人類可移植器官短缺的問題一直未能解決, 體外再造人體器官的探索也一直沒有停止。目前人們已可以在體外通過立體培養方法得到有功能的器官或是類器官。不同于傳統的平面培養, 立體培養可以使細胞與周圍細胞或組織環境產生聯系, 形成立體的、相互緊密連接并通信協作的組織結構, 進而共同發育形成器官。這為人類器官的體外再造提供了新思路。本文對現有的立體培養方案進行了分類敘述、分析及總結, 并對下一步的發展進行了展望。
引用本文： 杜瀟, 李君, 周曉囡, 吳嫣爽, 雷蕾. 立體培養技術制造器官. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(2): 382-387. doi: 10.7507/1001-5515.20160065 復制
引言
相較于傳統平面培養方式(即在培養皿等平面容器內進行的體外培養方式)，立體培養主要是指能夠在物理空間中自發地向平面外的縱軸進行增殖與生長的細胞培養方式，并在此種模式下培育出立體的器官或是類器官。組織中的細胞之間不再僅僅是物理接觸關系，而是形成更緊密的細胞間生物通信，相互影響、誘導、反饋[1]，協作式發育并形成具有功能的器官。傳統培養模式可以在體外培養近乎所有已知類型的細胞，但不能建立有效的細胞間通信，因而未能向器官體外培養更近一步。現有的立體培養模式已經能夠培養出具有功能的器官，然而不同立體培養方法都有各自的針對性與特點。例如：細胞外基質立體培養方法是目前唯一培養出功能較健全的器官的方法；無支架立體培養模式可以培養出芽器官或是類器官；人工材料支架的培養方式應用前景廣泛，在創傷及骨修復方面有較好效果[2]。在此我們對立體培養方案進行總結和分析。
1 細胞外基質支架立體培養模式
人體內的每種器官中都有能支持器官形態的生物支架[3]，其主要構成是細胞外基質[4]。利用去細胞化技術去除器官內的細胞并保留其生物支架，再將細胞注入支架內進行立體培養可達到再生器官的目的。這就是細胞外基質支架進行立體培養的基本思路，如圖 1所示。
圖1
生物支架立體培養基本思路示意圖
Figure1.
Schematic of decellularized and repopulation strategy
1.1 器官支架制取
目前制取特定器官的支架需要依靠同種器官進行去細胞化操作。去細胞化的方法大致可分為物理法、酶消化法和化學法三種[5]。由于大多數用去細胞化培養器官的培養裝置都具有灌流功能，所以直接通過化學制劑灌注的方法比較常見。化學制劑中非離子性洗滌劑聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)以及離子性洗滌劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfonate, SDS)交替使用效果較好[6]，盡管不同方案所采用的方法差距很大，但是都可以達到去除細胞和純化細胞外基質的效果，并且取得的生物支架通常也會經過機械強度測試以及顯微鏡下觀察等方法來保證支架的質量[6]。目前取得的支架涵蓋心、肺、肝、腎等主要器官，然而實現器官再生的僅有大鼠器官支架，大型動物器官的支架尚無成功再生器官的案例[7-8]。
1.2 細胞灌注培養
由于去除細胞的生物支架保留了原器官的所有結構，所以細胞灌注通常利用培養裝置從原器官支架的動脈注入并從靜脈口將溢出的液體回收進行再灌注。而灌注的細胞種類則需根據支架來源器官進行選擇以確保細胞能夠在“正確”的結構中行使自身的功能。由于細胞外基質與種植的細胞之間未見明顯的排斥反應，所以可以實現將異體細胞或是異種細胞在支架內進行種植[6]。在大鼠肺臟與心臟支架上已經有種植人源細胞的案例，且可以得到有功能的再生器官。
灌注細胞通常采用包含目的器官體細胞在內的幾種相關細胞共同灌注(如表 1所示)，而細胞灌注液則為對應細胞的培養液，需要與灌注細胞種類相匹配，同時也會加入一些輔助因子參與成體祖細胞的誘導，以使主功能細胞可以更快地建立細胞與細胞以及細胞與支架間的連接，形成具有整體功能的再生器官。也有直接將大鼠腎臟細胞外基質支架嫁接到同種大鼠腎臟上，利用宿主腎臟細胞爬附增殖的方式[9]，這種再生方式耗時更長(達56天)，但是在后續培養上卻相對簡單。
表1
部分器官支架灌注混合細胞案例
Table1.
