本文利用殼寡糖（COS）的生物活性以及膠原（Col）的良好生物學性能，構建了不同聚合度的膠原/殼寡糖（Col/COSn）復合凝膠，以前成骨細胞MC3T3-E1s為例，從細胞的增殖以及相關成骨基因表達水平角度評價該復合凝膠對細胞的增殖以及分化效果的影響。結果表明，相對于純Col凝膠，所有的Col/COSn復合凝膠對前成骨細胞MC3T3-E1s的增殖、分化及成骨相關基因的表達都有不同程度的促進效果，不同聚合度的COS復合凝膠間促進效果有明顯差別，含有殼四糖（COS4）與殼六糖（COS6）的復合凝膠促進細胞增殖的效果優于其他組別，而含有殼五糖（COS5）的復合凝膠在促進細胞分化及成骨相關基因的表達上則明顯優于其他寡糖。
引用本文： 文建華, 李真真, 賈偉建, 丁珊, 周長忍. 膠原/殼寡糖復合凝膠對前成骨細胞MC3T3-E1s分化行為的影響. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(3): 493-498. doi: 10.7507/1001-5515.20160083 復制
引言
膠原(collagen,Col)主要存在于動物的皮、骨、牙齒、血管、韌帶和軟骨等組織器官中，是一種重要的結構功能蛋白。膠原具有較高的生物活性，因為含有大量的生物活性位點使得其能促進細胞的黏附、增殖[1-2]以及誘導成骨分化[3-4]，從而被廣泛應用于組織工程中。
殼寡糖(chit-oligosaccharide,COS)是一種分子量低、易溶于水的天然帶正電荷糖類，是殼聚糖通過化學或者酶降解而得的產物，具有比殼聚糖更高的生物活性，能直接作用于細胞，因此常用于抑制細菌生長、預防癌癥、降血壓、降血脂和提高免疫力等[5-6]。實驗證明COS還具有促進內皮神經細胞再生和提高組織修復的功能[7-9]，能夠促進骨折愈合過程中Col的合成和提高轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 的表達，并能提高骨強度、骨密度和鈣含量[10]。但是，作為水溶性的COS，難以獨自構建成有效的支架材料而用于組織工程，從而限制了其在組織工程材料上的應用；其次，不同聚合度的COS對于骨源細胞是否存在作用差異還有待探討。因此，在本文中，我們結合Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ,Col-Ⅰ)與COS各自的優點，構建系列Col/COSn復合凝膠，以鼠源前成骨細胞MC3T3-E1s為例，探討不同的Col/COSn復合凝膠對細胞的增殖及成骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
Col購自四川銘讓生物科技有限公司；COS購自大連中科格萊克生物科技有限公司；β-甘油磷酸二鈉(beta glycerin disodium phosphate,β-GP)購自廣州齊云生物有限公司；基礎培養基(minimum essential medium alpha basic,α-MEM)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購自上海英濰捷基公司；胰蛋白酶(0.25%，含EDTA)、青霉素鈉、鏈霉素、Cell Counting Kits-8 (CCK-8) 、Trizol、堿性磷酸酶(alkalinephos phatase,ALP)染色試劑盒、ALP測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Primix Ex Taq均購自Takara公司；BCA蛋白測定試劑盒購自凱基生物。 倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Multiskan Mk3酶聯免疫檢測儀(美國Thermo公司)；CLSM510 激光共聚焦熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；CFX96 實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。
1.2 膠原/殼寡糖復合凝膠的制備
冰浴條件下，10 mg/mL的Col溶液(溶于0.02 N乙酸)分別與1.0 wt%殼二糖(chitobiose,COS2) 、殼三糖(chitotriose,COS3) 、殼四糖(chitotetraose,COS4) 、殼五糖(chitopentaose,COS5) 、殼六糖(chitohexaose,COS6) 水溶液以體積比10∶1的比例混合。磁力攪拌條件下加入一定量預冷的β-GP溶液至混合體系為中性。取一定量的混合溶液于培養板中，置于37 ℃培養箱中30 min即可得到Col/COSn復合凝膠。各復合凝膠配比如表 1所示。
表1
不同膠原/殼寡糖復合凝膠復配表
Table1.
