鑒于丙型肝炎病毒(HCV)危害著人類健康, 本研究擬用反轉錄環介導等溫擴增(RT-LAMP)建立一種簡易檢測方法。收集并用FQ-PCR(金標準)檢測臨床樣本。根據HCV保守5'非編碼區設計4條通用引物, 然后用Taq DNA聚合酶優化傳統RT-LAMP體系, 通過酶切和交叉實驗以評價RT-LAMP的特異性, 通過和反轉錄PCR(RT-PCR)同時檢測倍比稀釋的模板以評價RT-LAMP的靈敏度。同時判斷鈣黃綠素和羥基萘芬藍(HNB)染色法是否與電泳法的結果相同。結果顯示, Taq DNA聚合酶可提高擴增效率, RT-LAMP的特異性好, 酶切片段與預期相一致(216 bp)且只有HCV被擴增, 靈敏度為10 IU/tube, 比RT-PCR高10倍。另外, 兩種染料和電泳法的檢測結果相同。RT-LAMP和RT-PCR檢測75例臨床樣本的一致性差(P＜0.05, Kappa=0.375), 和FQ-PCR的一致性好(P＞0.05, Kappa=0.762)。綜上所述, RT-LAMP簡易、特異、靈敏, 適用于基層醫療機構。
引用本文： 趙娜, 劉金霞, 孫殿興. 利用反轉錄環介導等溫擴增技術檢測丙型肝炎病毒. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(4): 712-718. doi: 10.7507/1001-5515.20160117 復制
0 引言
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染呈世界分布，全球丙肝感染人數達1.3～1.7億，我國HCV感染人數經推算有1 000萬，并有部分患者可發展為肝硬化甚至肝癌[1]。目前丙型肝炎(簡稱丙肝)的療效不佳，并且患者使用干擾素或利巴韋林的副作用較明顯，如失眠、抑郁、脫發、貧血等[2]，因此早期防控丙肝具有重要的臨床意義。目前檢測HCV的方法主要有兩類：一是免疫學方法，如膠體金法、ELISA法，優點是操作簡單、檢測快速，缺點是靈敏度較低[3-4]，陰性結果也不能排除感染可能；二是分子生物學方法檢測核酸，如熒光定量PCR(fluorescence quantitative-PCR，FQ-PCR)，優點是靈敏度和特異性均較好[5-6]，缺點是步驟繁瑣、對操作環境和操作人員要求高，因此限制了其在基層醫療機構的應用。
近年來，環介導等溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification，LAMP)因其操作易學、靈敏、特異性高等特點，已受到廣泛關注[7-8]。所謂反轉錄環介導等溫擴增技術(reverse transcription-loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP)，就是在傳統LAMP體系中加入反轉錄酶，將RNA的反轉錄和互補DNA(cDNA)的擴增同時完成。本研究基于傳統的RT-LAMP反應體系，向其中加入Taq DNA聚合酶以提高擴增效率，并比較評價幾種簡易的產物檢測方法，以期建立簡易、靈敏、特異的RT-LAMP技術。
1 材料與方法
1.1 收集模板并定量
1.1.1 模板來源
收集白求恩國際和平醫院75例疑似感染HCV的受檢者血清樣本，按照RNA提取試劑盒(Viral RNA Mini Kit，QIAamp公司)的說明提取血清中的HCV RNA。本研究經過醫學倫理審查，獲得受檢者的知情同意。三種用于特異性實驗的DNA病毒：巨細胞病毒(cytomegaoviyns，CMV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)均由本實驗室保存。
1.1.2 FQ-PCR檢測
FQ-PCR試劑盒購自上海之江公司。①簡要操作步驟：取FQ-PCR檢測混合液19 μL與1 μL RT-PCR酶，震蕩混勻數秒，3 000 r/min離心數秒。加入5 μL已提取樣本(包括臨床樣本、對照品、標準品)，離心數秒后上機。②參數設置：45 ℃×10 min，95 ℃×15 min，循環一次；95 ℃×15 s，60 ℃×60 s，循環40次，熒光檢測在60 ℃，熒光通道FAM。③以FQ-PCR為“金標準”，結果75例樣本中有陽性65例(1×103～1×104 IU/mL 8例、1×104～1×105 IU/mL 16例、1×105～1×106 IU/mL 18例、1×106～1×107 IU/mL 23例)，陰性10例(＜1×103 IU/mL)。
1.2 RT-PCR
1.2.1 反轉錄步驟
