本研究旨在探索鈣網蛋白（CRT）在壓力超負荷心肌肥厚大鼠模型和體外誘導的肥大心肌細胞中的表達變化及其可能的機制。通過腹主動脈縮窄術（TAC）構建壓力超負荷的心肌肥厚大鼠模型，用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）及Western blot檢測CRT、肥大標志基因心房鈉尿肽（ANP）、腦鈉肽（BNP）及內質網應激（ERS）標志物葡萄糖調節蛋白78（GRP78）、活化轉錄因子6（ATF6）、C/EBP同源蛋白（CHOP）的表達變化。同時，應用ERS抑制劑阿托伐他汀（ATO）以及CRT小干擾核糖核酸（CRT-siRNA）分別抑制ERS和CRT的表達，來觀察CRT在心肌肥厚中的作用。結果表明，SD大鼠行TAC術4周后即發生心肌肥厚，心肌組織中CRT、肥大標志基因及ERS標志物表達水平明顯增加。給予TAC大鼠ATO口服干預4周，大鼠心臟結構及功能明顯改善，心肌肥厚程度減輕，CRT及ERS相關指標表達受到抑制。而體外用去甲腎上腺素（NE）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）或異丙腎上腺素（ISO）處理乳鼠原代心肌細胞（NCMs）后，均能誘導心肌細胞發生肥大，同時促發ERS，CRT表達亦增加。心肌細胞肥大時，沉默NCMs中CRT基因后，其肥大程度明顯緩解，提示CRT可能是治療心肌肥厚的潛在靶點。
引用本文： 吳思媛, 陸立慧, 趙明月, 吳文超, 付華, 劉小菁. 鈣網蛋白在壓力超負荷心肌肥厚中的作用研究. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(3): 512-519. doi: 10.7507/1001-5515.20160086 復制
引言
心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是多種心血管疾病如高血壓、心肌梗死等，發生發展過程中共有的病理特征[1]。壓力超負荷、心肌損傷及炎癥等因素可通過一些分子和細胞機制引起心肌肥厚[2]。此外，一些神經體液因素，如血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、β型轉化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)等也參與調節心肌肥厚過程。
研究表明，多條信號通路介導了心肌肥厚發生的病理過程，其中內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)也參與調控壓力超負荷導致的心肌肥厚[3]。鈣網蛋白(calreticulin,CRT)是內質網(endoplasmic reticulum,ER)上主要的鈣結合蛋白之一，具有調節鈣離子平衡、輔助蛋白質折疊加工等生物學功能。CRT在心臟發育過程中具有重要作用[4]，但它在心肌肥厚中的作用如何尚未完全明確，其與ERS的關系，報道亦較少。
為此，我們利用腹主動脈縮窄術(transverse aortic constriction,TAC)建立壓力超負荷所致的心肌肥厚大鼠模型；另一方面，在體外刺激乳鼠原代心肌細胞(neonatal rat cardiomyocytes,NCMs)誘導其發生肥大，檢測CRT的表達變化。同時，應用ERS抑制劑阿托伐他汀(atorvastatin,ATO)以及CRT小干擾核糖核酸(CRT-small interference ribonucleic acid,CRT-siRNA)分別抑制ERS和CRT的表達，然后觀察CRT在心肌細胞肥大中的作用，為拓寬對心肌肥厚的認識及進一步的臨床防治提供實驗依據。
1 材料和試劑
1.1 主要試劑
改良Eagle(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco,DMEM)高糖培養基、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、小牛血清(newborn bovine serum,NBS)購自Gibco公司，Trizol、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)引物、轉染試劑脂質體Lipofectamine? 