探討體外雙軸拉伸應變對大鼠骨髓間充質干細胞（rBMSCs）向成骨細胞分化的影響。分離4周齡SD大鼠BMSCs，將P3～P4代rBMSCs接種于DMEM-LG完全培養基的雙軸拉伸應變細胞培養小室中。當細胞生長至亞融合狀態后，給予細胞施加拉伸應變，頻率為1 Hz，應變幅度為1%、2%、5%，每個應變幅度均分別加載2 h/d、4 h/d、6 h/d，連續作用3 d。以未受拉伸應變的rBMSCs為空白對照組。以未受拉伸應變，含100 nmol/L雌二醇（E2）培養的rBMSCs為陽性對照組。通過實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測各組rBMSCs的堿性磷酸酶（ALP）、Ⅰ型膠原（ColⅠ）、Runt相關轉錄因子-2（Runx2）、骨鈣蛋白（OCN）mRNA和蛋白的表達量。實驗結果表明：（1）E2組rBMSCs中Runx2、ColⅠ、ALP、OCN mRNA及蛋白表達量均明顯高于空白對照組（P＜0.05）；（2）1%拉伸應變組rBMSCs中ALP、Runx2 mRNA和蛋白表達量均明顯高于空白對照組（P＜0.05），但與E2組相比明顯降低（P＜0.05）；（3）2%拉伸應變組rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA和蛋白表達量均明顯高于空白對照組（P＜0.05），其中，加載時間4 h/d組rBMSCs中ColⅠ、Runx2 mRNA和蛋白表達量明顯高于E2組（P＜0.05）；（4）5%拉伸應變組，加載時間2 h/d、4 h/d組rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2 mRNA和蛋白表達量均明顯高于空白對照組（P＜0.05），與E2組相比，加載時間4 h/d組的ColⅠ、Runx2 mRNA和蛋白表達量也明顯上調（P＜0.05）。本實驗結果提示，雌二醇和體外雙軸拉伸應變均可以誘導rBMSCs向成骨細胞分化，且拉伸應變幅度2%、加載時間4 h/d時，促rBMSCs成骨分化的作用最強。
引用本文： 張夢穎, 李晉川, 李匯明, 武庚, 曹成建, 吳文超, 李良. 體外雙軸拉伸應變誘導大鼠骨髓間充質干細胞成骨特異性標志物的表達. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(3): 499-505,519. doi: 10.7507/1001-5515.20160084 復制
引言
力學刺激促進骨形成已成為臨床治療骨質疏松、骨折等疾病的重要選項之一。研究表明，力學刺激促進骨組織的建造與重建，進而促進骨組織內環境穩定的作用，除了與成骨細胞的增殖和合成代謝增強有關，也與骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化能力相關[1-2]。BMSCs是一種存在于骨髓基質、具有自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，成骨細胞就主要來源于BMSCs。已有文獻報道[3-4]，BMSCs是一種力敏感細胞，力學振動、牽拉以及剪切力均可增強BMSCs的成骨分化，而缺少力學刺激則促進其成脂分化。我們實驗室前期工作也已經證實，2%的拉伸應變可調控正常大鼠和骨質疏松大鼠BMSCs(rat BMSCs,rBMSCs)成骨特異性標志物Runt相關轉錄因子-2(Runt-related transcription factor 2,Runx2) mRNA、Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ,ColⅠ)mRNA的表達[5]。在此基礎上，本實驗旨在進一步比較體外不同應變幅度、不同加載時間的雙軸拉伸應變對rBMSCs成骨特異性標志物Runx2、ColⅠ、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)mRNA和蛋白表達的影響，期望獲得促rBMSCs向成骨細胞分化的理想體外力學刺激參數，為體外力學刺激促進rBMSCs向成骨細胞分化以及研究可能的機制提供實驗基礎。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要儀器和試劑
1.1.1 實驗動物
健康清潔Sprague-Dawley(SD)大鼠(4周齡)，體重為80~120 g，由四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所提供。
1.1.2 主要儀器和試劑