cDNA合成試劑盒(TIANS sript DNA第一鏈合成試劑盒)購自Qingen公司。操作步驟：①在冰浴的無核酸酶的離心管中，配制約5 μg總RNA，2 μL Random引物和2 μL Super Pure dNTP(各2.5 mmol/L)反應體系14.5 μL。②在70 ℃加熱5 min后迅速冷卻2 min。簡短離心后加入4 μL 5×First-Strand Buffer和0.5 μL RNasin。③加1 μL(200 U)TIANS script M-MLV(Vazyme公司)，輕輕混勻，將反應管置25 ℃溫浴10 min，42 ℃溫浴50 min。④在95 ℃加熱5 min終止反應。⑤加RNase H 2 U，37 ℃溫浴20 min以降解RNA，然后95 ℃加熱5 min滅活酶。⑥用雙蒸水(ddH2O)將反應體系稀釋到50 μL。
1.2.2 PCR試劑配制
上下游引物(F3和B3)各1.0 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs各0.2 mmol/L，MgCl2 4 mmol/L，2 μL經反轉錄的cDNA，用雙蒸水補足50 μL。
1.2.3 參數設置
95 ℃×3 min，循環一次；95 ℃×30 s，55 ℃×30 s，72 ℃×30 s，循環35次；72 ℃×5 min，循環一次。
1.3 設計RT-LAMP引物
根據NCBI網站公布的HCV 5＇端非編碼區(5＇UTR區)的保守區，用專業引物設計軟件Primer Explorer V4設計RT-LAMP引物。引物和靶序列的相對位置如圖 1所示。如表 1所示，以5種基因型的參考序列(GenBank號：KC844048.1、JQ065709.1、GU451222.1、EU798760.1、KM252792.1)示意通用引物，引物序列如表 1所示，表中F3和B3為RT-LAMP外引物，FIP(由F1c和F2組成)和BIP(由B1c和B2組成)為RT-LAMP內引物。所有引物由上海生工公司合成。
圖1
RT-LAMP引物和靶序列的相對位置
Figure1.
Relative positions of RT-LAMP primers and target sequences
表1
檢測HCV的RT-LAMP引物
Table1.
RT-LAMP primers for detection of HCV
1.4 RT-LAMP
1.4.1 傳統反應體系
內引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，甜菜堿0.8 mol/L(Sigma公司)，Mg2SO4 6 mmol/L，dNTPs各1.4 mmol/L，模板RNA 2 μL，Bst DNA聚合酶8 U(NEB公司)、反應緩沖液2.5 μL，重組核糖核酸酶抑制劑40 U(Invitrogen公司)，M-MLV 1 μL，加雙蒸水補足25 μL。用ddH2O代替模板設立陰性對照。65 ℃恒溫反應60 min后取出反應管進行產物檢測。
1.4.2 產物檢測
①電泳法:取擴增產物5 μL上樣于2 %瓊脂糖凝膠中電泳30～40 min并觀察擴增條帶。②濁度觀察法反應完成后見到反應管內的白色渾濁為陽性，保持透明為陰性。③鈣黃綠素染色法:在反應前向體系中加入1 μL鈣黃綠素和MnCl2混合液(終濃度分別為5 mmol/L和10 mmol/L)。反應結束后，見到體系呈綠色為陽性，橙色為陰性。④HNB染色法:在反應前向體系加入1 mol/L HNB溶液(終濃度120 μmol/L)。反應結束后，見到體系呈天藍色為陽性，紫色為陰性。
1.5 Taq DNA聚合酶優化實驗
比較在向體系中加入和不加入Taq DNA聚合酶的兩種條件下，在10、30、50和70 min后對擴增效率的影響，根據電泳后的RT-LAMP特有的梯狀條帶評價該酶的優化效果。
1.6 特異性和靈敏度實驗
1.6.1 特異性實驗
①以3例丙肝RNA為模板進行RT-LAMP擴增，用特異性內切酶Nru Ⅰ(tcg|cga)對擴增產物進行酶切，根據片段大小定性判斷擴增產物的存在。②以CMV、HBV和HSV-1為模板加入體系進行擴增以進一步驗證特異性。
1.6.2 靈敏度實驗
選擇RNA含量約為5×107 IU/mL的4例HCV樣本，用ddH2O進行一系列10倍稀釋，以此系列稀釋度的HCV為模板，分別進行RT-LAMP和RT-PCR擴增。按照反應管量(tube)換算，實際反應量分別為1×104、1×103、100、10和1 IU/tube。
1.7 統計分析
應用SPSS 17.0軟件，對RT-LAMP和RT-PCR檢測的75例樣本檢測結果分別和金標準(FQ-PCR)結果進行χ2檢驗。計算P值和Kappa值。Kappa值＜0.4，一致性較差；Kappa值0.4～0.7，一致性一般；Kappa＞0.7，則一致性較好。
2 結果
2.1 酶優化實驗
Taq DNA聚合酶對傳統RT-LAMP擴增效率影響的實驗結果如圖 2所示。圖 2(a)表明未加入Taq DNA聚合酶的情況下，反應50 min后才可見明顯的條帶；圖 2(b)表明加入Taq DNA聚合酶后，在反應30 min后就可見較清晰的擴增條帶。說明傳統的RT-LAMP體系在加入這種酶之后，對其擴增效率產生了促進作用，可使擴增效率提高20 min。