3000購自Invitrogen公司，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)由Hyclone公司提供，逆轉錄試劑盒(Rever Tra Ace組合型)購自TOYOBO公司，蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)購自碧云天公司，定量PCR試劑盒SYBR? Green PCR Master Mix由BIO-RAD公司提供，增強化學發光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，兔抗CRT、兔抗葡萄糖調節蛋白78(glucose- regulated protein,GRP78) 、鼠抗C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)抗體購自CST公司，鼠抗活化轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6) 抗體由Abcam公司提供，小鼠抗β-actin抗體購自Santa-Cruz公司，山羊抗小鼠、兔IgG購自北京中杉金橋公司，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)由Roche公司提供。其余試劑均為市售分析純產品。NE、AngⅡ及異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)均購自Sigma公司，ATO購自輝瑞公司。
1.2 實驗動物
本實驗所用動物：健康成年雄性200~250 g Sprague-Dawley (SD)大鼠及出生1~3 d的SD乳鼠均購自四川省達碩實驗動物中心，本實驗經四川大學華西醫院動物倫理委員會批準通過。
2 實驗方法
2.1 動物模型構建及鑒定
健康雄性SD大鼠30只，隨機分成3組：假手術組(Sham組)10只、TAC組10只和TAC+ATO組10只。TAC組手術的主要步驟如下：大鼠術前禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，沿腹中線切開皮膚，暴露腹腔，分離腎動脈及其上方的腹主動脈，將8號針頭平行放在腹主動脈旁，在距左腎動脈分支約0.5 cm處將二者結扎，隨后輕輕抽出針頭，使腹主動脈內徑縮窄，分層關閉腹腔。Sham組大鼠暴露腹腔后，僅做分離動脈不結扎。每日觀察大鼠生命體征，正常喂養4周。TAC+ATO組大鼠在術后第三天起給藥，將ATO搗碎溶于水中，其使用劑量為10 mg/(kg·d)，連續治療4周。超聲心動圖、血壓及左心室肥厚指數的測定均按我們以前報道的方法進行，參見文獻[5]。
2.2 NCMs的分離及處理
將出生1~3 d的SD乳鼠用75%酒精消毒、處死后，取左心室。用緩沖液PBS漂洗后，剪碎至1 mm3，用37 ℃預熱的0.05%胰蛋白酶+0.05%Ⅱ型膠原酶，于37 ℃消化心肌組織，每次約5 min，消化至心肌組織肉眼不可見。加入終止液(DMEM高糖培養基+10%NBS)終止消化。混合液用篩網(200目)過濾去除組織殘渣后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入完全培養基(DMEM高糖培養基+10% FBS)重懸細胞，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。差速貼壁1 h后將培養瓶中的上清液移入6或12孔板中，24 h換液后繼續培養[6]。用α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actinin,α-SA)抗體鑒定NCMs的純度。48 h后，采用10-5 mol/L的NE處理NCMs 24 h、10-5 mol/L的Ang Ⅱ或2×10-5 mol/L的ISO處理NCMs 48 h來誘導其發生肥大。或者用ERS抑制劑ATO(10-5 mol/L)預處理NCMs 2 h后，再加10-5 mol/L NE刺激作為干預組(標記為NE+ATO組)。或者48 h后，用siRNA轉染NCMs 24 h后再用10-5 mol/L的Ang Ⅱ(標記為scramble siRNA+Ang Ⅱ組、CRT-siRNA+Ang Ⅱ組)或2×10-5 mol/L的ISO(標記為scramble siRNA+ISO組、CRT-siRNA+ISO組)刺激48 h。
2.3 CRT特異性siRNA轉染
使用脂質體Lipofectamine? 3000瞬時轉染NCMs，具體按說明書操作。100 nmol無功能陰性對照scramble siRNA或CRT-siRNA轉染NCMs 24h后加AngⅡ或ISO處理。實驗中所用的siRNA序列如下：scramble siRNA: 5＇-GUG CGUUGCUAGUACCAAC dTdT-3＇，CRT-siRNA: 5＇-UAU CUAUGCCUAUGAUAGU dTdT-3＇。siRNA在銳博公司(中國廣州)設計合成。
2.4 RT-qPCR檢測基因表達變化
使用Trizol試劑提取細胞總RNA，將1.5 μg總RNA逆轉錄后采用SYBR? Green PCR Master Mix在qPCR儀(CFX96TM,BIO-RAD)上對CRT，肥大標志基因心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)以及ERS標志物GRP78、ATF6、CHOP的mRNA變化進行熒光定量檢測。檢測基因的引物序列如表 1所示，β-actin作為內參對目的基因的表達進行校正。
表1
RT-qPCR所用的引物序列
Table1.
