受體相互作用蛋白激酶1在血管平滑肌細胞表型轉換中的作用研究_《生物醫學工程學雜志》

作者：

1. 四川大學華西醫院心內科, 成都 610041;
2. 四川大學華西醫院再生醫學研究中心心血管疾病研究室, 成都 610041;

關鍵詞：

受體相互作用蛋白激酶1 血管平滑肌細胞表型轉換血管緊張素Ⅱ 核因子-κB

DOI：

10.7507/1001-5515.20160118

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

血管平滑肌細胞(VSMCs)表型轉換在多種血管疾病中起著重要作用, 因此本研究旨在探索受體相互作用蛋白激酶1(RIPK1)在血管平滑肌細胞表型轉換中的表達變化及其可能起到的作用。通過血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)刺激建立VSMCs表型轉換模型, 分別采用定量PCR、Western blot檢測VSMCs表型轉換及分泌標志物、RIPK1的表達和核因子-κB(NF-κB)的P65亞基磷酸化水平的變化, 5-乙炔基-2'脫氧尿嘧啶核苷(EdU)摻入法檢測細胞增殖變化, 并用劃痕實驗檢測細胞遷移情況。同時, 應用RIPK1特異性小分子抑制劑Necrostatin-1(Nec-1), 以及特異性RIPK1-siRNA抑制RIPK1的表達, 觀察RIPK1在VSMCs表型轉換中的作用。結果顯示, Ang Ⅱ誘導VSMCs發生表型轉換后, RIPK1表達及P65磷酸化的水平明顯增加。給予Nec-1預處理或是利用RIPK1-siRNA沉默RIPK1基因后, P65的磷酸化水平呈現下調, 同時能部分逆轉VSMCs的表型轉換并抑制其分泌、增殖和遷移能力。實驗表明, Ang Ⅱ能誘導RIPK1表達上調, 同時RIPK1可能通過促進NF-κB的P65亞基磷酸化參與了VSMCs的表型轉換過程。

引用本文： 包勤學, 陳麗, 吳思媛, 趙明月, 吳文超, 付華, 劉小菁. 受體相互作用蛋白激酶1在血管平滑肌細胞表型轉換中的作用研究. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(4): 719-728. doi: 10.7507/1001-5515.20160118 復制

引言

血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)是一類主要存在于動脈中膜的高度分化的細胞。不同于一般終末分化細胞，VSMCs在受到諸如缺氧、損傷、牽張等細胞外刺激或是血小板源性生長因子-B(platelet derived growth factor-B，PDGF-B)、血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)等因子的作用下，細胞表型會由正常的收縮型(分化型)向合成型(去分化型)轉換^[1-2]。分化型VSMCs以收縮基因(如α-平滑肌肌動蛋白，α-smooth muscle actin, α-SMA)高表達和低水平的增殖、遷移、分泌能力為特點，而合成型則是以高表達Krupple樣因子4(Krupple-like factor 4, KLF4)和增強的增殖、遷移和收縮能力為特點^[3]。其中I型膠原蛋白(collagen type Ⅰ, collagen Ⅰ)和結締組織生長因子(connective tissue growth factor，CTGF)參與了VSMCs的胞外分泌，而KLF4是VSMCs由收縮表型向合成表型轉換的關鍵轉錄因子^[4-5]。VSMCs的這種表型轉換是許多血管疾病，如血管狹窄后重構、動脈粥樣硬化等發生發展的重要病理生理基礎之一^[6]。研究顯示，Notch，核因子-κB(nuclear transcription fator-κB, NF-κB)和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)等信號通路參與了VSMCs的表型轉換過程，但其中具體的分子機制仍有待進一步闡明^[7-9]。

受體相互作用蛋白激酶1(receptor-interacting protein kinases 1，RIPK1)是細胞膜上死亡受體家族觸發的細胞應答的上游調節蛋白之一^[10]。細胞在不同的胞外環境中，RIPK1能通過轉錄因子NF-κB促進細胞存活，或是經凋亡或程序性壞死(necroptosis)引發細胞死亡。據報道，RIPK1特異性小分子抑制劑Necrostatin-1(Nec-1)能夠減輕RIPK1在相關通路(如：程序性壞死)中的作用^[11]。此外，相關研究顯示RIPK1/NF-κB細胞信號通路在腸上皮細胞存活及細胞免疫等諸多過程中發揮重要作用^[12-13]。然而，RIPK1/NF-κB通路在VSMCs表型轉化中的作用目前尚未見報道。