Different Col/COSn ratios in composite hydrogels
1.3 細胞MC3T3-E1的培養與種植
分別將不同成分的Col/COSn混合溶液置于24孔細胞培養板中，每孔加入0.5 mL混合溶液。將細胞培養板置于37 ℃、5% CO2培養箱中30 min，制備成不同的復合凝膠。
將細胞MC3T3-E1s(由暨南大學生物醫藥工程中心余守和博士贈予)調整密度為1×104 個/mL，吹勻，于每孔的凝膠表面加入1 mL細胞懸液。細胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的α-MEM培養液于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每隔3 d更換培養液。
1.4 細胞增殖測試
通過CCK-8法檢測細胞MC3T3-E1s在各Col/COS復合凝膠上的增殖情況。在24孔細胞培養板中，分別加入0.5 mL各混合溶液制備成凝膠，細胞接種密度為1×104 個/孔。分別于培養1、4、7 d后，吸出培養液，用無菌的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗3次后，加入1 mL CCK-8工作液，孵育3 h，在酶標儀上選擇450 nm波長處測定各孔的光密度(optical density,OD)值。
1.5 ALP活性檢測與染色
1.5.1 ALP活性檢測
MC3T3-E1s細胞按1×104 個/孔在各復合凝膠上培養1、4、7 d后，吸出培養液，用無菌的PBS溶液清洗3次。每孔加入200 μL 0.05%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) PBS溶液37 ℃裂解30 min，吹打并收集細胞裂解液，每孔取30 μL裂解液依照說明書步驟檢測ALP的活性，然后用酶標儀選擇波長為492 nm處測定各孔的OD值。同時使用BCA試劑盒測定細胞裂解液的蛋白質濃度，酶標儀的測定波長為570 nm，最后計算出每單位質量蛋白質中ALP的量。
1.5.2 ALP染色
MC3T3-E1s細胞在各復合凝膠上分別培養1、7 d后，棄去培養液，無菌的PBS溶液清洗3次，以4%多聚甲醛固定10 min后，按照ALP染色試劑盒的說明進行操作。染色后直接光鏡下觀察。
1.6 復合凝膠對細胞MC3T3-E1s中成骨相關基因表達的影響
調整MC3T3-E1s細胞的密度為1×104 個/孔，在各復合凝膠上培養1、4、7 d后，棄去培養液，用無菌的PBS溶液清洗3次。總RNA的提取及反轉錄的cDNA均按照相應的廠家生產試劑盒操作指引進行，得到工作液。對runt相關轉錄因子2(runt related transcription factors2,RUNX2) 、成骨特異性轉錄因子(osterix,OSX)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteipontin,OPN)、ALP、COL-Ⅰ等目的基因進行分析，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為管家基因。利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技術，95 ℃ DNA變性30 s，然后將反應混合物迅速降溫至60 ℃退火35 s，再于95 ℃熔融15 s，循環40次，對各目的基因進行擴增后檢測，每個樣品三個重復。PCR引物如表 2所示。采用相對定量法測定目的基因表達量，計算公式如下：對照組：ΔCt1=Ct目的-Ct內參；樣品組：ΔCt2=Ct目的-Ct內參；差值：ΔCt=ΔCt1-ΔCt2；樣品組基因相對表達量=2ΔCt。
表2
大鼠成骨相關基因引物序列
Table2.
