
1.3.1 檢測單純光照對細胞活性影響
取對數生長期的A549/DDP細胞按5×103個/孔接種于96孔板，細胞貼壁后給予不同能量光照(0、0.6、1.2、2.4、3.6、4.8 J/cm2)，24 h后加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h，測量細胞活性。
1.3.2 檢測單純MPPa對細胞活性影響
種板同上，細胞貼壁后各孔加入含不同濃度MPPa(0、1、2、4、8、16 μmol/L)的完全培養基，繼續培養12 h后換液，培養基中加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h后測量細胞活性。
1.3.3 檢測PDT對細胞活性影響
種板同上，細胞貼壁后加入2 μmol/L MPPa孵育12 h后換液，給予2.4 J/cm2能量密度光照，24 h后加入CCK-8溶液10 μL/孔，孵育1 h，測細胞活性。
1.3.4 細胞活性計算方式
應用酶標儀在450 nm處檢測各孔光密度值[D(450)]，計算細胞活性。細胞活性=[實驗組D(450)值－本底組D(450)值]∕[對照組D(450)值－本底組D(450)值]。本底組僅加入完全培養基，對照組含細胞和完全培養基，實驗組分別按上述方法給予光照、MPPa或PDT進行處理。每組重復3次。
1.4 細胞分組
取對數生長期的A549/DDP細胞按5×103個/孔接種于96孔板，貼壁后隨機分為對照組、MPPa組、光照組和PDT組，各組設復孔5個。對照組：給予完全培養基常規培養。MPPa組：給予2 μmol/L MPPa處理12 h。光照組：給予2.4 J/cm2光能量密度光照。PDT組：予2 μmol/L MPPa孵育12 h后換液再給予2.4 J/cm2光能量密度光照。
1.5 Anne-V/PI檢測細胞凋亡
按1.4節所述細胞分組及處理，24 h后棄去培養液，PBS緩沖液輕柔洗滌細胞兩遍，胰酶消化收集細胞。在每個處理組中加入200 μL binding buffer液重懸細胞后，加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL碘化丙啶(propidium iodide, PI)染料，混勻，室溫下避光反應15 min，隨即用流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。
1.6 DCFH-DA染色檢測細胞內ROS
按1.4節所述細胞分組及處理，1 h后棄去培養基，PBS洗滌2遍，加入含10 μmol/L DCFH-DA的無血清培養基，避光孵育30 min，PBS漂洗2遍，倒置熒光顯微鏡下觀察并照相。顯示綠色熒光則代表產生ROS。
1.7 Western blot檢測蛋白表達
按1.4節所述細胞分組及處理，24 h后棄去培養基，4 ℃預冷的PBS輕柔漂洗2遍，加入裂解液(RAPI：PMSF=1：100)冰浴10 min，提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度，繪制標準曲線，計算各個蛋白樣品濃度，并配平。按體積比6×蛋白Loading Buffer：蛋白=1：5的比例，將6×蛋白Loading Buffer及蛋白混勻，沸水浴15 min。根據各蛋白分子量選擇并配置適宜濃度的分離膠及濃縮膠。加樣時第一孔加入Marker 5 μL，再依次加入各組蛋白(等濃度)20μL；恒壓電泳(濃縮膠80 V、1 h，分離膠100 V、 1 h)，見溴酚藍到達分離膠底端，電泳結束。250 mA、 100 V恒壓轉入PVDF膜，2 h。5%脫脂牛奶常溫封閉1 h，加入一抗(1：1 000稀釋)4 ℃過夜，TBST漂洗3×10 min，加入二抗(1：1 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST漂洗3×10 min，ECL化學發光法顯示條帶，GAPDH為內參。
1.8 統計學分析
實驗數據以均數±標準差(
2 結果
2.1 光照、MPPa及PDT分別對細胞活性的影響
單純光照在能量密度為0～28.8 J/cm2范圍內對A549/DDP細胞生長無抑制作用。MPPa對細胞活性的抑制作用呈劑量依賴性，當MPPa濃度＜2 μmol/L時，細胞活性＞85%，說明低濃度MPPa無細胞暗毒性。PDT對細胞活性隨能量密度增加，細胞活性降低；當能量密度為2.4 J/cm2時，細胞活性為45.51%±0.47%，如圖 1所示。
圖1
光照、MPPa及PDT對細胞活性的影響
Figure1.
Effects of light, MPPa and PDT on cell viability
2.2 PDT誘導凋亡
如圖 2所示，對照組、光照組、MPPa組及PDT組的凋亡率分別為5.91%±2.49%、5.80%±3.81%、6.14%±1.14%、30.60%±3.52%。PDT組凋亡率明顯高于對照組、光照組及MPPa組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；對照組、光照組和MPPa組組間差異無統計學意義(P＞0.05)。
圖2
流式檢測細胞凋亡
Figure2.
Cell apoptotic detected with flow cytometry
2.3 PDT誘導A549/DDP細胞內ROS產生
綠色熒光代表產生ROS，如圖 3所示，對照組、光照組、MPPa組幾乎無綠色熒光表達，而PDT組綠色熒光較強，明顯高于對照組、光照組及MPPa組，說明對照組、光照組、MPPa組無ROS產生，PDT促使A549/DDP細胞內ROS含量明顯增加(如圖 3所示)。
圖3
DCFH-DA染色檢測細胞內ROS(綠色熒光標記ROS)
Figure3.