CO2細胞培養孵箱(SANYO公司)，CFX96TM Real-time PCR System(BIO-RAD公司)，澳洲胎牛血清(FBS，Gibco公司)，DMEM低糖培養基干粉(Gibco公司)，胰蛋白酶、雙抗(Penicillin-Streptomycin Solution)(Hyclone公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)、實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR? Fast qPCR Mix)(TaKaRa公司)，Runx2抗體(proteintech，PTG公司)，ColⅠ抗體(proteintech，PTG公司)，ALP抗體(proteintech，PTG公司)，OCN抗體(Santa公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(中杉金橋公司)。凝膠成像儀(ChemiDocTMXRS+with Image LabTM，Bio-Rad，Inc.，USA)。DMEM-LG基礎培養基：DMEM-LG+無菌雙蒸水；DMEM-LG完全培養基：DMEM-LG基礎培養基+15%胎牛血清+1%雙抗。
1.2 rBMSCs的分離與培養
采用本實驗室常規全骨髓貼壁法分離rBMSCs[6]。斷頸法處死SD大鼠后在無菌環境下分離脛骨和股骨，并剔除其軟組織、筋膜和骨膜。75%乙醇浸泡脛骨和股骨1 min后去除兩端骨骺，用無菌注射器吸取10 mL的DMEM-LG基礎培養基，從骨髓腔內吹出骨髓，用15 mL離心管收集骨髓，4 ℃、900 r/min離心5 min，棄掉上清，加入3 mL DMEM-LG完全培養基。將細胞重懸后以3×105個/cm2的細胞密度接種于25 cm2細胞培養瓶中，添加DMEM-LG完全培養基至3 mL，于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱中培養。接種后3 h首次換液，之后的72 h內每8 h換液1次。第4天起，每間隔2 d換液1次。待細胞生長到85%左右融合狀態時進行傳代。選用第3~4代(P3~P4) rBMSCs用于實驗。實驗前對細胞進行臺盼藍細胞活力計數，細胞活力均在98%以上。
1.3 實驗分組
將rBMSCs隨機分為三組：拉伸應變組、雌二醇(E2) 組和空白對照組。各組均以3×104個/cm2細胞密度接種于力學加載裝置和6孔板中，DMEM-LG完全培養基培養，待細胞完全貼壁、長至融合狀態后，用含2% FBS的DMEM-LG培養基饑餓細胞12 h。次日將培養基更換為DMEM-LG完全培養基，然后分別做相應處理，各組同時間收集樣本。
1.3.1 拉伸應變組
采用本實驗室自制的雙軸拉伸應變細胞培養裝置對rBMSCs加載力學刺激[7]。拉伸應變幅度分別為1%、2%、5%，加載頻率為1 Hz，各應變幅度每天分別加載2、4、6 h，均在相同時間點開始加載，持續作用3 d，然后收取樣本。
1.3.2 E2組
用含100 nmol/L E2的完全培養基靜態培養rBMSCs 3 d后收集樣本。
1.3.3 空白對照組
不進行任何處理，用DMED-LG完全培養基靜態培養rBMSCs 3 d后收取樣本。
1.4 檢測指標
1.4.1 實時熒光定量PCR法
測定各組中ALP、ColⅠ、Runx2和OCN的mRNA表達。用Trizol Reagent在對應的時間點提取各組rBMSCs的總mRNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測各組總mRNA的完整性。通過檢測各組mRNA的A260與A280的比值以判定其純度，并計算總mRNA的濃度。每組樣品取1 μg的總mRNA逆轉錄生成cDNA，根據濃度計算出所需體積。依據TaKaRa公司所提供的逆轉錄試劑盒說明書，首先向EP管中加入去除基因組DNA反應液及樣本總mRNA，并將EP管放入逆轉錄儀中，設定程序參數，42 ℃ 2 min，然后將反應后溶液與其余反應液混合置于新EP管中，逆轉錄儀設定逆轉錄反應程序37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，進行逆轉錄。生成的cDNA中取2 μL作為實時熒光定量PCR的模板，根據SYBR? Fast qPCR Mix試劑盒說明書進行操作，反應體系25 μL。 熒光定量PCR的反應參數：預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，總共40個循環。并做溶解曲線分析。用內參基因(GAPDH)表達量校正目的基因相對表達量，即用目的基因的測量值與內參基因測量值的比值表示。內參GAPDH mRNA、Runx2、ColⅠ、ALP和OCN的mRNA實時熒光定量PCR的引物序列如表 1所示。
表1
GAPDH mRNA、Runx2 mRNA、ALP mRNA、ColⅠmRNA、OCN mRNA的實時熒光定量PCR的引物序列
Table1.
