小膠質細胞的激活可導致神經元損傷，從而導致神經退行性疾病如帕金森病的發病。為了探討毒死蜱（CPF）對小膠質細胞激活、炎癥因子表達分泌，以及對多巴胺能神經元存活率的影響，本研究采用逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）、Western blot檢測CPF刺激BV-2細胞（0、1、3、6、12、24 h）后BV-2細胞形態的改變及誘導型一氧化氮合成酶（iNOS）、環氧化酶2 （COX-2） mRNA和蛋白表達的變化；然后將BV-2細胞分為CPF組、DMSO對照組、NS對照組，分別刺激BV-2細胞12 h后，將各BV-2細胞培養液加入SH-SY5Y細胞共培養24 h。采用MTT方法檢測經不同處理的BV-2細胞的條件培養液對SH-SY5Y存活率的影響。發現CPF作用下，BV-2小膠質細胞激活，炎癥因子iNOS mRNA、COX-2 mRNA及其蛋白表達水平均升高。激活的BV-2細胞通過分泌炎癥因子造成神經元損傷。總之，CPF作用下小膠質細胞激活產生炎癥因子，介導對神經元的損傷，進而可能參與了帕金森病的發病過程。
引用本文： 樓躍, 李雅國. 毒死蜱激活小膠質細胞對多巴胺能神經元的影響. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(3): 506-511. doi: 10.7507/1001-5515.20160085 復制
引言
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的老年期神經退行性疾病，臨床上以靜止性震顫、肌強直、運動減少和姿勢平衡障礙為特征，其特征性病理改變為黑質多巴胺(dopamine,DA )能神經細胞選擇性丟失和殘存神經細胞內路易小體(Lewy body,LB)的形成[1]。
帕金森病發病的具體原因不明，確切機制不清，可能與遺傳、年齡、環境因素有關，如：接觸殺蟲劑、除草劑、重金屬等[2]；機體產生內源性潛在的神經毒性、線粒體功能障礙、發生氧化應激反應、出現細胞凋亡等[3]；或發生免疫炎癥反應[4]等。
毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)是一種在我國廣泛使用的具有神經元毒性的有機磷殺蟲劑，可存在于地下水及食物中，CPF代謝極慢，在食物殘渣中仍能檢測到其含量[5]。有動物實驗發現給予大鼠低于中毒劑量的CPF可造成黒質多巴胺能神經元丟失及運動能力、記憶的損傷[6-7]。最近，Zhang等[8]給予大鼠皮下注射CPF后發現其黒質部位多巴胺能神經元顯著減少，而小膠質細胞及星形膠質細胞增多，提示免疫炎癥可能參與了CPF導致的多巴胺能神經元丟失。小膠質細胞作為中樞神經系統的免疫細胞，正常情況下處于靜息狀態，其形態表現為分枝狀，起著免疫監視的作用，當有神經元死亡、外來物質入侵或腦組織發生損傷時小膠質細胞被激活，激活的小膠質細胞分泌一系列細胞因子和趨化因子[9]，其形態也由分枝狀的靜息狀態轉為阿米巴樣的激活狀態，吞噬外源性物質、清除細胞碎片，在帕金森病等神經退行性疾病中，小膠質細胞反復被激活，過度釋放的炎性因子最終導致神經元損傷、變性甚至死亡。
本研究將在細胞水平進一步觀察CPF是否直接激活小膠質細胞，并觀察小膠質細胞分泌的炎癥因子誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、環氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2) 的mRNA及蛋白表達水平是否改變，再進一步了解這種改變對神經元存活率的影響。
1 材料及所用儀器
1.1 細胞
小鼠源性小膠質細胞系BV-2細胞購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；多巴胺能神經元細胞系SH-SY5Y細胞株購于美國典型培養物保藏中心(American type culture collection，ATCC)。
1.2 主要試劑