圖2
體系中未加入和加入Taq DNA聚合酶的RT-LAMP電泳圖
(a)未加入Taq DNA聚合酶的傳統RT-LAMP電泳圖；(b)加入Taq DNA聚合酶后的RT-LAMP電泳圖。1～4：10、30、50和70 min；M：100 bp DNA marker；N：陰性對照
Figure2. Electrophoresis pattern of RT-LAMP before and after adding Taq DNA polymerase to the system(a) conventional electrophoresis pattern of RT-LAMP before adding Taq DNA polymerase; (b) electrophoresis pattern of RT-LAMP after adding Taq DNA polymerase. 1-4: 10, 30, 50 and 70 min; M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.2 特異性實驗
RT-LAMP特異性實驗結果如圖 3(a)所示，只有以HCV為模板的擴增產物在電泳后呈現特征性的梯狀條帶，CMV、HBV和HSV-1病毒未被擴增，而且擴增產物經Nru Ⅰ內切酶酶切后，電泳指示的條帶和預計主帶大小相一致(216 bp)。上述兩種實驗均說明RT-LAMP具有較好的特異性。三種方法對擴增產物檢測的比較結果如圖 3(b)、(c)和(d)所示，圖 3(b)中HCV陽性反應體系中見微弱的白色渾濁，圖 3(c)中HCV陽性反應體系中由橙色變為綠色，圖 3(d)中HCV陽性體系中由紫色變為藍色。對含有非特異模板的體系，3種檢測結果相同，說明均未發生非特異擴增。然而濁度觀察法(b)的可視性不如鈣黃綠素(c)和HNB染色法(d)的好。
圖3
RT-LAMP的特異性實驗
(a)RT-LAMP特異性實驗電泳圖。1：以HCV為模板；2：酶切片段；3～5：以CMV、HBV和HSV-1為模板。(b)濁度觀察圖。1：HCV為模板；2～4：分別為以CMV、HBV和HSV-1為模板。(c)鈣黃綠素染色圖。1：HCV為模板；2～4：分別為以CMV、HBV和HSV-1為模板。(d)HNB染色圖。1：HCV為模板；2～4：分別為以CMV、HBV和HSV-1為模板。M：100 bp DNA marker；N：陰性對照
Figure3. Specificity assay of RT-LAMP(a) specificity assay of electrophoresis pattern by RT-LAMP. 1: HCV as template; 2: the endonuclease digestion fragment; 3-5: CMV, HBV and HSV-1 as templates. (b) pattern by turbidity observation. 1: HCV as template; 2-4: CMV, HBV and HSV-1 as templates. (c) pattern by calcein stain. (d) pattern by HNB stain. 1: HCV as template; 2-4: CMV, HBV and HSV-1 as templates. M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.3 靈敏度實驗
RT-PCR的靈敏度實驗結果如圖 4(a)所示，隨著模板稀釋度的逐漸增大，模板量從1×104～100 IU/tube的擴增條帶逐漸減弱，檢測極限為100 IU/tube，所以RT-PCR的靈敏度為100 IU/tube。RT-LAMP的靈敏度實驗結果如圖 4(b)所示，隨著模板稀釋度的逐漸增大，擴增條帶逐漸減弱，檢測極限為10 IU/tube，所以RT-LAMP的靈敏度為10 IU/tube。濁度觀察結果如圖 4(c)所示，模板量從高到低的反應管內白色沉淀逐漸減少，而HCV含量為10 IU/tube所產生的白色沉淀較難用肉眼判定，所以濁度觀察法的可視性較差。使用鈣黃綠素和HNB染色法后，如圖 4(d)和4(e)所示，反應管內均呈現相應的顏色改變，而且所示靈敏度和圖 4(b)的電泳法結果相同，均可達到10 IU/tube。
圖4
RT-PCR和RT-LAMP的靈敏度實驗
(a)RT-PCR電泳圖；(b)RT-LAMP電泳圖；(c)濁度觀察圖；(d)鈣黃綠素染色圖；(e)HNB染色圖。1-5：1×104、1×103、100、10和1 IU/tube；M：100 bp DNA marker；N：陰性對照