Primer Sequences for real time-quantitative PCR
2.5 Western blot檢測
RIPA裂解組織或細胞獲取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度后，取25 μg總蛋白上樣，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉至PVDF膜，封閉后，4 ℃孵育一抗(CRT,1∶1000；GRP78,1∶500；ATF6,1∶1000；CHOP,1∶1000；β-actin,1:2000) 過夜，TBST洗滌后用相應二抗室溫孵育2 h，ECL顯影。β-actin作為內參，采用Quantity one 4.6.1軟件對條帶進行灰度分析。
2.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計分析軟件處理實驗數據，實驗結果以均數±標準差(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統計學意義。
3 結果
3.1 TAC誘導心肌肥厚動物模型的制備
3.1.1 大鼠頸總動脈血壓變化
TAC手術是構建壓力超負荷導致心肌肥厚的一種常見方法[7]。結果表明，大鼠頸總動脈收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)及平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)，TAC組大鼠比Sham組明顯升高，而TAC+ATO組比TAC組血壓降低，差異具有統計學意義 (P＜0.05) ，如表 2所示。
表2
TAC手術后大鼠血壓值
Table2.
Blood pressure in TAC rats
3.1.2 超聲心動圖指標的變化
如圖 1所示，超聲心動圖結果顯示：TAC組比Sham組左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)降低，說明TAC術后4周大鼠心功能明顯受損。而左室肥厚指數(left ventricular hypertrophy index,LVHI)即左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)和室間隔厚度(interventricular septal thickness,IVST)顯著升高，在兩組間的差異均具有統計學意義，反映出心肌肥厚程度明顯增加；TAC+ATO組和TAC組比，除LVEF未有明顯改善外，LVPWT、IVST明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05) 。
圖1
TAC手術后4周大鼠心室超聲心動圖結果(n=10)
*
3.1.3 左室質量指數及心肌肥厚標志物的變化
如圖 2所示，與Sham組相比，TAC組的左室質量指數(left ventricular mass index,LVMI)指標升高，而TAC+ATO組比TAC組降低，兩兩間差異具有統計學意義。此外，TAC組心肌組織中肥大標志基因ANP及BNP均明顯上調，而ATO治療后，ANP及BNP基因表達顯著降低，差異具有統計學意義(P＜0.05) 。
圖2
左室質量指數及心肌肥厚標志物的表達變化(n=10)
*
綜上所述，多項檢測結果提示：TAC術后大鼠心肌組織發生明顯損害，壓力超負荷導致的心肌肥厚實驗動物模型構建成功。
3.2 TAC模型中CRT及ERS標志物的表達變化
3.2.1 CRT在大鼠心肌組織中的表達變化
與Sham組相比，TAC組中CRT基因和蛋白表達水平升高，而TAC+ATO組中CRT的基因和蛋白表達水平降低，差異具有統計學意義(P＜0.05) 。結果提示，CRT可能在壓力超負荷心肌肥厚中起重要作用，如圖 3所示。
圖3
心肌肥厚大鼠心肌組織中CRT基因和蛋白的表達變化(n=10)
*
3.2.2 ERS標志物在大鼠心肌組織中的表達變化
如圖 4所示，與Sham組相比，TAC組大鼠心肌組織中ERS的標志物GRP78、ATF6、CHOP的基因及蛋白表達水平上調，差異有統計學意義。提示ERS通路參與了TAC誘導的壓力超負荷心肌肥厚過程。ATO是ERS的抑制劑，因而其干預后，即TAC+ATO組比TAC組的ERS標志物表達下調，差異有統計學意義(P＜0.05) ，從而進一步驗證ERS參與了壓力超負荷心肌肥厚的過程。
圖4
TAC手術后ERS相關基因和蛋白表達變化(n=10)
*
3.3 CRT及ERS標志物在肥大心肌細胞中的表達變化
3.3.1 CRT及ERS標志物在NE/AngⅡ/ISO誘導的肥大NCMs細胞中表達上調