Primer sequences of the real-time PCR for GAPDH mRNA,Runx2 mRNA,Col Ⅰ mRNA,ALP mRNA and OCN mRNA
1.4.2 蛋白免疫印記實驗(Western blot)
檢測2%、5%拉伸應變各組ALP蛋白、ColⅠ蛋白、Runx2蛋白和OCN蛋白表達。首先，采用4 ℃預冷的PBS漂洗各組細胞3次，每次5 min，隨后每孔加入100 μL蛋白裂解液，并用細胞刮子刮取細胞。將細胞碎片裂解液移至相應的1.5 mL EP管中，靜置30 min(所有的操作都要在冰上進行)；4 ℃、12 000 r/min離心8 min后，吸取上清至新的EP管中。對各組總蛋白進行定量，變性，后經Western blot跑膠，轉膜，封閉后孵育一抗(β-actin，Runx2、ColⅠ、ALP、OCN，1∶200) ，4 ℃過夜。第二天室溫下孵育二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔，1∶3 000) ，37 ℃孵育1~2 h后，在凝膠成像儀上顯影后用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。用內參蛋白(β-actin)來校正目的蛋白，即用目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值來表示。
1.5 統計學分析
本實驗均重復3次或以上(n≥3) ，所有數據均用統計軟件SPSS 17.0處理。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間差異比較，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)方法。每組數據以均數±標準差(x±s)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 E2對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達量的影響
如圖 1所示，與空白對照組比較，E2可明顯上調rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN、Runx2 mRNA表達量。
圖1
不同拉伸應變組rBMSCs中ALP mRNA、ColⅠ mRNA、Runx2 mRNA、OCN mRNA的相對表達量(x±s,n=3)
(a)1%拉伸應變組；(b)2%拉伸應變組;(c)5%拉伸應變組
(a) 1% tensile strain group； (b) 2% tensile strain group; (c) 5% tensile strain group
2.2 不同應變幅度、不同加載時間對rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN、Runx2 mRNA表達量的影響
2.2.1 加載1%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達量的影響
如圖 1(a)所示，與空白對照組比較，不同的加載時間均可促進rBMSCs中ColⅠ mRNA、OCN mRNA表達量上調，而加載時間6 h組rBMSCs中Runx2 mRNA表達量明顯降低；其中加載時間4 h組促rBMSCs中ColⅠmRNA表達量上調作用最強，加載時間4 h組和6 h組促rBMSCs中OCN mRNA表達量上調作用高于加載時間2 h組。與E2組比較，不同的加載時間rBMSCs中Runx2 mRNA的表達量均明顯降低；加載時間4 h、6 h組rBMSCs中ALP mRNA表達量，以及加載時間2 h、6 h組ColⅠmRNA表達量以及加載時間2 h組OCN mRNA表達量也明顯降低。
2.2.2 加載2%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達量的影響
如圖 1(b)所示，與對照組比較，不同的加載時間均可促進rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN的mRNA表達量上調，其中加載時間4 h組促rBMSCs中ALP mRNA、ColⅠ mRNA和Runx2 mRNA表達的作用最強，加載時間6 h組促rBMSCs中OCN mRNA表達的作用最強。與E2組比較，加載時間4 h組和6 h組，rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN的mRNA表達量明顯上調；而加載時間2 h組，rBMSCs中ColⅠ mRNA表達量也明顯上調。
2.2.3 加載5%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達量的影響
如圖 1(c)所示，與對照組比較，不同的加載時間均可促進rBMSCs中ColⅠmRNA、OCN mRNA表達量上調；加載時間4 h組rBMSCs中ALP mRNA、Runx2 mRNA表達量明顯上調，而加載時間6 h組rBMSCs的Runx2 mRNA表達量明顯下調。與E2組比較，加載時間2 h和4 h組rBMSCs中ALP mRNA、ColⅠmRNA、Runx2 mRNA、OCN mRNA表達量明顯上調，但2 h組上調幅度低于4 h組；加載時間6 h組rBMSCs中OCN mRNA表達量上調，而ALP mRNA、Runx2 mRNA表達量下調。
2.2.4 不同應變幅度加載時間4 h組促rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達作用的比較