DMEM高糖培養基(Invitrogen)，胎牛血清(Invitrogen)，青-鏈霉素(Invitrogen)，胰酶(Invitrogen)，毒死蜱(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(Takara)，DNA分子量標準(Takara)，兔iNOS抗體(Santa Cruz)，兔COX-2抗體(Santa Cruz)，β-actin小鼠單克隆抗體(Sigma-Aldrich)，羊抗小鼠IgG、HRP標記的抗生物素抗體(Invitrogen)，羊抗兔IgG、HRP標記的抗生物素抗體(Invitrogen)，MTT(Sigma)，其余試劑均為國產分析純。
1.3 主要儀器
VL-1臺式小型高速離心機(上海船廠設備分廠)，CH30-RF200系統攝影生物顯微鏡(Olympus)，－80 ℃超低溫冰箱(Thermo Forma)，凝膠電泳系統(Bio-Rad)，垂直電泳儀(Bio-Rad)，電泳儀(Tanon)，PCR儀(Bio-Rad)，酶標儀(BioTek)。
2 實驗方法
2.1 CPF對BV-2細胞的激活
2.1.1 細胞培養和藥物處理
小鼠源性小膠質細胞系BV-2細胞和SH-SY5Y細胞分別培養于含10％胎牛血清、1%的青-鏈霉素混合物的高糖DMEM細胞培養液內，在37 ℃、5%二氧化碳培養箱培養。當細胞長至80%左右融合時棄去培養液，PBS洗一遍，胰酶消化后傳代。有研究發現小于12.5 μmol/L的CPF對神經元無直接神經毒性[10]，因此，為避免細胞培養液中CPF對SH-SY5Y細胞的直接毒性作用對實驗造成干擾，當細胞進入對數生長期后，我們將BV-2細胞分成6組，選擇10 μmol/L濃度的CPF加入BV-2細胞分別作用0、1、3、6、12、24 h，然后在顯微鏡下觀察細胞形態并收集細胞RNA或者蛋白質于－80 ℃凍存。
2.1.2 小膠質細胞形態的變化
CPF(10 μmol/L)作用于BV-2細胞相應時間后將BV-2細胞置于顯微鏡下和未處理組比較觀察BV-2細胞形態的變化。
2.1.3 RT-PCR檢測細胞內iNOS、COX-2 mRNA的表達
采用Trizol法抽提BV-2細胞總RNA,用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度，分裝后于－80 ℃保存或進行下一步逆轉錄反應。將各組RNA濃度稀釋均等，按照TakaRa 1st-strand試劑盒提供的實驗方法進行逆轉錄反應，PCR擴增儀擴增，逆轉錄的cDNA于－20 ℃貯存備用。
采用DNAstar軟件設計引物，引物序列如下：iNOS(277 bp):正義鏈:5′-CTTCACCGGGTCAGAGCCACAGTCC-3′，反義鏈:5′-GAGCCAAGGCCAAACACAGCATAC-3′；COX-2(361 bp):正義鏈:5′-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3′，反義鏈:5′-TGGGCAAAGAATGCAAACATC-3′；β-actin(248 bp)：正義鏈:5′-AATCCTGGCATCCATGAA ACTAC-3′,反義鏈:5′-TCTGCTGGAAGGTGGAC AGTGAG-3′。基因CDS序列通過NCBI neucleotide庫獲得，所有引物都通過網上Blast比對進行特異性分析并檢驗其正確性。引物由Invitrogen公司合成。iNOS反應條件:94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s擴增25個循環，72 ℃保溫10 min。 COX-2反應條件:94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s擴增25個循環，72 ℃保溫10 min。β-actin反應條件:95 ℃ 5 min，然后95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s擴增20個循環，72 ℃保溫10 min。整個過程在BioRad PCR儀上完成。PCR產物用1%的瓊脂糖(溶于1×Tris硼酸)凝膠電泳分離，用VDS成像系統掃描分析圖像，所得圖像用image J軟件定量處理，以目的條帶與內參條帶β-actin信號強度的比值代表BV-2細胞內mRNA的表達水平。
2.1.4 Western blot檢測iNOS、COX-2蛋白的表達