如圖 5所示，與未加刺激的對照組(即Control組)相比，NE、AngⅡ及ISO均可誘導NCMs中肥大基因ANP及BNP表達明顯升高，同時CRT及ERS指標的表達也明顯增加，差異具有統計學意義(P＜0.05) 。提示在心肌細胞肥大的同時，CRT的表達也明顯上調，并促發ERS。
圖5
原代心肌細胞中肥大基因、CRT及ERS基因及蛋白水平的變化(n=4)
*
3.3.2 抑制ERS對心肌細胞肥大及CRT表達的影響
與Control組相比，NE組的ERS標志基因表達明顯呈現上調；而與NE組相比，NE+ATO干預組的ERS相關基因呈現顯著下調，差異具有統計學意義(P＜0.05) 。提示ERS抑制劑ATO可明顯抑制NE刺激所促發的ERS水平。
同時，與NE組相比較，NE+ATO干預組當中的心肌肥大標志基因(ANP、BNP)及CRT的表達呈現明顯下調，提示阻斷ERS后，CRT及肥大基因的表達受到了抑制，其差異具有統計學意義(P＜0.05) ，如圖 6所示。
圖6
ATO干預降低NE刺激誘導的NCMs中肥大及CRT基因的表達(n=4)
*
3.4 沉默CRT基因緩解心肌細胞肥大程度
為觀察抑制CRT后對心肌細胞肥大的影響，本文用特異性CRT-siRNA轉染NCMs細胞。如圖 7所示，與scramble siRNA組相比，CRT-siRNA組的心肌細胞中肥大基因表達下降，差異有統計學意義(P＜0.05) ，而ERS指標無明顯變化。結果提示，沉默CRT基因能明顯緩解心肌細胞的肥大程度；且CRT可能位于ERS通路的下游。
圖7
沉默CRT基因緩解心肌細胞的肥大程度(n=4)
*
4 討論
心肌肥厚不僅是心臟對各種刺激的代償反應，而且是許多心血管疾病發病及死亡的獨立危險因素之一[8]。其發生機制復雜，與心肌肥厚相關的信號通路包括Ca2+及其依賴的Ca2+-CaN-NFAT通路[9]、Ras通路(包括Ras-PI3K-Akt-mTOR通路及Ras-Raf-MEK1-ERK1/2通路)[7]、PKC通路[10]等。研究顯示，ERS也介導了心肌細胞肥大、凋亡的過程[11]。而CRT作為ER的定位蛋白，具有作為分子伴侶、調節Ca2+穩態等重要作用，與ERS的發生密切相關。
因此，本研究應用TAC構建壓力超負荷誘導的心肌肥厚動物模型；而另一方面又在體外采用多種因素誘導NCMs發生肥大表型，檢測CRT、心肌肥大及ERS標志物基因表達變化。結果觀察到，在心肌肥厚大鼠心肌組織及體外肥大的NCMs中，ERS指標均明顯升高，同時CRT表達亦上調。進一步，我們用ERS抑制劑ATO以及CRT-siRNA分別抑制ERS和CRT的表達，觀察到ATO治療后，TAC大鼠心肌組織肥厚程度明顯減輕，且CRT表達降低。在體外誘導肥大的NCMs中，通過RNA干擾技術沉默CRT基因表達后，也能緩解心肌細胞的肥大程度，但ERS指標無明顯變化。
文獻報道，心肌缺血后期，CRT持續高表達會加重梗死后心肌肥大引起的心功能損傷[12]。Lee等[13]人發現，在成年鼠心臟中過表達CRT可以導致擴張性心肌病。CRT可激活鈣調磷酸酶(calcineurin，CaN)，而CaN通過一系列信號途徑引起心肌病理性肥大[4]。但是，單虎等[14]的研究表明，CRT表達的上調參與了心肌細胞肥大的發病過程，并可能在心肌肥大向失代償轉變的過程中發揮一定保護作用。此外，有研究表明，過表達外源性CRT，可通過降低ERS程度對心肌細胞發揮保護作用[15]。而近期的文獻報道，CRT是miR-455的靶基因之一，miR-455可以對CRT進行負調控。在小鼠心肌肥厚初期(TAC術后2周)，給予miR-455(即降低CRT表達)會加重心肌肥厚程度，但在心肌肥厚后期(TAC術后4周)，給予miR-455則可明顯抑制心肌纖維化及細胞凋亡，減輕心肌重塑水平[1]。綜上所述，CRT在心肌肥厚中的作用究竟如何目前存在爭議，這可能與心肌肥厚及受損的程度、階段等有關，我們推測在心肌細胞損傷早期，CRT表達上調是保護性作用，而在損傷后期，CRT高表達則可能變為不利因素。
本研究觀察到在各種刺激因素引起心肌肥大過程中，ERS可能通過調控CRT的表達介導心肌細胞肥大，而沉默CRT的表達則可緩解心肌細胞肥大程度。因此，CRT可能是治療心肌肥厚后期(心肌纖維化)、心肌細胞凋亡的潛在靶點。
引言
心肌肥厚(myocardial hypertrophy)是多種心血管疾病如高血壓、心肌梗死等，發生發展過程中共有的病理特征[1]。壓力超負荷、心肌損傷及炎癥等因素可通過一些分子和細胞機制引起心肌肥厚[2]。此外，一些神經體液因素，如血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)、β型轉化生長因子(transforming growth factor-β,TGF-β)、去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)等也參與調節心肌肥厚過程。