由上述結果可見，與加載時間2 h和6 h組比較，加載時間4 h組促rBMSCs的成骨特異性基因表達的效果較好，因此將各應變幅度4 h組進行對比。如圖 2所示，與1%應變幅度比較，2%、5%應變幅度可明顯促進rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2和OCN mRNA表達量上調，且2%應變幅度對ColⅠ mRNA和Runx2 mRNA的上調效果明顯優于5%應變幅度。
圖2
不同應變幅度4 h組rBMSCs中ALP mRNA、ColⅠmRNA、Runx2 mRNA、OCN mRNA的相對表達量( x±s,n=3)
#
#
2.3 E2對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN 蛋白表達量的影響
如圖 3所示，與空白對照組比較，E2可明顯上調rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN、Runx2的蛋白表達量。
圖3
不同拉伸應變組間rBMSCs的ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白電泳條帶及其相對表達量(x±s,n=3)
(a): 2%拉伸應變組；(b)：5%拉伸應變組
*
(a): 2% tensile strain group；(b)：5% tensile strain group
*
2.4 不同應變幅度、不同加載時間對rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN、Runx2蛋白表達量的影響
2.4.1 加載2%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達量的影響
如圖 3(a)所示，與空白對照組比較，不同加載時間均可促進rBMSCs中ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達量增高，其中加載時間4 h組rBMSCs中ALP蛋白表達量也明顯增高。與E2組比較，加載時間2 h組rBMSCs中ColⅠ蛋白表達量明顯高于E2組，ALP和OCN的蛋白表達量明顯低于E2組；加載時間4 h組rBMSCs中ColⅠ和Runx2的蛋白表達量明顯高于E2組，ALP和OCN蛋白表達量明顯低于E2組；加載時間6 h組rBMSCs中ALP和OCN蛋白表達量明顯低于E2組；其中加載時間4 h組rBMSCs中ALP、ColⅠ和Runx2的蛋白表達量均明顯高于加載時間2 h和6 h組。
2.4.2 加載5%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達量的影響
如圖 3(b)所示，與空白對照組比較，加載時間2 h組和4 h組rBMSCs中ALP、ColⅠ和Runx2 蛋白表達量明顯增高，且加載時間2h組和6h組OCN蛋白表達量明顯降低。與E2組比較，加載時間2 h組rBMSCs中ColⅠ蛋白表達量明顯增高，加載時間4 h組rBMSCs中ColⅠ和Runx2 蛋白表達量明顯增高，但ALP和OCN 蛋白表達量明顯下降；加載時間6 h組rBMSCs中ALP、Runx2、OCN蛋白表達量均明顯低于E2組。
2.4.3 不同應變幅度加載時間4 h組rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達作用的比較
上述結果顯示，當加載時間為4 h組時促rBMSCs中各成骨相關蛋白表達的效果較為明顯，因此我們對應變幅度為2%和5%中加載時間4 h組進行比較，如圖 4所示。與5%應變幅度比較，采用2%應變幅度可明顯促進rBMSCs中ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達量的上調。
圖4
不同應變幅度4 h組rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白相對表達量( x±s,n=3)
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3 討論
骨質疏松癥可造成嚴重骨折，并會引發或加重心腦血管疾病，同時也給患者帶來沉重的經濟負擔。目前臨床用于治療骨質疏松的主要方法是藥物治療。藥物治療雖然在一定程度上可以緩解病狀，但因其嚴重的副作用、高給藥頻率和低耐受性，使患者的選擇非常有限[8-9]。雌激素替代療法是治療絕經后骨質疏松的選擇之一。研究表明[10]，E2可以有效減少骨丟失，并且促進人類BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)的增殖和成骨分化。但因其存在一定風險，包括增加罹患乳腺癌、子宮內膜癌、中風、靜脈血栓等疾病的風險，因此雌激素替代療法并不適合于臨床廣泛應用。
力學牽拉可以調節細胞的多種關鍵功能(例如增殖和分化)以及再生哺乳動物的多種組織[11-12]。適當程度的牽拉對于骨損傷后骨組織的再生和重建尤為重要[12-13]。力學和生化刺激可以促進干細胞向不同細胞系分化，缺少力學應變則會減少BMSCs向成骨細胞分化的機率，從而導致骨質疏松。由于BMSCs在骨髓腔始終處于力學環境中，這種微環境對BMSCs的多向分化潛能是不可或缺的。Yamazaki等[14]研究發現缺乏力學應變可以抑制BMSCs的成骨分化，而促進其成脂分化。目前力學刺激已經用于增強BMSCs的增殖與分化能力。Luu等[15-16]發現低強度力學刺激(low-magnitude mechanical signals,LMMS)可以促進骨生成并抑制脂肪生成，LMMS治療下的小鼠間充質干細胞的Runx2表達增強。Yang等[17]用循環拉伸應變可以增加大鼠BMSCs的Runx2表達。相反，由于脊柱或腦損傷導致的身體活動缺乏可以顯著減少BMSCs受到的力學應變，從而使骨生成速率降低[16]。航空條件下的低力學環境可導致骨平均每月丟失1%~2%，最終誘發骨質疏松[18]。而且本實驗室有關力學刺激的前期實驗也表明，力學刺激組rBMSCs中成骨早期發育轉錄因子Runx2 mRNA及ColⅠmRNA表達量明顯高于空白對照組[5]。本實驗選用了ColⅠ、ALP、Runx2、OCN作為基因和蛋白檢測指標。ALP是成骨細胞的表型標志物之一，它可直接反映成骨細胞的活性或功能狀況，屬于早期表達蛋白。成骨細胞特異性轉錄因子Runx2是調控大量成骨細胞生長相關基因的“控制開關”，屬于早期表達蛋白。ColⅠ是骨組織中含量最多的胞外蛋白，它在成骨細胞生長的全過程中均有表達，其啟動子活性受到Runx2的影響。而OCN則是較晚期的骨基質蛋白，是由分化成熟的成骨細胞合成和分泌的維生素K依賴性鈣結合蛋白。