Primer gene sequences used for qPCR
1.7 數據處理
數據用均值±標準差(x±s)表示，使用統計軟件SPSS 19.0采用t檢驗和方差分析對實驗所得數據進行處理比較，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果與討論
2.1 細胞的增殖情況
各Col/COSn復合凝膠對細胞MC3T3-E1s增殖情況的影響如圖 1所示。培養1天后，各樣品組之間沒有明顯的差異。隨著培養時間的延長，培養了4天后，盡管各樣品組上細胞數量都有增多，但是各組分間沒有顯著差異。而培養時間到了第7天后，細胞在所有含COS復合凝膠上的增殖都比純Col凝膠上高，其中Col/COS6的促進效果最好，比純Col高出近1倍，其次是Col/COS4復合凝膠，比純Col高出約50%；而Col/COS2、Col/COS3與Col/COS5組分間的促進效果差不多。結果顯示各復合凝膠中釋放出來的COS對細胞的增殖有一定的促進作用，但各COS促細胞增殖效果不同，其中以COS6的促進效果最為明顯。
圖1
CCK-8法測定MC3T3-E1s細胞在各組凝膠上的增殖情況
注：*
*
2.2 ALP活性檢測與染色
ALP是成骨細胞分化早期分泌的標志物，是細胞外基質成熟的標志，能促進骨基質的礦化。各Col/COSn復合凝膠對細胞MC3T3-E1s分泌ALP活性情況的影響如圖 2所示。由圖可知，隨著培養時間的延長，各樣品組分泌的ALP活性都有不同程度的增強。第1天，各樣品組分泌的ALP活性沒有明顯的差異。第4天，各樣品組分泌的ALP活性顯著增強而且出現了明顯的差異，細胞在含COS復合凝膠上分泌的ALP活性均高于純Col組。而各COS復合凝膠促進ALP分泌的效果以Col/COS5最為突出，其他組間沒有明顯差異。第7天，各樣品組分泌的ALP活性均繼續顯著增長，而促進ALP分泌的效果最好的依然是Col/COS5，Col/COS6次之，然后是Col/COS2。這說明COS不僅能促進細胞的增殖，更能促進其向成骨分化，促分化效果可能與COS的糖環數有關，以COS5效果最佳。
圖2
各復合凝膠上ALP活性檢測結果
注：*
*
細胞內的ALP通過染色后呈現灰黑色顆粒或塊狀條狀沉淀。MC3T3-E1s在各樣品組上培養1天和7天后的ALP染色如圖 3所示，結果顯示，MC3T3-E1s在各樣品組上的ALP染色均呈陽性反應，在培養7天后，MC3T3-E1s在Col/COS2，Col/COS5和Col/COS6出現大量棕黑色沉淀，并呈一定的有序性，而在純Col，Col/COS3和Col/COS4上棕黑色沉淀則相對較少，這與上述ALP活性測試結果相一致。
圖3
各復合凝膠上ALP染色情況(鈣鈷染色法,100×)
注：細胞內的ALP與染料發生反應呈現灰黑色顆粒或條狀沉淀
Figure3. ALP staining of MC3T3-E1 cells in all groups (Gomori method,100×)intracellular ALP has been dyed into gray and black particles or precipitations
2.3 RT-PCR檢測成骨相關基因表達
在MC3T3-E1s成骨分化過程中，細胞中成骨分化的標志性基因會隨著培養時間的延長而逐漸表達，為了研究Col/COSn復合凝膠對MC3T3-E1s成骨分化的影響，本文利用RT-PCR方法對成骨相關基因ALP、RUNX2、OSX、COL-Ⅰ、OCN和OPN的表達情況進行定量分析，以GAPDH為內參，采用相對定量分析法分析檢測結果，各相關基因表達結果如圖 4所示。從各相關基因表達結果可知：無論是在第4天還是在第7天，在含有COS的復合凝膠中各基因的表達量均高于純Col凝膠，且隨著時間的延長，各基因表達量均有較大增加，但不同的COS復合凝膠間有明顯的差異，其中以Col/COS5復合凝膠對各基因的表達促進效果最佳。無論是哪種基因表達量，Col/COS5復合凝膠相對于純Col凝膠均高出1~1.5倍,其次是Col/COS6復合凝膠，高出約1倍。
圖4
各相關成骨基因表達qRT-PCR檢測結果
注：*
*