檢測不同分組BV-2細胞內iNOS、COX-2蛋白的表達，收集經CPF 10 μmol/L處理不同時間的BV-2細胞，用RIPA蛋白質抽提液抽提總蛋白，用預冷的PBS輕微沖洗三遍，最后一遍時用細胞刮將細胞刮下，置于1.5 mL EP管，3 000 g、4 ℃、5 min離心，棄上清，加入100 μL蛋白質提取液,冰上裂解30 min。然后12 000 g、4 ℃、30 min離心，取上清于－80 ℃凍存。避免反復凍融。
分別取30 μg總蛋白進行10%的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。積層膠為80 V，電泳30 min；分離膠120 V、電泳90 min。然后80 V轉膜2 h，質量濃度為3% BSA室溫封閉2 h。一抗為多克隆兔抗iNOS抗體(1∶500) 、多克隆兔抗COX-2抗體(1∶750) ，4 ℃過夜。棄一抗，加入1×PBST洗3次，每次10 min。再加入二抗，二抗為羊抗兔IgG(1∶10 000) 抗體，室溫孵育1 h，棄二抗，加入1×PBST洗3次，每次10 min；ECL化學發光法檢測目的蛋白。采用Image Station-4000MM PRO成像系統進行成像，結果用image J軟件定量處理。然后用stripping buffer洗膜兩次，每次15 min，再加入1×PBST洗3次，每次10 min，3% BSA室溫封閉1 h后，加入β-actin小鼠單克隆抗體(1∶2 500) ，4 ℃過夜，其余步驟同上，但二抗加HRP標記的羊抗小鼠(1∶25 000) 抗體。
2.2 BV-2細胞條件培養液對SH-SY5Y細胞存活率的影響
將BV-2細胞分為CPF組、生理鹽水(NS)組和二甲基亞砜(DMSO)組種植于6孔板，每孔30×104個細胞。當細胞進入對數生長期后，分別加入CPF(10 μmol/L)刺激或NS、DMSO繼續培養12 h，收集其條件培養液，3 000 g、4 ℃、5 min離心，去除細胞碎片，取上清。SH-SY5Y細胞種于96孔板，每孔30 000個細胞，培養24 h后，棄培養液，分別加入相對應的BV-2細胞的條件培養液，繼續孵育24 h。然后每孔加入MTT(0.5 mg/mL)，培養4 h，吸走上清，每孔加入200 μL DMSO，避光，搖床搖10 min，用多功能酶標儀在以570 nm為測定波長和以630 nm為參考波長下測定吸光度，用測定波長測得的吸光度減去參考波長測得的吸光度以消除背景干擾，所得的值即為吸光度值。
2.3 統計分析
本文實驗中所得數據均來自至少3次獨立實驗的結果，實驗數據以均值±標準差(x±s)表示，所有數據利用SPSS 17.0統計軟件包進行處理。組間比較先行方差齊性檢驗，方差齊者進行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
3 結果
3.1 CPF激活BV-2小膠質細胞
3.1.1 CPF刺激下BV-2細胞形態的變化
從細胞形態來看，CPF作用下激活的BV-2呈分枝狀，6 h即可見到該形態改變，12 h改變更加明顯，如圖 1所示。表明CPF可激活BV-2細胞。
圖1
10 μmol/L CPF刺激BV-2細胞12 h后細胞形態變化
Figure1.
Change of BV-2 cell morphology with CPF (10 μmol/L)stimulation for 12 h
3.1.2 CPF刺激下BV-2細胞炎癥因子mRNA的表達增加
CPF(10 μmol/L)刺激下，BV-2細胞iNOS mRNA、COX-2 mRNA表達增加，其中iNOS mRNA在刺激6 h達到峰值，為對照組7倍；COX-2 mRNA在刺激3h達到峰值，約為對照組3倍。iNOS mRNA水平在6、12、24 h與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05) ，COX-2 mRNA水平在3、6 h與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05) ，如圖 2所示。
圖2
不同時間CPF刺激組BV-2細胞炎癥因子iNOS mRNA、COX-2 mRNA表達情況