本實驗采用的力學刺激是雙軸拉伸應變，可以更好地模擬正常生理活動下BMSCs在骨髓腔中的受力變化，與體內BMSCs受到的力學載荷比較相似。目前多數研究認為，應變大小范圍在1%~5%中對細胞是正性刺激，而頻率1 Hz與平常心臟跳動的節奏和正常生理活動的速度接近。Li等[19]給予大鼠BMSCs5%的拉伸應變，細胞中成骨細胞轉錄因子Runx2和OSX的表達明顯上調。我們采用應變幅度為1%、2%、5%，頻率為1 Hz的雙軸拉伸應變，各應變幅度分別加載2 h/d、4 h/d、6 h/d，連續作用3 d。本實驗中，應變幅度1%下成骨相關基因表達量并未明顯增加，因此未進行成骨特異性蛋白表達量的檢測。實驗結果顯示，雙軸拉伸應變可明顯上調rBMSCs成骨特異性標志物mRNA和蛋白的表達量，且2%，4 h/d組表達量最高。其中，應變幅度5%中加載時間6 h組rBMSCs中Runx2、ColⅠ、ALP、OCN的mRNA和蛋白表達量明顯低于4 h組，可能是由于力學加載幅度和持續時間超出細胞所能承受范圍，導致細胞處于較差的生長狀態或停止生長，少量細胞已經不再貼壁而凋亡；ColⅠ和Runx2蛋白表達量明顯高于E2組，而OCN的蛋白表達量卻明顯低于E2組，可能與ColⅠ的啟動子活性依賴于轉錄因子Runx2有關，故其蛋白表達量的變化與Runx2相保持一致，OCN屬于晚期表達蛋白，其表達量低于早期的ALP和Runx2的蛋白表達量，同時也說明，力學刺激可能更有利于成骨細胞的早期表達蛋白。因此本實驗得出結論：E2與體外雙軸拉伸應變均可以促進rBMSCs向成骨細胞分化，本實驗條件下比較好的力學刺激參數為頻率1 Hz、應變幅度2%、作用時間4 h/d、連續作用3 d。但雙軸拉伸應變促rBMSCs向成骨細胞分化的機制尚不清楚，因此還需進一步探討。
引言
力學刺激促進骨形成已成為臨床治療骨質疏松、骨折等疾病的重要選項之一。研究表明，力學刺激促進骨組織的建造與重建，進而促進骨組織內環境穩定的作用，除了與成骨細胞的增殖和合成代謝增強有關，也與骨髓間充質干細胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化能力相關[1-2]。BMSCs是一種存在于骨髓基質、具有自我更新能力和多向分化潛能的干細胞，成骨細胞就主要來源于BMSCs。已有文獻報道[3-4]，BMSCs是一種力敏感細胞，力學振動、牽拉以及剪切力均可增強BMSCs的成骨分化，而缺少力學刺激則促進其成脂分化。我們實驗室前期工作也已經證實，2%的拉伸應變可調控正常大鼠和骨質疏松大鼠BMSCs(rat BMSCs,rBMSCs)成骨特異性標志物Runt相關轉錄因子-2(Runt-related transcription factor 2,Runx2) mRNA、Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ,ColⅠ)mRNA的表達[5]。在此基礎上，本實驗旨在進一步比較體外不同應變幅度、不同加載時間的雙軸拉伸應變對rBMSCs成骨特異性標志物Runx2、ColⅠ、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)mRNA和蛋白表達的影響，期望獲得促rBMSCs向成骨細胞分化的理想體外力學刺激參數，為體外力學刺激促進rBMSCs向成骨細胞分化以及研究可能的機制提供實驗基礎。
1 材料和方法
1.1 實驗動物、主要儀器和試劑
1.1.1 實驗動物
健康清潔Sprague-Dawley(SD)大鼠(4周齡)，體重為80~120 g，由四川省醫學科學院四川省人民醫院實驗動物研究所提供。
1.1.2 主要儀器和試劑
CO2細胞培養孵箱(SANYO公司)，CFX96TM Real-time PCR System(BIO-RAD公司)，澳洲胎牛血清(FBS，Gibco公司)，DMEM低糖培養基干粉(Gibco公司)，胰蛋白酶、雙抗(Penicillin-Streptomycin Solution)(Hyclone公司)，Trizol Reagent(Invitrogen公司)，逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser)、實時熒光定量PCR試劑盒(SYBR? Fast qPCR Mix)(TaKaRa公司)，Runx2抗體(proteintech，PTG公司)，ColⅠ抗體(proteintech，PTG公司)，ALP抗體(proteintech，PTG公司)，OCN抗體(Santa公司)，辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體(中杉金橋公司)。凝膠成像儀(ChemiDocTMXRS+with Image LabTM，Bio-Rad，Inc.，USA)。DMEM-LG基礎培養基：DMEM-LG+無菌雙蒸水；DMEM-LG完全培養基：DMEM-LG基礎培養基+15%胎牛血清+1%雙抗。
1.2 rBMSCs的分離與培養