各成骨相關基因表達量的提高說明含有COS的復合凝膠有助于促使細胞的成骨分化。ALP是前成骨細胞成骨分化早期的標志物。RUNX2是調控成骨細胞分化過程中重要的轉錄因子，能直接參與到調控OPN、Col-Ⅰ以及骨鈣素等細胞外基質蛋白的轉錄，是成骨細胞分化過程中關鍵的轉錄因子[11]。RUNX2的缺失會造成膜內和軟骨內骨化成骨均不能發生。OSX處于RUNX2的下游，也是成骨細胞分化途徑中重要的一種轉錄因子，屬于鋅指DNA結合蛋白，對骨組織的形成和再生起著重要的作用，其缺失會完全抑制成骨細胞分化。COL-Ⅰ是細胞外基質中最主要的有機組分，是骨礦化的場所。Col/COS復合凝膠對細胞COL-Ⅰ基因的表達有一定促進作用。而COL-Ⅰ基因是細胞在成骨分化過程中必不可缺的，它能夠促進ALP、OCN和OPN等成骨相關基因的表達，是成骨分化早期的標志物[12]。OCN是一種由成熟骨細胞分泌的非膠原蛋白，一般積聚在骨礦化峰期之后，對鈣有親和力，具有高度的特異性。一般認為在成骨分化晚期，OCN能夠促進鈣結節的形成，因此OCN被認為是骨形成過程中的生物學標志物[13]。OPN是一種基質功能性非膠原蛋白，經常與OCN一起作為細胞成骨分化的標志物。它能與骨組織中羥基磷灰石緊密結合，參與到骨鈣沉積的調節中，一般認為在細胞增殖和成骨分化后期都有表達的高峰。在細胞增殖時期，OPN能夠調節細胞的吸附，而在成骨分化后期，因為其能與骨組織中羥基磷灰石緊密結合，因此OCN在骨礦化過程起到重要的作用[14]。
文獻研究結果表明，COS膜已被應用于干細胞的生長以及分化的研究中[15]，骨髓干細胞在COS膜上生長良好，有一定程度的促增殖作用以及向成骨分化的趨勢。除此之外，COS對絕經后骨質疏松癥模型大鼠骨組織微觀結構的保護作用也有報道，COS能顯著增加骨強度、骨密度和鈣活性等[10]。這與本實驗研究中含有COS的復合凝膠更有利于細胞的增殖和分化的結果是一致的，至于為什么COS5的促進效果最明顯及其影響機制還有待于進一步的研究。
3 結論
本文采用濃度10 mg/mL的Col和1wt%的COS制備成復合凝膠。通過對前成骨細胞MC3T3-E1在各凝膠上的增殖速率、ALP活性以及成骨相關基因表達等的檢測，結果表明含有COS的復合凝膠相對于純Col凝膠更能促進細胞的增殖與分化，并能刺激細胞分泌表達成骨相關基因；特別是ALP活性、成骨相關基因表達量與COS的糖環數有關聯，其中以COS5的效果最為明顯。研究結果說明不同糖環數的COS影響細胞增殖分化的效果有差異，而這種差異的機制值得進一步的深入研究。
引言
膠原(collagen,Col)主要存在于動物的皮、骨、牙齒、血管、韌帶和軟骨等組織器官中，是一種重要的結構功能蛋白。膠原具有較高的生物活性，因為含有大量的生物活性位點使得其能促進細胞的黏附、增殖[1-2]以及誘導成骨分化[3-4]，從而被廣泛應用于組織工程中。
殼寡糖(chit-oligosaccharide,COS)是一種分子量低、易溶于水的天然帶正電荷糖類，是殼聚糖通過化學或者酶降解而得的產物，具有比殼聚糖更高的生物活性，能直接作用于細胞，因此常用于抑制細菌生長、預防癌癥、降血壓、降血脂和提高免疫力等[5-6]。實驗證明COS還具有促進內皮神經細胞再生和提高組織修復的功能[7-9]，能夠促進骨折愈合過程中Col的合成和提高轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1) 的表達，并能提高骨強度、骨密度和鈣含量[10]。但是，作為水溶性的COS，難以獨自構建成有效的支架材料而用于組織工程，從而限制了其在組織工程材料上的應用；其次，不同聚合度的COS對于骨源細胞是否存在作用差異還有待探討。因此，在本文中，我們結合Ⅰ型膠原(collagen type Ⅰ,Col-Ⅰ)與COS各自的優點，構建系列Col/COSn復合凝膠，以鼠源前成骨細胞MC3T3-E1s為例，探討不同的Col/COSn復合凝膠對細胞的增殖及成骨分化的影響。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與儀器
Col購自四川銘讓生物科技有限公司；COS購自大連中科格萊克生物科技有限公司；β-甘油磷酸二鈉(beta glycerin disodium phosphate,β-GP)購自廣州齊云生物有限公司；基礎培養基(minimum essential medium alpha basic,α-MEM)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購自上海英濰捷基公司；胰蛋白酶(0.25%，含EDTA)、青霉素鈉、鏈霉素、Cell Counting Kits-8 (CCK-8) 、Trizol、堿性磷酸酶(alkalinephos phatase,ALP)染色試劑盒、ALP測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Primix Ex Taq均購自Takara公司；BCA蛋白測定試劑盒購自凱基生物。 倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Multiskan Mk3酶聯免疫檢測儀(美國Thermo公司)；CLSM510 激光共聚焦熒光顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)；CFX96 實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)。