為此，本研究以大鼠動脈平滑肌細胞(A7r5)為研究對象，采用Western blot、5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2′-deoxy uridine，EdU)摻入法等方法觀察了RIPK1是否參與VSMCs的表型轉化，以及它在其中發揮的作用。本實驗結果可為VSMCs表型轉換的機制研究提供新思路，并為治療血管再狹窄和動脈粥樣硬化等疾病尋找潛在的新靶點奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大鼠動脈平滑肌細胞(A7r5)來源于美國模式培養物集存庫(American type culture collection，ATCC)，本室保存。Nec-1及Ang Ⅱ由Sigma公司提供，高糖DMEM培養基購自Gibco公司，定量PCR引物、Lipofectamine 3000和TRIzol購自Invitrogen公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Hyclone公司，SYBR^? Green PCR Master Mix由BIO-RAD公司提供，逆轉錄試劑盒(Rever Tra Ace組合型)購自TOYOBO公司，EdU細胞增殖檢測試劑盒(Apollo 567)購自銳博生物科技有限公司，RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay)裂解液購自碧云天公司，雙喹啉-4-羧酸二鈉鹽(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒和增強化學發光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)購自Pierce公司，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜購自Roche公司。小鼠單克隆抗β-actin抗體購自Santa-Cruz公司，山羊抗小鼠、兔IgG購自北京中杉金橋公司，鼠單克隆抗α-SMA、鼠單克隆抗Collagen I、兔多克隆抗CTGF及兔多克隆抗KLF4抗體均購自Abcam公司，兔單克隆抗RIPK1、兔多克隆抗p65，兔多克隆抗pP65抗體由CST公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養、刺激及分組

血管平滑肌細胞(A7r5)用含10% FBS的DMEM高糖培養基置于37 ℃、5% CO₂的培養箱中培養。當細胞生長至90%融合后，用0.25%胰酶(含EDTA-胰蛋白酶)消化、傳代。實驗所采用細胞均處于對數生長期。

根據預實驗及參考文獻[14-15]提示，將A7r5細胞分成以下5組: ①對照組:不加任何刺激; ②Ang Ⅱ組：10^-6 mol/L的Ang Ⅱ刺激24 h; ③Ang Ⅱ+Nec-1組：Nec-1(10^-6 mol/L)預處理2 h，再加Ang Ⅱ(10^-6 mol/L)刺激24 h; ④Scramble-siRNA+Ang Ⅱ組:Scramble-siRNA轉染24 h再加Ang Ⅱ(10^-6 mol/L)刺激24 h; ⑤RIPK1-siRNA+Ang Ⅱ組:RIPK1-siRNA轉染24 h再加Ang Ⅱ(10^-6 mol/L)刺激24 h。

1.2.2 siRNA轉染

采用陽離子脂質體Lipofectamine 3000介導瞬時轉染A7r5細胞，按照說明書進行操作。濃度為100 nmol/L的Scramble-siRNA或特異性的RIPK1-siRNA轉染A7r5細胞24 h后再加Ang Ⅱ刺激24 h。由銳博公司設計合成所需siRNA。

序列如下：

Scramble-siRNA:

5′-GUG CGUUGCUAGUACCAAC dUdU-3′；

RIPK1-siRNA:

5′-GCG GGCAUGCACUACUUACAUG dUdU-3′^[11]。

1.2.3 EdU摻入法檢測VSMCs增殖

EdU在細胞周期中可取代胸腺嘧啶插入到正在復制的DNA鏈中，與Apollo^?熒光染料反應，從而可檢測細胞的增殖活性。其大體步驟如下：A7r5細胞處理完畢后，經過EdU孵育、4%多聚甲醛固定、Apollo^?染色反應液及Hoechst 33342反應液孵育后，在熒光顯微鏡下觀察、拍照^[16]。本實驗中每組細胞隨機選5個視野，每組3個復樣，采用Image-Pro Plus軟件計算處于S期的細胞百分比。

1.2.4 劃痕實驗測定細胞遷移

A7r5細胞種板培養24 h后，采用無菌槍頭劃痕、并于倒置顯微鏡下拍照。按照細胞分組予以相應處理，于CO₂培養箱中繼續培養24 h后，再次在倒置顯微鏡下觀察拍照，每組取8個視野，每組3個復樣。用Image-Pro Plus軟件測量劃痕面積，細胞遷移用劃痕愈合指數來反映。劃痕愈合指數＝(0 h劃痕面積－24 h后劃痕面積)/0 h劃痕面積^[17]。

1.2.5 定量PCR法檢測基因表達變化

按我們以前報道的方法，采用TRIzol試劑提取細胞的總RNA，逆轉錄為cDNA后在CFX96^TM(BIO-RAD)熒光定量PCR儀上采用SYBR^? Green PCR Master Mix對RIPK1、α-SMA、KLF4、Collagen I和CTGF的mRNA變化進行熒光定量檢測^[18]。檢測基因的引物序列如表 1所示。