采用本實驗室常規全骨髓貼壁法分離rBMSCs[6]。斷頸法處死SD大鼠后在無菌環境下分離脛骨和股骨，并剔除其軟組織、筋膜和骨膜。75%乙醇浸泡脛骨和股骨1 min后去除兩端骨骺，用無菌注射器吸取10 mL的DMEM-LG基礎培養基，從骨髓腔內吹出骨髓，用15 mL離心管收集骨髓，4 ℃、900 r/min離心5 min，棄掉上清，加入3 mL DMEM-LG完全培養基。將細胞重懸后以3×105個/cm2的細胞密度接種于25 cm2細胞培養瓶中，添加DMEM-LG完全培養基至3 mL，于37 ℃、5% CO2飽和濕度孵箱中培養。接種后3 h首次換液，之后的72 h內每8 h換液1次。第4天起，每間隔2 d換液1次。待細胞生長到85%左右融合狀態時進行傳代。選用第3~4代(P3~P4) rBMSCs用于實驗。實驗前對細胞進行臺盼藍細胞活力計數，細胞活力均在98%以上。
1.3 實驗分組
將rBMSCs隨機分為三組：拉伸應變組、雌二醇(E2) 組和空白對照組。各組均以3×104個/cm2細胞密度接種于力學加載裝置和6孔板中，DMEM-LG完全培養基培養，待細胞完全貼壁、長至融合狀態后，用含2% FBS的DMEM-LG培養基饑餓細胞12 h。次日將培養基更換為DMEM-LG完全培養基，然后分別做相應處理，各組同時間收集樣本。
1.3.1 拉伸應變組
采用本實驗室自制的雙軸拉伸應變細胞培養裝置對rBMSCs加載力學刺激[7]。拉伸應變幅度分別為1%、2%、5%，加載頻率為1 Hz，各應變幅度每天分別加載2、4、6 h，均在相同時間點開始加載，持續作用3 d，然后收取樣本。
1.3.2 E2組
用含100 nmol/L E2的完全培養基靜態培養rBMSCs 3 d后收集樣本。
1.3.3 空白對照組
不進行任何處理，用DMED-LG完全培養基靜態培養rBMSCs 3 d后收取樣本。
1.4 檢測指標
1.4.1 實時熒光定量PCR法
測定各組中ALP、ColⅠ、Runx2和OCN的mRNA表達。用Trizol Reagent在對應的時間點提取各組rBMSCs的總mRNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測各組總mRNA的完整性。通過檢測各組mRNA的A260與A280的比值以判定其純度，并計算總mRNA的濃度。每組樣品取1 μg的總mRNA逆轉錄生成cDNA，根據濃度計算出所需體積。依據TaKaRa公司所提供的逆轉錄試劑盒說明書，首先向EP管中加入去除基因組DNA反應液及樣本總mRNA，并將EP管放入逆轉錄儀中，設定程序參數，42 ℃ 2 min，然后將反應后溶液與其余反應液混合置于新EP管中，逆轉錄儀設定逆轉錄反應程序37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，進行逆轉錄。生成的cDNA中取2 μL作為實時熒光定量PCR的模板，根據SYBR? Fast qPCR Mix試劑盒說明書進行操作，反應體系25 μL。 熒光定量PCR的反應參數：預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，總共40個循環。并做溶解曲線分析。用內參基因(GAPDH)表達量校正目的基因相對表達量，即用目的基因的測量值與內參基因測量值的比值表示。內參GAPDH mRNA、Runx2、ColⅠ、ALP和OCN的mRNA實時熒光定量PCR的引物序列如表 1所示。
表1
GAPDH mRNA、Runx2 mRNA、ALP mRNA、ColⅠmRNA、OCN mRNA的實時熒光定量PCR的引物序列
Table1.
Primer sequences of the real-time PCR for GAPDH mRNA,Runx2 mRNA,Col Ⅰ mRNA,ALP mRNA and OCN mRNA
1.4.2 蛋白免疫印記實驗(Western blot)
檢測2%、5%拉伸應變各組ALP蛋白、ColⅠ蛋白、Runx2蛋白和OCN蛋白表達。首先，采用4 ℃預冷的PBS漂洗各組細胞3次，每次5 min，隨后每孔加入100 μL蛋白裂解液，并用細胞刮子刮取細胞。將細胞碎片裂解液移至相應的1.5 mL EP管中，靜置30 min(所有的操作都要在冰上進行)；4 ℃、12 000 r/min離心8 min后，吸取上清至新的EP管中。對各組總蛋白進行定量，變性，后經Western blot跑膠，轉膜，封閉后孵育一抗(β-actin，Runx2、ColⅠ、ALP、OCN，1∶200) ，4 ℃過夜。第二天室溫下孵育二抗(辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠，辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔，1∶3 000) ，37 ℃孵育1~2 h后，在凝膠成像儀上顯影后用Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。用內參蛋白(β-actin)來校正目的蛋白，即用目的蛋白條帶灰度值與內參蛋白條帶灰度值的比值來表示。
1.5 統計學分析
本實驗均重復3次或以上(n≥3) ，所有數據均用統計軟件SPSS 17.0處理。采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間差異比較，組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)方法。每組數據以均數±標準差(x±s)表示，以P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 E2對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達量的影響
如圖 1所示，與空白對照組比較，E2可明顯上調rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN、Runx2 mRNA表達量。
圖1
不同拉伸應變組rBMSCs中ALP mRNA、ColⅠ mRNA、Runx2 mRNA、OCN mRNA的相對表達量(x±s,n=3)