Figure4. Sensitivity assay of RT-PCR and RT-LAMP(a) electrophoresis pattern of RT-PCR; (b) electrophoresis pattern of RT-LAMP; (c) pattern by turbidity observation; (d) pattern by calcein stain; (e) pattern by HNB stain. 1-5: 1×104, 1×103, 100, 10 and 1 IU/tube; M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.4 臨床樣本的檢測
以FQ-PCR為金標準，分別用RT-LAMP和RT-PCR對75例臨床樣本進行檢測(如表 2所示)。結果RT-PCR可以檢測到全部HCV含量在1×105 IU/mL以上的41例陽性樣本。按照單管反應量換算，這和上述稀釋實驗的靈敏度(100 IU/tube)相一致。然而RT-PCR在檢測HCV含量為1×104～1×105 IU/mL樣本的重復性較差，有20例樣本為假陰性，所以RT-PCR的靈敏度為69.23%。
表2
RT-LAMP、RT-PCR和FQ-PCR的臨床樣本檢測結果
Table2.
Detection results of clinical samples by RT-LAMP, RT-PCR and FQ-PCR
RT-LAMP可以檢測到HCV含量在1×104 IU/mL以上的57例陽性樣本。按照單管反應量換算，這和上述稀釋實驗的靈敏度(10 IU/tube)相一致。然而RT-LAMP在檢測HCV含量為1×103～1×104 IU/mL樣本時重復性不好，有5例樣本為假陰性，所以RT-LAMP的檢測靈敏度為92.31%。另外，陰性樣本的RT-PCR和RT-LAMP檢測結果均與金標準(FQ-PCR)相一致，特異性均為100%。
用χ2檢驗分別判斷RT-PCR和RT-LAMP與金標準的一致性(如表 3所示)，按照0.05檢驗水準，可知RT-LAMP和FQ-PCR差異沒有統計學意義(P＞0.05)，一致性也較好(Kappa＞0.7)；而RT-PCR和FQ-PCR差異有統計學意義(P＜0.05), 一致性差(Kappa＜0.4)。
表3
RT-PCR和RT-LAMP與金標準的一致性
Table3.
Consistency of RT-LAMP and RT-PCR comparing to gold standard
3 討論
目前PCR或FQ-PCR是主要的核酸檢測手段[9-11]，但是這種方法存在設備昂貴、操作繁瑣等缺點，不利于向基層醫院推廣。本研究利用RT-LAMP技術在等溫條件下擴增HCV，不但省卻了RT-PCR操作過程中的升溫、降溫等過程，在一定程度上降低了核酸以氣溶膠形式對實驗室的污染，而且通過向傳統RT-LAMP體系中加入用于普通PCR擴增的Taq DNA聚合酶，啟動了DNA合成的另一條途徑，從而進一步提高了擴增效率。
雖然檢測HCV的RT-LAMP技術也曾被研究過[12-15]，但是某些研究報道創新性差，尚存在需改進之處。例如李啟明等[15]的RT-LAMP檢測雖然也具有較好的靈敏度(接近10 IU/tube)，但是該方法的擴增效率低(90 min)，并且只靠裸眼觀察濁度進行產物檢測，而本研究和相關報道已證實這種方法不具有可靠性[16-17]。后來Kargar等使用可視性染料SYBR Green I進行結果檢測[12-14]，然而SYBR Green I是非特異性雙鏈DNA染色劑，無論是體系中擴增的、還是污染造成的DNA雙鏈分子，都能嵌入其中而發出綠色熒光，因此假陽性率高。另外，SYBR Green I在體系中需具有較高的濃度才有利于肉眼判定結果，而高濃度的SYBR Green I會抑制擴增反應，故要在反應結束后開蓋加入，開蓋就會有氣溶膠污染的可能，因此也會導致假陽性率升高。本研究使用鈣黃綠素和HNB兩種檢測染料，不但不用開蓋，避免了氣溶膠污染，而且在特異性和靈敏度方面和電泳法的檢測結果相一致。經臨床樣本檢測，RT-LAMP與FQ-PCR的差異沒有統計學意義，這是因為四條RT-LAMP引物需同時識別出靶序列上的6個特定區段才啟動擴增反應，從而使特異性和靈敏度得到保證。由于僅需一臺具有恒溫功能的水浴箱即可完成操作，而且該技術的操作流程在很大程度上被簡化，因此本研究建立的RT-LAMP技術具有應用于基層醫療機構的理論基礎和實驗經驗。今后，如果基于該技術進行大規模臨床樣本的檢測、自動化裝置的開發和定量試劑盒的研制，增強其推廣性和簡易性，將會在防控疾病方面成為必不可少的有力工具。
0 引言
丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染呈世界分布，全球丙肝感染人數達1.3～1.7億，我國HCV感染人數經推算有1 000萬，并有部分患者可發展為肝硬化甚至肝癌[1]。目前丙型肝炎(簡稱丙肝)的療效不佳，并且患者使用干擾素或利巴韋林的副作用較明顯，如失眠、抑郁、脫發、貧血等[2]，因此早期防控丙肝具有重要的臨床意義。目前檢測HCV的方法主要有兩類：一是免疫學方法，如膠體金法、ELISA法，優點是操作簡單、檢測快速，缺點是靈敏度較低[3-4]，陰性結果也不能排除感染可能；二是分子生物學方法檢測核酸，如熒光定量PCR(fluorescence quantitative-PCR，FQ-PCR)，優點是靈敏度和特異性均較好[5-6]，缺點是步驟繁瑣、對操作環境和操作人員要求高，因此限制了其在基層醫療機構的應用。
近年來，環介導等溫擴增技術(loop mediated isothermal amplification，LAMP)因其操作易學、靈敏、特異性高等特點，已受到廣泛關注[7-8]。所謂反轉錄環介導等溫擴增技術(reverse transcription-loop mediated isothermal amplification, RT-LAMP)，就是在傳統LAMP體系中加入反轉錄酶，將RNA的反轉錄和互補DNA(cDNA)的擴增同時完成。本研究基于傳統的RT-LAMP反應體系，向其中加入Taq DNA聚合酶以提高擴增效率，并比較評價幾種簡易的產物檢測方法，以期建立簡易、靈敏、特異的RT-LAMP技術。
1 材料與方法
1.1 收集模板并定量
1.1.1 模板來源
收集白求恩國際和平醫院75例疑似感染HCV的受檢者血清樣本，按照RNA提取試劑盒(Viral RNA Mini Kit，QIAamp公司)的說明提取血清中的HCV RNA。本研究經過醫學倫理審查，獲得受檢者的知情同意。三種用于特異性實驗的DNA病毒：巨細胞病毒(cytomegaoviyns，CMV)、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)和單純皰疹病毒1型(herpes simplex virus-1，HSV-1)均由本實驗室保存。
1.1.2 FQ-PCR檢測
FQ-PCR試劑盒購自上海之江公司。①簡要操作步驟：取FQ-PCR檢測混合液19 μL與1 μL RT-PCR酶，震蕩混勻數秒，3 000 r/min離心數秒。加入5 μL已提取樣本(包括臨床樣本、對照品、標準品)，離心數秒后上機。②參數設置：45 ℃×10 min，95 ℃×15 min，循環一次；95 ℃×15 s，60 ℃×60 s，循環40次，熒光檢測在60 ℃，熒光通道FAM。③以FQ-PCR為“金標準”，結果75例樣本中有陽性65例(1×103～1×104 IU/mL 8例、1×104～1×105 IU/mL 16例、1×105～1×106 IU/mL 18例、1×106～1×107 IU/mL 23例)，陰性10例(＜1×103 IU/mL)。
1.2 RT-PCR
1.2.1 反轉錄步驟
cDNA合成試劑盒(TIANS sript DNA第一鏈合成試劑盒)購自Qingen公司。操作步驟：①在冰浴的無核酸酶的離心管中，配制約5 μg總RNA，2 μL Random引物和2 μL Super Pure dNTP(各2.5 mmol/L)反應體系14.5 μL。②在70 ℃加熱5 min后迅速冷卻2 min。簡短離心后加入4 μL 5×First-Strand Buffer和0.5 μL RNasin。③加1 μL(200 U)TIANS script M-MLV(Vazyme公司)，輕輕混勻，將反應管置25 ℃溫浴10 min，42 ℃溫浴50 min。④在95 ℃加熱5 min終止反應。⑤加RNase H 2 U，37 ℃溫浴20 min以降解RNA，然后95 ℃加熱5 min滅活酶。⑥用雙蒸水(ddH2O)將反應體系稀釋到50 μL。
1.2.2 PCR試劑配制
上下游引物(F3和B3)各1.0 μmol/L，Taq DNA聚合酶1.25 U，10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTPs各0.2 mmol/L，MgCl2 4 mmol/L，2 μL經反轉錄的cDNA，用雙蒸水補足50 μL。
1.2.3 參數設置
95 ℃×3 min，循環一次；95 ℃×30 s，55 ℃×30 s，72 ℃×30 s，循環35次；72 ℃×5 min，循環一次。
1.3 設計RT-LAMP引物
根據NCBI網站公布的HCV 5＇端非編碼區(5＇UTR區)的保守區，用專業引物設計軟件Primer Explorer V4設計RT-LAMP引物。引物和靶序列的相對位置如圖 1所示。如表 1所示，以5種基因型的參考序列(GenBank號：KC844048.1、JQ065709.1、GU451222.1、EU798760.1、KM252792.1)示意通用引物，引物序列如表 1所示，表中F3和B3為RT-LAMP外引物，FIP(由F1c和F2組成)和BIP(由B1c和B2組成)為RT-LAMP內引物。所有引物由上海生工公司合成。
圖1
RT-LAMP引物和靶序列的相對位置
Figure1.