研究表明，多條信號通路介導了心肌肥厚發生的病理過程，其中內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)也參與調控壓力超負荷導致的心肌肥厚[3]。鈣網蛋白(calreticulin,CRT)是內質網(endoplasmic reticulum,ER)上主要的鈣結合蛋白之一，具有調節鈣離子平衡、輔助蛋白質折疊加工等生物學功能。CRT在心臟發育過程中具有重要作用[4]，但它在心肌肥厚中的作用如何尚未完全明確，其與ERS的關系，報道亦較少。
為此，我們利用腹主動脈縮窄術(transverse aortic constriction,TAC)建立壓力超負荷所致的心肌肥厚大鼠模型；另一方面，在體外刺激乳鼠原代心肌細胞(neonatal rat cardiomyocytes,NCMs)誘導其發生肥大，檢測CRT的表達變化。同時，應用ERS抑制劑阿托伐他汀(atorvastatin,ATO)以及CRT小干擾核糖核酸(CRT-small interference ribonucleic acid,CRT-siRNA)分別抑制ERS和CRT的表達，然后觀察CRT在心肌細胞肥大中的作用，為拓寬對心肌肥厚的認識及進一步的臨床防治提供實驗依據。
1 材料和試劑
1.1 主要試劑
改良Eagle(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco,DMEM)高糖培養基、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、小牛血清(newborn bovine serum,NBS)購自Gibco公司，Trizol、實時熒光定量聚合酶鏈式反應(real time-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)引物、轉染試劑脂質體Lipofectamine? 3000購自Invitrogen公司，胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)由Hyclone公司提供，逆轉錄試劑盒(Rever Tra Ace組合型)購自TOYOBO公司，蛋白裂解液(radio immunoprecipitation assay,RIPA)購自碧云天公司，定量PCR試劑盒SYBR? Green PCR Master Mix由BIO-RAD公司提供，增強化學發光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，兔抗CRT、兔抗葡萄糖調節蛋白78(glucose- regulated protein,GRP78) 、鼠抗C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)抗體購自CST公司，鼠抗活化轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6) 抗體由Abcam公司提供，小鼠抗β-actin抗體購自Santa-Cruz公司，山羊抗小鼠、兔IgG購自北京中杉金橋公司，聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)由Roche公司提供。其余試劑均為市售分析純產品。NE、AngⅡ及異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)均購自Sigma公司，ATO購自輝瑞公司。
1.2 實驗動物
本實驗所用動物：健康成年雄性200~250 g Sprague-Dawley (SD)大鼠及出生1~3 d的SD乳鼠均購自四川省達碩實驗動物中心，本實驗經四川大學華西醫院動物倫理委員會批準通過。
2 實驗方法
2.1 動物模型構建及鑒定
健康雄性SD大鼠30只，隨機分成3組：假手術組(Sham組)10只、TAC組10只和TAC+ATO組10只。TAC組手術的主要步驟如下：大鼠術前禁食12 h，自由飲水。10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，沿腹中線切開皮膚，暴露腹腔，分離腎動脈及其上方的腹主動脈，將8號針頭平行放在腹主動脈旁，在距左腎動脈分支約0.5 cm處將二者結扎，隨后輕輕抽出針頭，使腹主動脈內徑縮窄，分層關閉腹腔。Sham組大鼠暴露腹腔后，僅做分離動脈不結扎。每日觀察大鼠生命體征，正常喂養4周。TAC+ATO組大鼠在術后第三天起給藥，將ATO搗碎溶于水中，其使用劑量為10 mg/(kg·d)，連續治療4周。超聲心動圖、血壓及左心室肥厚指數的測定均按我們以前報道的方法進行，參見文獻[5]。