(a)1%拉伸應變組；(b)2%拉伸應變組;(c)5%拉伸應變組
(a) 1% tensile strain group； (b) 2% tensile strain group; (c) 5% tensile strain group
2.2 不同應變幅度、不同加載時間對rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN、Runx2 mRNA表達量的影響
2.2.1 加載1%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達量的影響
如圖 1(a)所示，與空白對照組比較，不同的加載時間均可促進rBMSCs中ColⅠ mRNA、OCN mRNA表達量上調，而加載時間6 h組rBMSCs中Runx2 mRNA表達量明顯降低；其中加載時間4 h組促rBMSCs中ColⅠmRNA表達量上調作用最強，加載時間4 h組和6 h組促rBMSCs中OCN mRNA表達量上調作用高于加載時間2 h組。與E2組比較，不同的加載時間rBMSCs中Runx2 mRNA的表達量均明顯降低；加載時間4 h、6 h組rBMSCs中ALP mRNA表達量，以及加載時間2 h、6 h組ColⅠmRNA表達量以及加載時間2 h組OCN mRNA表達量也明顯降低。
2.2.2 加載2%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達量的影響
如圖 1(b)所示，與對照組比較，不同的加載時間均可促進rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN的mRNA表達量上調，其中加載時間4 h組促rBMSCs中ALP mRNA、ColⅠ mRNA和Runx2 mRNA表達的作用最強，加載時間6 h組促rBMSCs中OCN mRNA表達的作用最強。與E2組比較，加載時間4 h組和6 h組，rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN的mRNA表達量明顯上調；而加載時間2 h組，rBMSCs中ColⅠ mRNA表達量也明顯上調。
2.2.3 加載5%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達量的影響
如圖 1(c)所示，與對照組比較，不同的加載時間均可促進rBMSCs中ColⅠmRNA、OCN mRNA表達量上調；加載時間4 h組rBMSCs中ALP mRNA、Runx2 mRNA表達量明顯上調，而加載時間6 h組rBMSCs的Runx2 mRNA表達量明顯下調。與E2組比較，加載時間2 h和4 h組rBMSCs中ALP mRNA、ColⅠmRNA、Runx2 mRNA、OCN mRNA表達量明顯上調，但2 h組上調幅度低于4 h組；加載時間6 h組rBMSCs中OCN mRNA表達量上調，而ALP mRNA、Runx2 mRNA表達量下調。
2.2.4 不同應變幅度加載時間4 h組促rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN mRNA表達作用的比較
由上述結果可見，與加載時間2 h和6 h組比較，加載時間4 h組促rBMSCs的成骨特異性基因表達的效果較好，因此將各應變幅度4 h組進行對比。如圖 2所示，與1%應變幅度比較，2%、5%應變幅度可明顯促進rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2和OCN mRNA表達量上調，且2%應變幅度對ColⅠ mRNA和Runx2 mRNA的上調效果明顯優于5%應變幅度。
圖2
不同應變幅度4 h組rBMSCs中ALP mRNA、ColⅠmRNA、Runx2 mRNA、OCN mRNA的相對表達量( x±s,n=3)
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2.3 E2對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN 蛋白表達量的影響
如圖 3所示，與空白對照組比較，E2可明顯上調rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN、Runx2的蛋白表達量。
圖3
不同拉伸應變組間rBMSCs的ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白電泳條帶及其相對表達量(x±s,n=3)
(a): 2%拉伸應變組；(b)：5%拉伸應變組
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(a): 2% tensile strain group；(b)：5% tensile strain group
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2.4 不同應變幅度、不同加載時間對rBMSCs中ALP、ColⅠ、OCN、Runx2蛋白表達量的影響
2.4.1 加載2%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達量的影響
如圖 3(a)所示，與空白對照組比較，不同加載時間均可促進rBMSCs中ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達量增高，其中加載時間4 h組rBMSCs中ALP蛋白表達量也明顯增高。與E2組比較，加載時間2 h組rBMSCs中ColⅠ蛋白表達量明顯高于E2組，ALP和OCN的蛋白表達量明顯低于E2組；加載時間4 h組rBMSCs中ColⅠ和Runx2的蛋白表達量明顯高于E2組，ALP和OCN蛋白表達量明顯低于E2組；加載時間6 h組rBMSCs中ALP和OCN蛋白表達量明顯低于E2組；其中加載時間4 h組rBMSCs中ALP、ColⅠ和Runx2的蛋白表達量均明顯高于加載時間2 h和6 h組。