Relative positions of RT-LAMP primers and target sequences
表1
檢測HCV的RT-LAMP引物
Table1.
RT-LAMP primers for detection of HCV
1.4 RT-LAMP
1.4.1 傳統反應體系
內引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L，外引物(F3和B3)各0.2 μmol/L，甜菜堿0.8 mol/L(Sigma公司)，Mg2SO4 6 mmol/L，dNTPs各1.4 mmol/L，模板RNA 2 μL，Bst DNA聚合酶8 U(NEB公司)、反應緩沖液2.5 μL，重組核糖核酸酶抑制劑40 U(Invitrogen公司)，M-MLV 1 μL，加雙蒸水補足25 μL。用ddH2O代替模板設立陰性對照。65 ℃恒溫反應60 min后取出反應管進行產物檢測。
1.4.2 產物檢測
①電泳法:取擴增產物5 μL上樣于2 %瓊脂糖凝膠中電泳30～40 min并觀察擴增條帶。②濁度觀察法反應完成后見到反應管內的白色渾濁為陽性，保持透明為陰性。③鈣黃綠素染色法:在反應前向體系中加入1 μL鈣黃綠素和MnCl2混合液(終濃度分別為5 mmol/L和10 mmol/L)。反應結束后，見到體系呈綠色為陽性，橙色為陰性。④HNB染色法:在反應前向體系加入1 mol/L HNB溶液(終濃度120 μmol/L)。反應結束后，見到體系呈天藍色為陽性，紫色為陰性。
1.5 Taq DNA聚合酶優化實驗
比較在向體系中加入和不加入Taq DNA聚合酶的兩種條件下，在10、30、50和70 min后對擴增效率的影響，根據電泳后的RT-LAMP特有的梯狀條帶評價該酶的優化效果。
1.6 特異性和靈敏度實驗
1.6.1 特異性實驗
①以3例丙肝RNA為模板進行RT-LAMP擴增，用特異性內切酶Nru Ⅰ(tcg|cga)對擴增產物進行酶切，根據片段大小定性判斷擴增產物的存在。②以CMV、HBV和HSV-1為模板加入體系進行擴增以進一步驗證特異性。
1.6.2 靈敏度實驗
選擇RNA含量約為5×107 IU/mL的4例HCV樣本，用ddH2O進行一系列10倍稀釋，以此系列稀釋度的HCV為模板，分別進行RT-LAMP和RT-PCR擴增。按照反應管量(tube)換算，實際反應量分別為1×104、1×103、100、10和1 IU/tube。
1.7 統計分析
應用SPSS 17.0軟件，對RT-LAMP和RT-PCR檢測的75例樣本檢測結果分別和金標準(FQ-PCR)結果進行χ2檢驗。計算P值和Kappa值。Kappa值＜0.4，一致性較差；Kappa值0.4～0.7，一致性一般；Kappa＞0.7，則一致性較好。
2 結果
2.1 酶優化實驗
Taq DNA聚合酶對傳統RT-LAMP擴增效率影響的實驗結果如圖 2所示。圖 2(a)表明未加入Taq DNA聚合酶的情況下，反應50 min后才可見明顯的條帶；圖 2(b)表明加入Taq DNA聚合酶后，在反應30 min后就可見較清晰的擴增條帶。說明傳統的RT-LAMP體系在加入這種酶之后，對其擴增效率產生了促進作用，可使擴增效率提高20 min。
圖2
體系中未加入和加入Taq DNA聚合酶的RT-LAMP電泳圖
(a)未加入Taq DNA聚合酶的傳統RT-LAMP電泳圖；(b)加入Taq DNA聚合酶后的RT-LAMP電泳圖。1～4：10、30、50和70 min；M：100 bp DNA marker；N：陰性對照
Figure2. Electrophoresis pattern of RT-LAMP before and after adding Taq DNA polymerase to the system(a) conventional electrophoresis pattern of RT-LAMP before adding Taq DNA polymerase; (b) electrophoresis pattern of RT-LAMP after adding Taq DNA polymerase. 1-4: 10, 30, 50 and 70 min; M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.2 特異性實驗