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3.1.3 CPF刺激下BV-2細胞炎癥因子iNOS、COX-2蛋白表達增加
CPF(10 μmol/L)刺激下，BV-2細胞iNOS、COX-2蛋白表達增加，在刺激后12 h達到峰值，分別約為對照組的5倍和12倍。iNOS、COX-2蛋白水平在3、6、12、24 h與對照組的差異均有統計學意義(P＜0.05) ，如圖 3所示。
圖3
不同時間CPF刺激組BV-2細胞iNOS、COX-2蛋白表達情況
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3.2 BV-2細胞條件培養液對SH-SY5Y細胞存活率的影響
CPF刺激組的BV-2細胞條件培養液對SH-SY5Y細胞存活率較NS對照組下降約20%，差異有統計學意義(P＜0.05) ；DMSO組與NS組SH-SY5Y細胞存活率無明顯差異，如見圖 4所示。
圖4
不同BV-2細胞條件培養液對SH-SY5Y細胞存活率的影響
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4 討論
有機磷殺蟲劑是一種常用的農類殺蟲劑，有機磷接觸史可增加帕金森病的發病風險[11]。CPF是一種低毒性的有機磷殺蟲劑，目前在農業上廣泛使用。一些動物實驗發現CPF可影響神經元的正常功能，如給予新生大鼠注射低于中毒劑量的CPF可導致多巴胺能神經元的減少[6]；Slotkin等[12]發現CPF影響了大鼠腦內兒茶酚胺的突觸間傳遞。而最近，有研究發現給予大鼠皮下注射CPF后其黒質紋狀體部位的小膠質細胞表達增加[8]。那么，小膠質細胞的增加與CPF所致的多巴胺能神經元損傷是否存在一定關系，小膠質細胞在帕金森發病機制中究竟起著什么樣的作用，是值得探討的問題。
早在1988年，有研究者通過尸檢發現帕金森病患者的黑質部位存在小膠質細胞的激活[13]。激活的小膠質細胞盡管對神經元有一定的保護作用，但過度的激活會分泌一系列細胞因子(cytokine)、炎性趨化因子(inflammatory ehemokines)、活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、花生四烯酸(arachidonic acid)代謝產物以及興奮性氨基酸如谷氨酸[13]等，可對神經元產生毒性作用。
iNOS在細胞受到刺激被激活后能產生NO，后者廣泛分布于生物體內各組織中，特別是神經組織中，是一種極不穩定的生物自由基，分子小，生物半衰期短。一方面NO在體內起著信號分子的作用，有參與學習、記憶，介導胃腸平滑肌松弛，擴張血管，抗腫瘤活性等作用。另一方面，NO又與多種中樞神經系統疾病有關，包括炎癥性的、感染性的、外傷性的以及神經退行性疾病如帕金森病等[14]。無論是尸檢帕金森病患者還是帕金森病小鼠模型中都發現在黑質紋狀體部位有大量的iNOS表達[14-15]；NO的代謝產物NO2-在帕金森病患者腦脊液中的濃度也較對照組高[16]。NO可能是通過形成Fe-NO復合物而對神經元產生毒性作用[17]。COX-2是花生四烯酸代謝的限速酶，為誘導型環氧酶，是經刺激迅速產生的誘導酶，由各種損傷性化學、物理和生物因子誘導其產生，進而催化前列腺素(prostaglandins,PGs)合成參與炎癥反應。在帕金森病患者和帕金森病動物模型中都發現了COX-2的參與，其中通過尸檢發現帕金森病患者黒質紋狀體部位的小膠質細胞COX-2表達升高[18]；MPTP制備的帕金森病小鼠腦組織中的小膠質細胞也高表達COX-2，而敲除COX-2基因后的小鼠可抵御MPTP引起的多巴胺能神經元丟失[19-20]。本研究發現BV-2小膠質細胞在低濃度CPF刺激下iNOS、COX-2的mRNA和蛋白表達均增加，說明低濃度的CPF即可激活小膠質細胞，導致其分泌一系列炎癥因子。小膠質細胞分泌的炎癥因子水平與帕金森病的發病呈顯著相關[21]，而這些炎癥因子在帕金森病發病中究竟起著神經保護作用還是破壞作用仍不明確。因此，我們進一步研究在CPF刺激下小膠質細胞產生的iNOS和COX-2究竟是促進了多巴胺能神經元的死亡還是發揮著神經元保護的作用。