2.2 NCMs的分離及處理
將出生1~3 d的SD乳鼠用75%酒精消毒、處死后，取左心室。用緩沖液PBS漂洗后，剪碎至1 mm3，用37 ℃預熱的0.05%胰蛋白酶+0.05%Ⅱ型膠原酶，于37 ℃消化心肌組織，每次約5 min，消化至心肌組織肉眼不可見。加入終止液(DMEM高糖培養基+10%NBS)終止消化。混合液用篩網(200目)過濾去除組織殘渣后，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入完全培養基(DMEM高糖培養基+10% FBS)重懸細胞，置于37 ℃、5% CO2孵箱中培養。差速貼壁1 h后將培養瓶中的上清液移入6或12孔板中，24 h換液后繼續培養[6]。用α-橫紋肌肌動蛋白(α-sarcomeric actinin,α-SA)抗體鑒定NCMs的純度。48 h后，采用10-5 mol/L的NE處理NCMs 24 h、10-5 mol/L的Ang Ⅱ或2×10-5 mol/L的ISO處理NCMs 48 h來誘導其發生肥大。或者用ERS抑制劑ATO(10-5 mol/L)預處理NCMs 2 h后，再加10-5 mol/L NE刺激作為干預組(標記為NE+ATO組)。或者48 h后，用siRNA轉染NCMs 24 h后再用10-5 mol/L的Ang Ⅱ(標記為scramble siRNA+Ang Ⅱ組、CRT-siRNA+Ang Ⅱ組)或2×10-5 mol/L的ISO(標記為scramble siRNA+ISO組、CRT-siRNA+ISO組)刺激48 h。
2.3 CRT特異性siRNA轉染
使用脂質體Lipofectamine? 3000瞬時轉染NCMs，具體按說明書操作。100 nmol無功能陰性對照scramble siRNA或CRT-siRNA轉染NCMs 24h后加AngⅡ或ISO處理。實驗中所用的siRNA序列如下：scramble siRNA: 5＇-GUG CGUUGCUAGUACCAAC dTdT-3＇，CRT-siRNA: 5＇-UAU CUAUGCCUAUGAUAGU dTdT-3＇。siRNA在銳博公司(中國廣州)設計合成。
2.4 RT-qPCR檢測基因表達變化
使用Trizol試劑提取細胞總RNA，將1.5 μg總RNA逆轉錄后采用SYBR? Green PCR Master Mix在qPCR儀(CFX96TM,BIO-RAD)上對CRT，肥大標志基因心房鈉尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、腦鈉肽(brain natriuretic peptide, BNP)以及ERS標志物GRP78、ATF6、CHOP的mRNA變化進行熒光定量檢測。檢測基因的引物序列如表 1所示，β-actin作為內參對目的基因的表達進行校正。
表1
RT-qPCR所用的引物序列
Table1.
Primer Sequences for real time-quantitative PCR
2.5 Western blot檢測
RIPA裂解組織或細胞獲取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度后，取25 μg總蛋白上樣，變性聚丙烯酰胺凝膠電泳后，將蛋白轉至PVDF膜，封閉后，4 ℃孵育一抗(CRT,1∶1000；GRP78,1∶500；ATF6,1∶1000；CHOP,1∶1000；β-actin,1:2000) 過夜，TBST洗滌后用相應二抗室溫孵育2 h，ECL顯影。β-actin作為內參，采用Quantity one 4.6.1軟件對條帶進行灰度分析。
2.6 統計學方法
采用SPSS17.0統計分析軟件處理實驗數據，實驗結果以均數±標準差(x±s)表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，以P＜0.05為差異有統計學意義。
3 結果
3.1 TAC誘導心肌肥厚動物模型的制備
3.1.1 大鼠頸總動脈血壓變化
TAC手術是構建壓力超負荷導致心肌肥厚的一種常見方法[7]。結果表明，大鼠頸總動脈收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)及平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)，TAC組大鼠比Sham組明顯升高，而TAC+ATO組比TAC組血壓降低，差異具有統計學意義 (P＜0.05) ，如表 2所示。
表2
TAC手術后大鼠血壓值
Table2.