RT-LAMP特異性實驗結果如圖 3(a)所示，只有以HCV為模板的擴增產物在電泳后呈現特征性的梯狀條帶，CMV、HBV和HSV-1病毒未被擴增，而且擴增產物經Nru Ⅰ內切酶酶切后，電泳指示的條帶和預計主帶大小相一致(216 bp)。上述兩種實驗均說明RT-LAMP具有較好的特異性。三種方法對擴增產物檢測的比較結果如圖 3(b)、(c)和(d)所示，圖 3(b)中HCV陽性反應體系中見微弱的白色渾濁，圖 3(c)中HCV陽性反應體系中由橙色變為綠色，圖 3(d)中HCV陽性體系中由紫色變為藍色。對含有非特異模板的體系，3種檢測結果相同，說明均未發生非特異擴增。然而濁度觀察法(b)的可視性不如鈣黃綠素(c)和HNB染色法(d)的好。
圖3
RT-LAMP的特異性實驗
(a)RT-LAMP特異性實驗電泳圖。1：以HCV為模板；2：酶切片段；3～5：以CMV、HBV和HSV-1為模板。(b)濁度觀察圖。1：HCV為模板；2～4：分別為以CMV、HBV和HSV-1為模板。(c)鈣黃綠素染色圖。1：HCV為模板；2～4：分別為以CMV、HBV和HSV-1為模板。(d)HNB染色圖。1：HCV為模板；2～4：分別為以CMV、HBV和HSV-1為模板。M：100 bp DNA marker；N：陰性對照
Figure3. Specificity assay of RT-LAMP(a) specificity assay of electrophoresis pattern by RT-LAMP. 1: HCV as template; 2: the endonuclease digestion fragment; 3-5: CMV, HBV and HSV-1 as templates. (b) pattern by turbidity observation. 1: HCV as template; 2-4: CMV, HBV and HSV-1 as templates. (c) pattern by calcein stain. (d) pattern by HNB stain. 1: HCV as template; 2-4: CMV, HBV and HSV-1 as templates. M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.3 靈敏度實驗
RT-PCR的靈敏度實驗結果如圖 4(a)所示，隨著模板稀釋度的逐漸增大，模板量從1×104～100 IU/tube的擴增條帶逐漸減弱，檢測極限為100 IU/tube，所以RT-PCR的靈敏度為100 IU/tube。RT-LAMP的靈敏度實驗結果如圖 4(b)所示，隨著模板稀釋度的逐漸增大，擴增條帶逐漸減弱，檢測極限為10 IU/tube，所以RT-LAMP的靈敏度為10 IU/tube。濁度觀察結果如圖 4(c)所示，模板量從高到低的反應管內白色沉淀逐漸減少，而HCV含量為10 IU/tube所產生的白色沉淀較難用肉眼判定，所以濁度觀察法的可視性較差。使用鈣黃綠素和HNB染色法后，如圖 4(d)和4(e)所示，反應管內均呈現相應的顏色改變，而且所示靈敏度和圖 4(b)的電泳法結果相同，均可達到10 IU/tube。
圖4
RT-PCR和RT-LAMP的靈敏度實驗
(a)RT-PCR電泳圖；(b)RT-LAMP電泳圖；(c)濁度觀察圖；(d)鈣黃綠素染色圖；(e)HNB染色圖。1-5：1×104、1×103、100、10和1 IU/tube；M：100 bp DNA marker；N：陰性對照
Figure4. Sensitivity assay of RT-PCR and RT-LAMP(a) electrophoresis pattern of RT-PCR; (b) electrophoresis pattern of RT-LAMP; (c) pattern by turbidity observation; (d) pattern by calcein stain; (e) pattern by HNB stain. 1-5: 1×104, 1×103, 100, 10 and 1 IU/tube; M: 100 bp DNA marker; N: negative control
2.4 臨床樣本的檢測
以FQ-PCR為金標準，分別用RT-LAMP和RT-PCR對75例臨床樣本進行檢測(如表 2所示)。結果RT-PCR可以檢測到全部HCV含量在1×105 IU/mL以上的41例陽性樣本。按照單管反應量換算，這和上述稀釋實驗的靈敏度(100 IU/tube)相一致。然而RT-PCR在檢測HCV含量為1×104～1×105 IU/mL樣本的重復性較差，有20例樣本為假陰性，所以RT-PCR的靈敏度為69.23%。
表2
RT-LAMP、RT-PCR和FQ-PCR的臨床樣本檢測結果
Table2.