我們以SH-SY5Y細胞為研究對象，該細胞衍生于人的神經母細胞瘤細胞系，表達兒茶酚胺能神經元特有的酪氨酸羥化酶、多巴胺2B2羥化酶和多巴胺轉運體，能很好地滿足我們的實驗要求。已經有研究發現CPF對SH-SY5Y 細胞有直接的損傷作用，且損傷作用隨著CPF濃度的增大而增加，而小于12.5 μmol/L濃度的CPF對神經元無直接的神經毒性[10]。為避免細胞培養液中CPF對SH-SY5Y細胞的直接毒性作用對實驗造成干擾，我們選擇10 μmol/L濃度的CPF。我們發現此濃度CPF作用于BV-2細胞后的條件培養液可導致SH-SY5Y細胞的存活率下降。
總之，本實驗發現CPF可激活小膠質細胞，使后者形態發生改變，激活的小膠質細胞還分泌一系列炎癥因子如iNOS、COX-2，而分泌的炎癥因子作用于多巴胺能神經元，可能在促進神經元的死亡中發揮了一定的作用，從而可能參與了帕金森病的發病過程。而這些炎癥因子具體通過什么方式導致的神經元損傷尚不明確，有待進一步的研究。
引言
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的老年期神經退行性疾病，臨床上以靜止性震顫、肌強直、運動減少和姿勢平衡障礙為特征，其特征性病理改變為黑質多巴胺(dopamine,DA )能神經細胞選擇性丟失和殘存神經細胞內路易小體(Lewy body,LB)的形成[1]。
帕金森病發病的具體原因不明，確切機制不清，可能與遺傳、年齡、環境因素有關，如：接觸殺蟲劑、除草劑、重金屬等[2]；機體產生內源性潛在的神經毒性、線粒體功能障礙、發生氧化應激反應、出現細胞凋亡等[3]；或發生免疫炎癥反應[4]等。
毒死蜱(chlorpyrifos,CPF)是一種在我國廣泛使用的具有神經元毒性的有機磷殺蟲劑，可存在于地下水及食物中，CPF代謝極慢，在食物殘渣中仍能檢測到其含量[5]。有動物實驗發現給予大鼠低于中毒劑量的CPF可造成黒質多巴胺能神經元丟失及運動能力、記憶的損傷[6-7]。最近，Zhang等[8]給予大鼠皮下注射CPF后發現其黒質部位多巴胺能神經元顯著減少，而小膠質細胞及星形膠質細胞增多，提示免疫炎癥可能參與了CPF導致的多巴胺能神經元丟失。小膠質細胞作為中樞神經系統的免疫細胞，正常情況下處于靜息狀態，其形態表現為分枝狀，起著免疫監視的作用，當有神經元死亡、外來物質入侵或腦組織發生損傷時小膠質細胞被激活，激活的小膠質細胞分泌一系列細胞因子和趨化因子[9]，其形態也由分枝狀的靜息狀態轉為阿米巴樣的激活狀態，吞噬外源性物質、清除細胞碎片，在帕金森病等神經退行性疾病中，小膠質細胞反復被激活，過度釋放的炎性因子最終導致神經元損傷、變性甚至死亡。
本研究將在細胞水平進一步觀察CPF是否直接激活小膠質細胞，并觀察小膠質細胞分泌的炎癥因子誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、環氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2) 的mRNA及蛋白表達水平是否改變，再進一步了解這種改變對神經元存活率的影響。
1 材料及所用儀器
1.1 細胞
小鼠源性小膠質細胞系BV-2細胞購于中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心；多巴胺能神經元細胞系SH-SY5Y細胞株購于美國典型培養物保藏中心(American type culture collection，ATCC)。
1.2 主要試劑
DMEM高糖培養基(Invitrogen)，胎牛血清(Invitrogen)，青-鏈霉素(Invitrogen)，胰酶(Invitrogen)，毒死蜱(Sigma)，Trizol(Invitrogen)，逆轉錄試劑盒(Takara)，DNA分子量標準(Takara)，兔iNOS抗體(Santa Cruz)，兔COX-2抗體(Santa Cruz)，β-actin小鼠單克隆抗體(Sigma-Aldrich)，羊抗小鼠IgG、HRP標記的抗生物素抗體(Invitrogen)，羊抗兔IgG、HRP標記的抗生物素抗體(Invitrogen)，MTT(Sigma)，其余試劑均為國產分析純。
1.3 主要儀器
VL-1臺式小型高速離心機(上海船廠設備分廠)，CH30-RF200系統攝影生物顯微鏡(Olympus)，－80 ℃超低溫冰箱(Thermo Forma)，凝膠電泳系統(Bio-Rad)，垂直電泳儀(Bio-Rad)，電泳儀(Tanon)，PCR儀(Bio-Rad)，酶標儀(BioTek)。