1.2 膠原/殼寡糖復合凝膠的制備
冰浴條件下，10 mg/mL的Col溶液(溶于0.02 N乙酸)分別與1.0 wt%殼二糖(chitobiose,COS2) 、殼三糖(chitotriose,COS3) 、殼四糖(chitotetraose,COS4) 、殼五糖(chitopentaose,COS5) 、殼六糖(chitohexaose,COS6) 水溶液以體積比10∶1的比例混合。磁力攪拌條件下加入一定量預冷的β-GP溶液至混合體系為中性。取一定量的混合溶液于培養板中，置于37 ℃培養箱中30 min即可得到Col/COSn復合凝膠。各復合凝膠配比如表 1所示。
表1
不同膠原/殼寡糖復合凝膠復配表
Table1.
Different Col/COSn ratios in composite hydrogels
1.3 細胞MC3T3-E1的培養與種植
分別將不同成分的Col/COSn混合溶液置于24孔細胞培養板中，每孔加入0.5 mL混合溶液。將細胞培養板置于37 ℃、5% CO2培養箱中30 min，制備成不同的復合凝膠。
將細胞MC3T3-E1s(由暨南大學生物醫藥工程中心余守和博士贈予)調整密度為1×104 個/mL，吹勻，于每孔的凝膠表面加入1 mL細胞懸液。細胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的α-MEM培養液于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每隔3 d更換培養液。
1.4 細胞增殖測試
通過CCK-8法檢測細胞MC3T3-E1s在各Col/COS復合凝膠上的增殖情況。在24孔細胞培養板中，分別加入0.5 mL各混合溶液制備成凝膠，細胞接種密度為1×104 個/孔。分別于培養1、4、7 d后，吸出培養液，用無菌的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗3次后，加入1 mL CCK-8工作液，孵育3 h，在酶標儀上選擇450 nm波長處測定各孔的光密度(optical density,OD)值。
1.5 ALP活性檢測與染色
1.5.1 ALP活性檢測
MC3T3-E1s細胞按1×104 個/孔在各復合凝膠上培養1、4、7 d后，吸出培養液，用無菌的PBS溶液清洗3次。每孔加入200 μL 0.05%的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) PBS溶液37 ℃裂解30 min，吹打并收集細胞裂解液，每孔取30 μL裂解液依照說明書步驟檢測ALP的活性，然后用酶標儀選擇波長為492 nm處測定各孔的OD值。同時使用BCA試劑盒測定細胞裂解液的蛋白質濃度，酶標儀的測定波長為570 nm，最后計算出每單位質量蛋白質中ALP的量。
1.5.2 ALP染色
MC3T3-E1s細胞在各復合凝膠上分別培養1、7 d后，棄去培養液，無菌的PBS溶液清洗3次，以4%多聚甲醛固定10 min后，按照ALP染色試劑盒的說明進行操作。染色后直接光鏡下觀察。
1.6 復合凝膠對細胞MC3T3-E1s中成骨相關基因表達的影響
調整MC3T3-E1s細胞的密度為1×104 個/孔，在各復合凝膠上培養1、4、7 d后，棄去培養液，用無菌的PBS溶液清洗3次。總RNA的提取及反轉錄的cDNA均按照相應的廠家生產試劑盒操作指引進行，得到工作液。對runt相關轉錄因子2(runt related transcription factors2,RUNX2) 、成骨特異性轉錄因子(osterix,OSX)、骨鈣素(osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(osteipontin,OPN)、ALP、COL-Ⅰ等目的基因進行分析，3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為管家基因。利用實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技術，95 ℃ DNA變性30 s，然后將反應混合物迅速降溫至60 ℃退火35 s，再于95 ℃熔融15 s，循環40次，對各目的基因進行擴增后檢測，每個樣品三個重復。PCR引物如表 2所示。采用相對定量法測定目的基因表達量，計算公式如下：對照組：ΔCt1=Ct目的-Ct內參；樣品組：ΔCt2=Ct目的-Ct內參；差值：ΔCt=ΔCt1-ΔCt2；樣品組基因相對表達量=2ΔCt。
表2
大鼠成骨相關基因引物序列
Table2.