Blood pressure in TAC rats
3.1.2 超聲心動圖指標的變化
如圖 1所示，超聲心動圖結果顯示：TAC組比Sham組左室射血分數(left ventricular ejection fraction,LVEF)降低，說明TAC術后4周大鼠心功能明顯受損。而左室肥厚指數(left ventricular hypertrophy index,LVHI)即左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPWT)和室間隔厚度(interventricular septal thickness,IVST)顯著升高，在兩組間的差異均具有統計學意義，反映出心肌肥厚程度明顯增加；TAC+ATO組和TAC組比，除LVEF未有明顯改善外，LVPWT、IVST明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05) 。
圖1
TAC手術后4周大鼠心室超聲心動圖結果(n=10)
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3.1.3 左室質量指數及心肌肥厚標志物的變化
如圖 2所示，與Sham組相比，TAC組的左室質量指數(left ventricular mass index,LVMI)指標升高，而TAC+ATO組比TAC組降低，兩兩間差異具有統計學意義。此外，TAC組心肌組織中肥大標志基因ANP及BNP均明顯上調，而ATO治療后，ANP及BNP基因表達顯著降低，差異具有統計學意義(P＜0.05) 。
圖2
左室質量指數及心肌肥厚標志物的表達變化(n=10)
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綜上所述，多項檢測結果提示：TAC術后大鼠心肌組織發生明顯損害，壓力超負荷導致的心肌肥厚實驗動物模型構建成功。
3.2 TAC模型中CRT及ERS標志物的表達變化
3.2.1 CRT在大鼠心肌組織中的表達變化
與Sham組相比，TAC組中CRT基因和蛋白表達水平升高，而TAC+ATO組中CRT的基因和蛋白表達水平降低，差異具有統計學意義(P＜0.05) 。結果提示，CRT可能在壓力超負荷心肌肥厚中起重要作用，如圖 3所示。
圖3
心肌肥厚大鼠心肌組織中CRT基因和蛋白的表達變化(n=10)
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3.2.2 ERS標志物在大鼠心肌組織中的表達變化
如圖 4所示，與Sham組相比，TAC組大鼠心肌組織中ERS的標志物GRP78、ATF6、CHOP的基因及蛋白表達水平上調，差異有統計學意義。提示ERS通路參與了TAC誘導的壓力超負荷心肌肥厚過程。ATO是ERS的抑制劑，因而其干預后，即TAC+ATO組比TAC組的ERS標志物表達下調，差異有統計學意義(P＜0.05) ，從而進一步驗證ERS參與了壓力超負荷心肌肥厚的過程。
圖4
TAC手術后ERS相關基因和蛋白表達變化(n=10)
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3.3 CRT及ERS標志物在肥大心肌細胞中的表達變化
3.3.1 CRT及ERS標志物在NE/AngⅡ/ISO誘導的肥大NCMs細胞中表達上調
如圖 5所示，與未加刺激的對照組(即Control組)相比，NE、AngⅡ及ISO均可誘導NCMs中肥大基因ANP及BNP表達明顯升高，同時CRT及ERS指標的表達也明顯增加，差異具有統計學意義(P＜0.05) 。提示在心肌細胞肥大的同時，CRT的表達也明顯上調，并促發ERS。
圖5
原代心肌細胞中肥大基因、CRT及ERS基因及蛋白水平的變化(n=4)
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3.3.2 抑制ERS對心肌細胞肥大及CRT表達的影響