2 實驗方法
2.1 CPF對BV-2細胞的激活
2.1.1 細胞培養和藥物處理
小鼠源性小膠質細胞系BV-2細胞和SH-SY5Y細胞分別培養于含10％胎牛血清、1%的青-鏈霉素混合物的高糖DMEM細胞培養液內，在37 ℃、5%二氧化碳培養箱培養。當細胞長至80%左右融合時棄去培養液，PBS洗一遍，胰酶消化后傳代。有研究發現小于12.5 μmol/L的CPF對神經元無直接神經毒性[10]，因此，為避免細胞培養液中CPF對SH-SY5Y細胞的直接毒性作用對實驗造成干擾，當細胞進入對數生長期后，我們將BV-2細胞分成6組，選擇10 μmol/L濃度的CPF加入BV-2細胞分別作用0、1、3、6、12、24 h，然后在顯微鏡下觀察細胞形態并收集細胞RNA或者蛋白質于－80 ℃凍存。
2.1.2 小膠質細胞形態的變化
CPF(10 μmol/L)作用于BV-2細胞相應時間后將BV-2細胞置于顯微鏡下和未處理組比較觀察BV-2細胞形態的變化。
2.1.3 RT-PCR檢測細胞內iNOS、COX-2 mRNA的表達
采用Trizol法抽提BV-2細胞總RNA,用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度，分裝后于－80 ℃保存或進行下一步逆轉錄反應。將各組RNA濃度稀釋均等，按照TakaRa 1st-strand試劑盒提供的實驗方法進行逆轉錄反應，PCR擴增儀擴增，逆轉錄的cDNA于－20 ℃貯存備用。
采用DNAstar軟件設計引物，引物序列如下：iNOS(277 bp):正義鏈:5′-CTTCACCGGGTCAGAGCCACAGTCC-3′，反義鏈:5′-GAGCCAAGGCCAAACACAGCATAC-3′；COX-2(361 bp):正義鏈:5′-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3′，反義鏈:5′-TGGGCAAAGAATGCAAACATC-3′；β-actin(248 bp)：正義鏈:5′-AATCCTGGCATCCATGAA ACTAC-3′,反義鏈:5′-TCTGCTGGAAGGTGGAC AGTGAG-3′。基因CDS序列通過NCBI neucleotide庫獲得，所有引物都通過網上Blast比對進行特異性分析并檢驗其正確性。引物由Invitrogen公司合成。iNOS反應條件:94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s擴增25個循環，72 ℃保溫10 min。 COX-2反應條件:94 ℃ 5 min，然后94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s擴增25個循環，72 ℃保溫10 min。β-actin反應條件:95 ℃ 5 min，然后95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s擴增20個循環，72 ℃保溫10 min。整個過程在BioRad PCR儀上完成。PCR產物用1%的瓊脂糖(溶于1×Tris硼酸)凝膠電泳分離，用VDS成像系統掃描分析圖像，所得圖像用image J軟件定量處理，以目的條帶與內參條帶β-actin信號強度的比值代表BV-2細胞內mRNA的表達水平。
2.1.4 Western blot檢測iNOS、COX-2蛋白的表達
檢測不同分組BV-2細胞內iNOS、COX-2蛋白的表達，收集經CPF 10 μmol/L處理不同時間的BV-2細胞，用RIPA蛋白質抽提液抽提總蛋白，用預冷的PBS輕微沖洗三遍，最后一遍時用細胞刮將細胞刮下，置于1.5 mL EP管，3 000 g、4 ℃、5 min離心，棄上清，加入100 μL蛋白質提取液,冰上裂解30 min。然后12 000 g、4 ℃、30 min離心，取上清于－80 ℃凍存。避免反復凍融。