2.4.2 加載5%應變幅度對rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達量的影響
如圖 3(b)所示，與空白對照組比較，加載時間2 h組和4 h組rBMSCs中ALP、ColⅠ和Runx2 蛋白表達量明顯增高，且加載時間2h組和6h組OCN蛋白表達量明顯降低。與E2組比較，加載時間2 h組rBMSCs中ColⅠ蛋白表達量明顯增高，加載時間4 h組rBMSCs中ColⅠ和Runx2 蛋白表達量明顯增高，但ALP和OCN 蛋白表達量明顯下降；加載時間6 h組rBMSCs中ALP、Runx2、OCN蛋白表達量均明顯低于E2組。
2.4.3 不同應變幅度加載時間4 h組rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達作用的比較
上述結果顯示，當加載時間為4 h組時促rBMSCs中各成骨相關蛋白表達的效果較為明顯，因此我們對應變幅度為2%和5%中加載時間4 h組進行比較，如圖 4所示。與5%應變幅度比較，采用2%應變幅度可明顯促進rBMSCs中ColⅠ、Runx2、OCN蛋白表達量的上調。
圖4
不同應變幅度4 h組rBMSCs中ALP、ColⅠ、Runx2、OCN蛋白相對表達量( x±s,n=3)
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3 討論
骨質疏松癥可造成嚴重骨折，并會引發或加重心腦血管疾病，同時也給患者帶來沉重的經濟負擔。目前臨床用于治療骨質疏松的主要方法是藥物治療。藥物治療雖然在一定程度上可以緩解病狀，但因其嚴重的副作用、高給藥頻率和低耐受性，使患者的選擇非常有限[8-9]。雌激素替代療法是治療絕經后骨質疏松的選擇之一。研究表明[10]，E2可以有效減少骨丟失，并且促進人類BMSCs(human BMSCs,hBMSCs)的增殖和成骨分化。但因其存在一定風險，包括增加罹患乳腺癌、子宮內膜癌、中風、靜脈血栓等疾病的風險，因此雌激素替代療法并不適合于臨床廣泛應用。
力學牽拉可以調節細胞的多種關鍵功能(例如增殖和分化)以及再生哺乳動物的多種組織[11-12]。適當程度的牽拉對于骨損傷后骨組織的再生和重建尤為重要[12-13]。力學和生化刺激可以促進干細胞向不同細胞系分化，缺少力學應變則會減少BMSCs向成骨細胞分化的機率，從而導致骨質疏松。由于BMSCs在骨髓腔始終處于力學環境中，這種微環境對BMSCs的多向分化潛能是不可或缺的。Yamazaki等[14]研究發現缺乏力學應變可以抑制BMSCs的成骨分化，而促進其成脂分化。目前力學刺激已經用于增強BMSCs的增殖與分化能力。Luu等[15-16]發現低強度力學刺激(low-magnitude mechanical signals,LMMS)可以促進骨生成并抑制脂肪生成，LMMS治療下的小鼠間充質干細胞的Runx2表達增強。Yang等[17]用循環拉伸應變可以增加大鼠BMSCs的Runx2表達。相反，由于脊柱或腦損傷導致的身體活動缺乏可以顯著減少BMSCs受到的力學應變，從而使骨生成速率降低[16]。航空條件下的低力學環境可導致骨平均每月丟失1%~2%，最終誘發骨質疏松[18]。而且本實驗室有關力學刺激的前期實驗也表明，力學刺激組rBMSCs中成骨早期發育轉錄因子Runx2 mRNA及ColⅠmRNA表達量明顯高于空白對照組[5]。本實驗選用了ColⅠ、ALP、Runx2、OCN作為基因和蛋白檢測指標。ALP是成骨細胞的表型標志物之一，它可直接反映成骨細胞的活性或功能狀況，屬于早期表達蛋白。成骨細胞特異性轉錄因子Runx2是調控大量成骨細胞生長相關基因的“控制開關”，屬于早期表達蛋白。ColⅠ是骨組織中含量最多的胞外蛋白，它在成骨細胞生長的全過程中均有表達，其啟動子活性受到Runx2的影響。而OCN則是較晚期的骨基質蛋白，是由分化成熟的成骨細胞合成和分泌的維生素K依賴性鈣結合蛋白。
本實驗采用的力學刺激是雙軸拉伸應變，可以更好地模擬正常生理活動下BMSCs在骨髓腔中的受力變化，與體內BMSCs受到的力學載荷比較相似。目前多數研究認為，應變大小范圍在1%~5%中對細胞是正性刺激，而頻率1 Hz與平常心臟跳動的節奏和正常生理活動的速度接近。Li等[19]給予大鼠BMSCs5%的拉伸應變，細胞中成骨細胞轉錄因子Runx2和OSX的表達明顯上調。我們采用應變幅度為1%、2%、5%，頻率為1 Hz的雙軸拉伸應變，各應變幅度分別加載2 h/d、4 h/d、6 h/d，連續作用3 d。本實驗中，應變幅度1%下成骨相關基因表達量并未明顯增加，因此未進行成骨特異性蛋白表達量的檢測。實驗結果顯示，雙軸拉伸應變可明顯上調rBMSCs成骨特異性標志物mRNA和蛋白的表達量，且2%，4 h/d組表達量最高。其中，應變幅度5%中加載時間6 h組rBMSCs中Runx2、ColⅠ、ALP、OCN的mRNA和蛋白表達量明顯低于4 h組，可能是由于力學加載幅度和持續時間超出細胞所能承受范圍，導致細胞處于較差的生長狀態或停止生長，少量細胞已經不再貼壁而凋亡；ColⅠ和Runx2蛋白表達量明顯高于E2組，而OCN的蛋白表達量卻明顯低于E2組，可能與ColⅠ的啟動子活性依賴于轉錄因子Runx2有關，故其蛋白表達量的變化與Runx2相保持一致，OCN屬于晚期表達蛋白，其表達量低于早期的ALP和Runx2的蛋白表達量，同時也說明，力學刺激可能更有利于成骨細胞的早期表達蛋白。因此本實驗得出結論：E2與體外雙軸拉伸應變均可以促進rBMSCs向成骨細胞分化，本實驗條件下比較好的力學刺激參數為頻率1 Hz、應變幅度2%、作用時間4 h/d、連續作用3 d。但雙軸拉伸應變促rBMSCs向成骨細胞分化的機制尚不清楚，因此還需進一步探討。