與Control組相比，NE組的ERS標志基因表達明顯呈現上調；而與NE組相比，NE+ATO干預組的ERS相關基因呈現顯著下調，差異具有統計學意義(P＜0.05) 。提示ERS抑制劑ATO可明顯抑制NE刺激所促發的ERS水平。
同時，與NE組相比較，NE+ATO干預組當中的心肌肥大標志基因(ANP、BNP)及CRT的表達呈現明顯下調，提示阻斷ERS后，CRT及肥大基因的表達受到了抑制，其差異具有統計學意義(P＜0.05) ，如圖 6所示。
圖6
ATO干預降低NE刺激誘導的NCMs中肥大及CRT基因的表達(n=4)
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3.4 沉默CRT基因緩解心肌細胞肥大程度
為觀察抑制CRT后對心肌細胞肥大的影響，本文用特異性CRT-siRNA轉染NCMs細胞。如圖 7所示，與scramble siRNA組相比，CRT-siRNA組的心肌細胞中肥大基因表達下降，差異有統計學意義(P＜0.05) ，而ERS指標無明顯變化。結果提示，沉默CRT基因能明顯緩解心肌細胞的肥大程度；且CRT可能位于ERS通路的下游。
圖7
沉默CRT基因緩解心肌細胞的肥大程度(n=4)
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4 討論
心肌肥厚不僅是心臟對各種刺激的代償反應，而且是許多心血管疾病發病及死亡的獨立危險因素之一[8]。其發生機制復雜，與心肌肥厚相關的信號通路包括Ca2+及其依賴的Ca2+-CaN-NFAT通路[9]、Ras通路(包括Ras-PI3K-Akt-mTOR通路及Ras-Raf-MEK1-ERK1/2通路)[7]、PKC通路[10]等。研究顯示，ERS也介導了心肌細胞肥大、凋亡的過程[11]。而CRT作為ER的定位蛋白，具有作為分子伴侶、調節Ca2+穩態等重要作用，與ERS的發生密切相關。
因此，本研究應用TAC構建壓力超負荷誘導的心肌肥厚動物模型；而另一方面又在體外采用多種因素誘導NCMs發生肥大表型，檢測CRT、心肌肥大及ERS標志物基因表達變化。結果觀察到，在心肌肥厚大鼠心肌組織及體外肥大的NCMs中，ERS指標均明顯升高，同時CRT表達亦上調。進一步，我們用ERS抑制劑ATO以及CRT-siRNA分別抑制ERS和CRT的表達，觀察到ATO治療后，TAC大鼠心肌組織肥厚程度明顯減輕，且CRT表達降低。在體外誘導肥大的NCMs中，通過RNA干擾技術沉默CRT基因表達后，也能緩解心肌細胞的肥大程度，但ERS指標無明顯變化。
文獻報道，心肌缺血后期，CRT持續高表達會加重梗死后心肌肥大引起的心功能損傷[12]。Lee等[13]人發現，在成年鼠心臟中過表達CRT可以導致擴張性心肌病。CRT可激活鈣調磷酸酶(calcineurin，CaN)，而CaN通過一系列信號途徑引起心肌病理性肥大[4]。但是，單虎等[14]的研究表明，CRT表達的上調參與了心肌細胞肥大的發病過程，并可能在心肌肥大向失代償轉變的過程中發揮一定保護作用。此外，有研究表明，過表達外源性CRT，可通過降低ERS程度對心肌細胞發揮保護作用[15]。而近期的文獻報道，CRT是miR-455的靶基因之一，miR-455可以對CRT進行負調控。在小鼠心肌肥厚初期(TAC術后2周)，給予miR-455(即降低CRT表達)會加重心肌肥厚程度，但在心肌肥厚后期(TAC術后4周)，給予miR-455則可明顯抑制心肌纖維化及細胞凋亡，減輕心肌重塑水平[1]。綜上所述，CRT在心肌肥厚中的作用究竟如何目前存在爭議，這可能與心肌肥厚及受損的程度、階段等有關，我們推測在心肌細胞損傷早期，CRT表達上調是保護性作用，而在損傷后期，CRT高表達則可能變為不利因素。
本研究觀察到在各種刺激因素引起心肌肥大過程中，ERS可能通過調控CRT的表達介導心肌細胞肥大，而沉默CRT的表達則可緩解心肌細胞肥大程度。因此，CRT可能是治療心肌肥厚后期(心肌纖維化)、心肌細胞凋亡的潛在靶點。