分別取30 μg總蛋白進行10%的十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。積層膠為80 V，電泳30 min；分離膠120 V、電泳90 min。然后80 V轉膜2 h，質量濃度為3% BSA室溫封閉2 h。一抗為多克隆兔抗iNOS抗體(1∶500) 、多克隆兔抗COX-2抗體(1∶750) ，4 ℃過夜。棄一抗，加入1×PBST洗3次，每次10 min。再加入二抗，二抗為羊抗兔IgG(1∶10 000) 抗體，室溫孵育1 h，棄二抗，加入1×PBST洗3次，每次10 min；ECL化學發光法檢測目的蛋白。采用Image Station-4000MM PRO成像系統進行成像，結果用image J軟件定量處理。然后用stripping buffer洗膜兩次，每次15 min，再加入1×PBST洗3次，每次10 min，3% BSA室溫封閉1 h后，加入β-actin小鼠單克隆抗體(1∶2 500) ，4 ℃過夜，其余步驟同上，但二抗加HRP標記的羊抗小鼠(1∶25 000) 抗體。
2.2 BV-2細胞條件培養液對SH-SY5Y細胞存活率的影響
將BV-2細胞分為CPF組、生理鹽水(NS)組和二甲基亞砜(DMSO)組種植于6孔板，每孔30×104個細胞。當細胞進入對數生長期后，分別加入CPF(10 μmol/L)刺激或NS、DMSO繼續培養12 h，收集其條件培養液，3 000 g、4 ℃、5 min離心，去除細胞碎片，取上清。SH-SY5Y細胞種于96孔板，每孔30 000個細胞，培養24 h后，棄培養液，分別加入相對應的BV-2細胞的條件培養液，繼續孵育24 h。然后每孔加入MTT(0.5 mg/mL)，培養4 h，吸走上清，每孔加入200 μL DMSO，避光，搖床搖10 min，用多功能酶標儀在以570 nm為測定波長和以630 nm為參考波長下測定吸光度，用測定波長測得的吸光度減去參考波長測得的吸光度以消除背景干擾，所得的值即為吸光度值。
2.3 統計分析
本文實驗中所得數據均來自至少3次獨立實驗的結果，實驗數據以均值±標準差(x±s)表示，所有數據利用SPSS 17.0統計軟件包進行處理。組間比較先行方差齊性檢驗，方差齊者進行單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。
3 結果
3.1 CPF激活BV-2小膠質細胞
3.1.1 CPF刺激下BV-2細胞形態的變化
從細胞形態來看，CPF作用下激活的BV-2呈分枝狀，6 h即可見到該形態改變，12 h改變更加明顯，如圖 1所示。表明CPF可激活BV-2細胞。
圖1
10 μmol/L CPF刺激BV-2細胞12 h后細胞形態變化
Figure1.
Change of BV-2 cell morphology with CPF (10 μmol/L)stimulation for 12 h
3.1.2 CPF刺激下BV-2細胞炎癥因子mRNA的表達增加
CPF(10 μmol/L)刺激下，BV-2細胞iNOS mRNA、COX-2 mRNA表達增加，其中iNOS mRNA在刺激6 h達到峰值，為對照組7倍；COX-2 mRNA在刺激3h達到峰值，約為對照組3倍。iNOS mRNA水平在6、12、24 h與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05) ，COX-2 mRNA水平在3、6 h與對照組比較差異均有統計學意義(P＜0.05) ，如圖 2所示。
圖2
不同時間CPF刺激組BV-2細胞炎癥因子iNOS mRNA、COX-2 mRNA表達情況
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3.1.3 CPF刺激下BV-2細胞炎癥因子iNOS、COX-2蛋白表達增加
CPF(10 μmol/L)刺激下，BV-2細胞iNOS、COX-2蛋白表達增加，在刺激后12 h達到峰值，分別約為對照組的5倍和12倍。iNOS、COX-2蛋白水平在3、6、12、24 h與對照組的差異均有統計學意義(P＜0.05) ，如圖 3所示。
圖3
不同時間CPF刺激組BV-2細胞iNOS、COX-2蛋白表達情況
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3.2 BV-2細胞條件培養液對SH-SY5Y細胞存活率的影響
CPF刺激組的BV-2細胞條件培養液對SH-SY5Y細胞存活率較NS對照組下降約20%，差異有統計學意義(P＜0.05) ；DMSO組與NS組SH-SY5Y細胞存活率無明顯差異，如見圖 4所示。