Primer gene sequences used for qPCR
1.7 數據處理
數據用均值±標準差(x±s)表示，使用統計軟件SPSS 19.0采用t檢驗和方差分析對實驗所得數據進行處理比較，P＜0.05為差異有統計學意義。
2 結果與討論
2.1 細胞的增殖情況
各Col/COSn復合凝膠對細胞MC3T3-E1s增殖情況的影響如圖 1所示。培養1天后，各樣品組之間沒有明顯的差異。隨著培養時間的延長，培養了4天后，盡管各樣品組上細胞數量都有增多，但是各組分間沒有顯著差異。而培養時間到了第7天后，細胞在所有含COS復合凝膠上的增殖都比純Col凝膠上高，其中Col/COS6的促進效果最好，比純Col高出近1倍，其次是Col/COS4復合凝膠，比純Col高出約50%；而Col/COS2、Col/COS3與Col/COS5組分間的促進效果差不多。結果顯示各復合凝膠中釋放出來的COS對細胞的增殖有一定的促進作用，但各COS促細胞增殖效果不同，其中以COS6的促進效果最為明顯。
圖1
CCK-8法測定MC3T3-E1s細胞在各組凝膠上的增殖情況
注：*
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2.2 ALP活性檢測與染色
ALP是成骨細胞分化早期分泌的標志物，是細胞外基質成熟的標志，能促進骨基質的礦化。各Col/COSn復合凝膠對細胞MC3T3-E1s分泌ALP活性情況的影響如圖 2所示。由圖可知，隨著培養時間的延長，各樣品組分泌的ALP活性都有不同程度的增強。第1天，各樣品組分泌的ALP活性沒有明顯的差異。第4天，各樣品組分泌的ALP活性顯著增強而且出現了明顯的差異，細胞在含COS復合凝膠上分泌的ALP活性均高于純Col組。而各COS復合凝膠促進ALP分泌的效果以Col/COS5最為突出，其他組間沒有明顯差異。第7天，各樣品組分泌的ALP活性均繼續顯著增長，而促進ALP分泌的效果最好的依然是Col/COS5，Col/COS6次之，然后是Col/COS2。這說明COS不僅能促進細胞的增殖，更能促進其向成骨分化，促分化效果可能與COS的糖環數有關，以COS5效果最佳。
圖2
各復合凝膠上ALP活性檢測結果
注：*
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細胞內的ALP通過染色后呈現灰黑色顆粒或塊狀條狀沉淀。MC3T3-E1s在各樣品組上培養1天和7天后的ALP染色如圖 3所示，結果顯示，MC3T3-E1s在各樣品組上的ALP染色均呈陽性反應，在培養7天后，MC3T3-E1s在Col/COS2，Col/COS5和Col/COS6出現大量棕黑色沉淀，并呈一定的有序性，而在純Col，Col/COS3和Col/COS4上棕黑色沉淀則相對較少，這與上述ALP活性測試結果相一致。
圖3
各復合凝膠上ALP染色情況(鈣鈷染色法,100×)
注：細胞內的ALP與染料發生反應呈現灰黑色顆粒或條狀沉淀
Figure3. ALP staining of MC3T3-E1 cells in all groups (Gomori method,100×)intracellular ALP has been dyed into gray and black particles or precipitations
2.3 RT-PCR檢測成骨相關基因表達