Detection of ROS with DCFH-DA staining
2.4 PDT對凋亡相關蛋白表達的影響
如圖 4所示，在對照組、光照組和MPPa組中，促凋亡蛋白Bax呈低表達，PDT組Bax表達明顯高于對照組、光照組和MPPa組；Bax表達在對照組、光照組和MPPa組組間差異無統計學意義。抑制凋亡蛋白Bcl-2在對照組、光照組和MPPa組中呈高表達，而在PDT組中表達明顯降低；Bcl-2表達在對照組、光照組及MPPa組組間差異無統計學意義(如圖 4所示)。
圖4
蛋白印跡法檢測Bax、Bcl-2的表達
Figure4.
Expression of Bax and Bcl-2 proteins assessed by Western blot analysis
3 討論
目前肺癌嚴重威脅著人類生命健康，而傳統的治療方法均存在一定局限性。以鉑類為基礎的聯合化療是治療肺癌的標準化療方案。順鉑通過與DNA發生加合，損傷DNA，誘導細胞凋亡從而發揮抗腫瘤作用。然而NSCLC順鉑耐藥發生率高，且順鉑耐藥機制復雜，主要包括：細胞內順鉑含量減少、DNA修復能力增強和藥物去活作用增加等[9]。基于以上原因，要尋找到合適的耐藥修飾劑困難，目前尚無理想的順鉑耐藥逆轉劑應用于臨床。PDT是一種非侵入性的物理療法，可用于殺傷腫瘤細胞、細菌、病毒和其他微生物，其三大要素是光、光敏劑和氧。本實驗旨在探討PDT對順鉑耐藥肺癌細胞增殖的影響及可能的機制，為治療順鉑耐藥肺癌提供實驗室依據。
PDT具有安全無毒、副作用小的優點[10]。本實驗結果表明單獨光照或低劑量MPPa對細胞生長無抑制作用，這就避免了光照和光敏劑對正常組織產生毒性。光敏劑進入體內會相對富集于腫瘤組織，經局部光照激發形成級聯反應，產生ROS，導致細胞死亡，從而實現局部靶向性[11]。在本實驗中，PDT能有效抑制順鉑耐藥細胞增殖，PDT組凋亡率明顯高于對照組、光照組及MPPa組。同時我們對PDT誘導凋亡的機制進行了研究。MPPa經光照射后從單線基態(S0)激發到第一激發單重態(S1)并快速回到基態；或激發形成較長時間存在的激發三重態(T1)，通過能量躍遷產生ROS[12]。實驗結果顯示，PDT組ROS產量明顯增加。有研究表明PDT介導的細胞死亡主要是因為具有強氧化性的ROS損傷線粒體，細胞勢能下降，細胞色素C釋放入胞質，細胞色素C聯合Apf-1和procaspase-9產生凋亡小體，激活caspase-9，-2，-3，-6，-7和水解酶，導致細胞蛋白水解、DNA斷裂，最終引起細胞死亡[13]。也有研究認為細胞應激時內質網和線粒體接觸部位P53增加，通過ER-Ca2+-ATP酶增加Ca2+水平，Ca2+超負荷引起線粒體通透性增加，線粒體發生腫脹、破裂，釋放促凋亡因子，激活caspase級聯反應，從而誘發凋亡[14]。于是我們檢測了線粒體凋亡途徑相關蛋白的表達情況，發現PDT組促凋亡蛋白Bax表達增加，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達降低。Bcl-2與Bax的表達在線粒體凋亡途徑中至關重要。在氧化應激狀態下，ROS可激活p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK), 氨基端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK), 細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases, ERK)和Akt通路，從而改變Bcl-2家族成員功能[15]。過氧化氫(H2O2)通過形成Cys-62/Cys-126二硫鍵誘導Bax形成同型二聚體，增加線粒體通透性，促進細胞色素C及促凋亡因子釋放，誘導凋亡[16]。
綜上所述，本研究證實MPPa介導的光動力學療法能夠通過產生ROS、激活線粒體凋亡通路從而抑制順鉑耐藥的肺癌細胞A549/DDP增殖，誘導其發生凋亡。因光照激發光敏劑產生的ROS半衰期極短，擴散距離＜100 nm，故光損傷的部位取決于所用光敏劑在細胞中的亞定位[17]。有研究認為富集于線粒體和內質網的光敏劑常誘發凋亡, 富集于細胞膜或溶酶體的光敏劑常誘發壞死[18]。PDT還可誘導自噬的發生[19]。細胞的死亡形式不是單因素決定的，它取決于細胞類型、光敏劑濃度、光的類型和劑量[20]。無論何種細胞死亡方式，PDT都為腫瘤治療提供了一種新方法。研究報道吲哚菁綠介導的PDT與VP-16聯用具有協同效應，與鉑類藥物聯用具有加和或協同效應[21]。這表明PDT將有望增敏化療，對于無法承受常規化療劑量的病例具有深遠的意義。在下一步工作中，我們將對PDT與化療藥物之間的相互作用進行深入探討，為其在降低治療副反應、降低化療藥物劑量、克服耐藥等方面提供更有力的證據。