圖4
不同BV-2細胞條件培養液對SH-SY5Y細胞存活率的影響
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4 討論
有機磷殺蟲劑是一種常用的農類殺蟲劑，有機磷接觸史可增加帕金森病的發病風險[11]。CPF是一種低毒性的有機磷殺蟲劑，目前在農業上廣泛使用。一些動物實驗發現CPF可影響神經元的正常功能，如給予新生大鼠注射低于中毒劑量的CPF可導致多巴胺能神經元的減少[6]；Slotkin等[12]發現CPF影響了大鼠腦內兒茶酚胺的突觸間傳遞。而最近，有研究發現給予大鼠皮下注射CPF后其黒質紋狀體部位的小膠質細胞表達增加[8]。那么，小膠質細胞的增加與CPF所致的多巴胺能神經元損傷是否存在一定關系，小膠質細胞在帕金森發病機制中究竟起著什么樣的作用，是值得探討的問題。
早在1988年，有研究者通過尸檢發現帕金森病患者的黑質部位存在小膠質細胞的激活[13]。激活的小膠質細胞盡管對神經元有一定的保護作用，但過度的激活會分泌一系列細胞因子(cytokine)、炎性趨化因子(inflammatory ehemokines)、活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)、一氧化氮(nitric oxide,NO)、花生四烯酸(arachidonic acid)代謝產物以及興奮性氨基酸如谷氨酸[13]等，可對神經元產生毒性作用。
iNOS在細胞受到刺激被激活后能產生NO，后者廣泛分布于生物體內各組織中，特別是神經組織中，是一種極不穩定的生物自由基，分子小，生物半衰期短。一方面NO在體內起著信號分子的作用，有參與學習、記憶，介導胃腸平滑肌松弛，擴張血管，抗腫瘤活性等作用。另一方面，NO又與多種中樞神經系統疾病有關，包括炎癥性的、感染性的、外傷性的以及神經退行性疾病如帕金森病等[14]。無論是尸檢帕金森病患者還是帕金森病小鼠模型中都發現在黑質紋狀體部位有大量的iNOS表達[14-15]；NO的代謝產物NO2-在帕金森病患者腦脊液中的濃度也較對照組高[16]。NO可能是通過形成Fe-NO復合物而對神經元產生毒性作用[17]。COX-2是花生四烯酸代謝的限速酶，為誘導型環氧酶，是經刺激迅速產生的誘導酶，由各種損傷性化學、物理和生物因子誘導其產生，進而催化前列腺素(prostaglandins,PGs)合成參與炎癥反應。在帕金森病患者和帕金森病動物模型中都發現了COX-2的參與，其中通過尸檢發現帕金森病患者黒質紋狀體部位的小膠質細胞COX-2表達升高[18]；MPTP制備的帕金森病小鼠腦組織中的小膠質細胞也高表達COX-2，而敲除COX-2基因后的小鼠可抵御MPTP引起的多巴胺能神經元丟失[19-20]。本研究發現BV-2小膠質細胞在低濃度CPF刺激下iNOS、COX-2的mRNA和蛋白表達均增加，說明低濃度的CPF即可激活小膠質細胞，導致其分泌一系列炎癥因子。小膠質細胞分泌的炎癥因子水平與帕金森病的發病呈顯著相關[21]，而這些炎癥因子在帕金森病發病中究竟起著神經保護作用還是破壞作用仍不明確。因此，我們進一步研究在CPF刺激下小膠質細胞產生的iNOS和COX-2究竟是促進了多巴胺能神經元的死亡還是發揮著神經元保護的作用。
我們以SH-SY5Y細胞為研究對象，該細胞衍生于人的神經母細胞瘤細胞系，表達兒茶酚胺能神經元特有的酪氨酸羥化酶、多巴胺2B2羥化酶和多巴胺轉運體，能很好地滿足我們的實驗要求。已經有研究發現CPF對SH-SY5Y 細胞有直接的損傷作用，且損傷作用隨著CPF濃度的增大而增加，而小于12.5 μmol/L濃度的CPF對神經元無直接的神經毒性[10]。為避免細胞培養液中CPF對SH-SY5Y細胞的直接毒性作用對實驗造成干擾，我們選擇10 μmol/L濃度的CPF。我們發現此濃度CPF作用于BV-2細胞后的條件培養液可導致SH-SY5Y細胞的存活率下降。
總之，本實驗發現CPF可激活小膠質細胞，使后者形態發生改變，激活的小膠質細胞還分泌一系列炎癥因子如iNOS、COX-2，而分泌的炎癥因子作用于多巴胺能神經元，可能在促進神經元的死亡中發揮了一定的作用，從而可能參與了帕金森病的發病過程。而這些炎癥因子具體通過什么方式導致的神經元損傷尚不明確，有待進一步的研究。