在MC3T3-E1s成骨分化過程中，細胞中成骨分化的標志性基因會隨著培養時間的延長而逐漸表達，為了研究Col/COSn復合凝膠對MC3T3-E1s成骨分化的影響，本文利用RT-PCR方法對成骨相關基因ALP、RUNX2、OSX、COL-Ⅰ、OCN和OPN的表達情況進行定量分析，以GAPDH為內參，采用相對定量分析法分析檢測結果，各相關基因表達結果如圖 4所示。從各相關基因表達結果可知：無論是在第4天還是在第7天，在含有COS的復合凝膠中各基因的表達量均高于純Col凝膠，且隨著時間的延長，各基因表達量均有較大增加，但不同的COS復合凝膠間有明顯的差異，其中以Col/COS5復合凝膠對各基因的表達促進效果最佳。無論是哪種基因表達量，Col/COS5復合凝膠相對于純Col凝膠均高出1~1.5倍,其次是Col/COS6復合凝膠，高出約1倍。
圖4
各相關成骨基因表達qRT-PCR檢測結果
注：*
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各成骨相關基因表達量的提高說明含有COS的復合凝膠有助于促使細胞的成骨分化。ALP是前成骨細胞成骨分化早期的標志物。RUNX2是調控成骨細胞分化過程中重要的轉錄因子，能直接參與到調控OPN、Col-Ⅰ以及骨鈣素等細胞外基質蛋白的轉錄，是成骨細胞分化過程中關鍵的轉錄因子[11]。RUNX2的缺失會造成膜內和軟骨內骨化成骨均不能發生。OSX處于RUNX2的下游，也是成骨細胞分化途徑中重要的一種轉錄因子，屬于鋅指DNA結合蛋白，對骨組織的形成和再生起著重要的作用，其缺失會完全抑制成骨細胞分化。COL-Ⅰ是細胞外基質中最主要的有機組分，是骨礦化的場所。Col/COS復合凝膠對細胞COL-Ⅰ基因的表達有一定促進作用。而COL-Ⅰ基因是細胞在成骨分化過程中必不可缺的，它能夠促進ALP、OCN和OPN等成骨相關基因的表達，是成骨分化早期的標志物[12]。OCN是一種由成熟骨細胞分泌的非膠原蛋白，一般積聚在骨礦化峰期之后，對鈣有親和力，具有高度的特異性。一般認為在成骨分化晚期，OCN能夠促進鈣結節的形成，因此OCN被認為是骨形成過程中的生物學標志物[13]。OPN是一種基質功能性非膠原蛋白，經常與OCN一起作為細胞成骨分化的標志物。它能與骨組織中羥基磷灰石緊密結合，參與到骨鈣沉積的調節中，一般認為在細胞增殖和成骨分化后期都有表達的高峰。在細胞增殖時期，OPN能夠調節細胞的吸附，而在成骨分化后期，因為其能與骨組織中羥基磷灰石緊密結合，因此OCN在骨礦化過程起到重要的作用[14]。
文獻研究結果表明，COS膜已被應用于干細胞的生長以及分化的研究中[15]，骨髓干細胞在COS膜上生長良好，有一定程度的促增殖作用以及向成骨分化的趨勢。除此之外，COS對絕經后骨質疏松癥模型大鼠骨組織微觀結構的保護作用也有報道，COS能顯著增加骨強度、骨密度和鈣活性等[10]。這與本實驗研究中含有COS的復合凝膠更有利于細胞的增殖和分化的結果是一致的，至于為什么COS5的促進效果最明顯及其影響機制還有待于進一步的研究。
3 結論
本文采用濃度10 mg/mL的Col和1wt%的COS制備成復合凝膠。通過對前成骨細胞MC3T3-E1在各凝膠上的增殖速率、ALP活性以及成骨相關基因表達等的檢測，結果表明含有COS的復合凝膠相對于純Col凝膠更能促進細胞的增殖與分化，并能刺激細胞分泌表達成骨相關基因；特別是ALP活性、成骨相關基因表達量與COS的糖環數有關聯，其中以COS5的效果最為明顯。研究結果說明不同糖環數的COS影響細胞增殖分化的效果有差異，而這種差異的機制值得進一步的深入研究。