Detection results of clinical samples by RT-LAMP, RT-PCR and FQ-PCR
RT-LAMP可以檢測到HCV含量在1×104 IU/mL以上的57例陽性樣本。按照單管反應量換算，這和上述稀釋實驗的靈敏度(10 IU/tube)相一致。然而RT-LAMP在檢測HCV含量為1×103～1×104 IU/mL樣本時重復性不好，有5例樣本為假陰性，所以RT-LAMP的檢測靈敏度為92.31%。另外，陰性樣本的RT-PCR和RT-LAMP檢測結果均與金標準(FQ-PCR)相一致，特異性均為100%。
用χ2檢驗分別判斷RT-PCR和RT-LAMP與金標準的一致性(如表 3所示)，按照0.05檢驗水準，可知RT-LAMP和FQ-PCR差異沒有統計學意義(P＞0.05)，一致性也較好(Kappa＞0.7)；而RT-PCR和FQ-PCR差異有統計學意義(P＜0.05), 一致性差(Kappa＜0.4)。
表3
RT-PCR和RT-LAMP與金標準的一致性
Table3.
Consistency of RT-LAMP and RT-PCR comparing to gold standard
3 討論
目前PCR或FQ-PCR是主要的核酸檢測手段[9-11]，但是這種方法存在設備昂貴、操作繁瑣等缺點，不利于向基層醫院推廣。本研究利用RT-LAMP技術在等溫條件下擴增HCV，不但省卻了RT-PCR操作過程中的升溫、降溫等過程，在一定程度上降低了核酸以氣溶膠形式對實驗室的污染，而且通過向傳統RT-LAMP體系中加入用于普通PCR擴增的Taq DNA聚合酶，啟動了DNA合成的另一條途徑，從而進一步提高了擴增效率。
雖然檢測HCV的RT-LAMP技術也曾被研究過[12-15]，但是某些研究報道創新性差，尚存在需改進之處。例如李啟明等[15]的RT-LAMP檢測雖然也具有較好的靈敏度(接近10 IU/tube)，但是該方法的擴增效率低(90 min)，并且只靠裸眼觀察濁度進行產物檢測，而本研究和相關報道已證實這種方法不具有可靠性[16-17]。后來Kargar等使用可視性染料SYBR Green I進行結果檢測[12-14]，然而SYBR Green I是非特異性雙鏈DNA染色劑，無論是體系中擴增的、還是污染造成的DNA雙鏈分子，都能嵌入其中而發出綠色熒光，因此假陽性率高。另外，SYBR Green I在體系中需具有較高的濃度才有利于肉眼判定結果，而高濃度的SYBR Green I會抑制擴增反應，故要在反應結束后開蓋加入，開蓋就會有氣溶膠污染的可能，因此也會導致假陽性率升高。本研究使用鈣黃綠素和HNB兩種檢測染料，不但不用開蓋，避免了氣溶膠污染，而且在特異性和靈敏度方面和電泳法的檢測結果相一致。經臨床樣本檢測，RT-LAMP與FQ-PCR的差異沒有統計學意義，這是因為四條RT-LAMP引物需同時識別出靶序列上的6個特定區段才啟動擴增反應，從而使特異性和靈敏度得到保證。由于僅需一臺具有恒溫功能的水浴箱即可完成操作，而且該技術的操作流程在很大程度上被簡化，因此本研究建立的RT-LAMP技術具有應用于基層醫療機構的理論基礎和實驗經驗。今后，如果基于該技術進行大規模臨床樣本的檢測、自動化裝置的開發和定量試劑盒的研制，增強其推廣性和簡易性，將會在防控疾病方面成為必不可少的有力工具。