表1 定量RT-PCR引物序列 Table1. Primer Sequences for quantitative PCR

表選項

下載CSV

基因	基因編號	引物序列	擴增產物長度/bp
RIPK1	306886	F:CTTAAGCCCAAGTGCAGTCA
		R:ATGGCCCAACAAGGAGGATG	166
α-SMA	81633	F:ACAACTGGTATTGTGCTGGACT
		R:TCAGCAGTAGTCACGAAGGAAT	173
KLF4	114505	F:AGAGGAACTCTCTCACATGAAGC
		R:AAAGTCTAGGTCCAGGAGATCGT	178
Collagen I	29393	F: ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC
		R: TCCAGCAATACCCTGAGGTC	118
CTGF	64032	F: CTACCGACTGGAAGACACATTT
		R: TTCCTCTAGGTCAGCTTCACAG	202
β-actin	728378	F: ACTATCGGCAATGAGCGGTTC
		R: ATGCCACAGGATTCCATACCC	77

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達

A7r5細胞處理后，RIPA裂解細胞獲得總蛋白，根據BCA法所測蛋白濃度上樣，經過聚丙烯酰胺凝膠電泳后，采用濕轉法轉蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h后，4 ℃孵育一抗(RIPK1，1：1 000；pP65，1：1 000；P65，1：1 000；α-SMA，1：200；KLF4，1：1 000；β-actin, 1：2 000)過夜。膜經緩沖液洗滌后，室溫孵育相應二抗(1：4 000) 2 h，用ECL顯影曝光。β-actin作為內參，采用Quantity one 4.6.1軟件進行灰度值半定量分析。

1.2.7 統計學方法

實驗數據采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，以均數±標準差(x±s)表示實驗結果，采用獨立樣本t檢驗行兩組間比較，單因素方差分析(One-way ANOVA)進行多組間比較，P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ang Ⅱ誘導VSMCs發生表型轉換并促進分泌

參照文獻[15]的方法，本研究采用10^-6 mol/L的Ang Ⅱ處理A7r5細胞24 h，誘導其發生表型轉換。結果表明，Ang Ⅱ作用24 h后A7r5細胞收縮表型標志物α-SMA的表達明顯降低，同時合成表型標志物KLF4的表達呈現增加(P＜0.05)，如圖 1所示。同時，Ang Ⅱ組中VSMCs的分泌標志物Collagen I和CTGF的基因轉錄和蛋白表達水平比對照組均明顯升高(P＜0.05)。

圖1 VSMCs表型轉化及分泌功能相關基因和蛋白表達變化(n=4)

* P＜0.05，Ang Ⅱ組vs.對照組

Figure1. Gene and protein expression of VSMCs phenotypic switching and secretion markers (n=4)

* P < 0.05, Ang Ⅱ group vs. Control group

圖選項

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《生物醫學工程學雜志》

受體相互作用蛋白激酶1在血管平滑肌細胞表型轉換中的作用研究

摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

引言

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養、刺激及分組

1.2.2 siRNA轉染

1.2.3 EdU摻入法檢測VSMCs增殖

1.2.4 劃痕實驗測定細胞遷移

1.2.5 定量PCR法檢測基因表達變化

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達

1.2.7 統計學方法

2 結果

2.1 Ang Ⅱ誘導VSMCs發生表型轉換并促進分泌

2.2 Ang Ⅱ促進VSMCs增殖

2.3 Ang Ⅱ促進VSMCs遷移

2.4 RIPK1在Ang Ⅱ誘導VSMCs表型轉換中的作用

2.4.1 RIPK1在Ang Ⅱ誘導VSMCs表型轉換中表達上調

2.4.2 抑制RIPK1對VSMCs表型及分泌的影響

2.4.3 抑制RIPK1表達對VSMCs細胞增殖的影響

2.4.4 抑制RIPK1表達對VSMCs遷移能力的影響

2.5 RIPK1可能通過NF-κB信號通路參與Ang Ⅱ誘導的VSMCs表型轉換

3 討論

引言

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養、刺激及分組

1.2.2 siRNA轉染

1.2.3 EdU摻入法檢測VSMCs增殖

1.2.4 劃痕實驗測定細胞遷移

1.2.5 定量PCR法檢測基因表達變化

1.2.6 Western blot檢測蛋白表達

1.2.7 統計學方法

2 結果

2.1 Ang Ⅱ誘導VSMCs發生表型轉換并促進分泌

2.2 Ang Ⅱ促進VSMCs增殖

2.3 Ang Ⅱ促進VSMCs遷移

2.4 RIPK1在Ang Ⅱ誘導VSMCs表型轉換中的作用

2.4.1 RIPK1在Ang Ⅱ誘導VSMCs表型轉換中表達上調

2.4.2 抑制RIPK1對VSMCs表型及分泌的影響

2.4.3 抑制RIPK1表達對VSMCs細胞增殖的影響

2.4.4 抑制RIPK1表達對VSMCs遷移能力的影響

2.5 RIPK1可能通過NF-κB信號通路參與Ang Ⅱ誘導的VSMCs表型轉換

3 討論

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