Cases of repopulation with mixed-cells perfusion
1.3 離體培養器官裝置
器官培養裝置依據器官不同會有各自的特殊設計，但是基本會滿足這樣幾個條件：①培養裝置通常是完全密閉的培養空間，以達到醫用無菌環境。特殊器官如肺臟需要與空氣接觸時則會用抗生素進行抑菌。②有器官內的血管網循環通路和器官外的培養液循環通路，兩個通路共同完成組織培養液循環工作。③配備必要的檢測設備及數據采集系統[14]。比如Langendorff離體心臟灌流系統[15]，它的雙循環通道不僅可連接離體心臟動、靜脈口，通道上的檢測調節閥還可以實時調節流量模擬體內循環，配套的信息采集系統則可記錄心臟的收縮功能等指標。更多離體心臟監測技術都是在這個系統基礎之上進行設計，如可同時監測心電及pH值等多項指標的心臟金屬外膜檢測網等[16]。肺臟則需要有血管及氣管兩套循環通道，后期進行的氣血交換檢測也要在肺臟立體培養的裝置中進行[12]。
1.4 目前的成果與限制
利用大鼠肺臟細胞外基質支架再生的肺臟器官是目前唯一能夠回植同種動物體內并行使基本功能的再生器官[13]，在替換宿主半只肺臟的情形下可以保證同步呼吸頻率以及氣血交換，維持血內氧飽和度。鼠和人異種細胞再植的心臟器官盡管能夠保證心臟所有細胞同頻率跳動[11]，但是力度較弱，尚不能完成正常泵血功能，具體原因還有待進一步探討。腎臟[9]與肝臟[6]的再植實驗是建立在將支架嫁接在宿主同種器官上實現的，盡管完成了修復器官功能的目的，尚不能確認能否用于臟器衰竭的治療。
細胞外基質的應用因為未出現免疫排斥現象，為人類的器官再生開啟了一條新思路，如在神經損傷修復、皮膚修復，甚至是肌肉修復上都可以采用人源或是豬等大型動物源的組織細胞外基質來促進功能修復。但是在重要臟器，尤其是針對臟器衰竭的問題，細胞外基質是否能直接用于修復，暫沒有數據支持。在臟器立體培養的研究中所采用的器官大部分來源于大鼠，但是這種體積的器官對于人體來說不足以勝任，從大型動物臟器獲取生物支架進行再生也尚無有效數據，如何突破細胞外基質支架進行的離體器官再生所面臨的體積限制，是今后研究需要深入探索的方向。
2 無支架立體培養模式
無支架培養模式主要是利用細胞培養微環境的變化誘導細胞自發地形成組織或是類器官。隨著誘導多潛能干細胞技術的出現[17]，獲得多潛能干細胞途徑豐富且高效。干細胞定向誘導為特定的成體細胞或祖細胞技術方案日漸成熟[1]，這為細胞誘導立體培養技術提供了良好的基礎。目前利用細胞誘導方式培養出的類器官主要集中在外胚層和內胚層衍生器官。
2.1 外胚層器官誘導
利用無血清培養基可以將多潛能干細胞聚合培養形成擬胚體，并可以向三個胚層分化，但是更傾向于分化成外胚層[18]，目前所有的外胚層誘導器官案例大多是采用擬胚體誘導方法。Lancaster等[18]利用擬胚體誘導方法培育了腦樣類器官，在得到擬胚體后用添加了N2因子的培養液將其誘導成神經外胚層，繼而在生物效應器中用分化培養液進行立體培養，30 d后得到表層分布著包括前腦、海馬體、背側皮層和前額葉等結構的腦樣類器官，并在此基礎上取小腦癥患者細胞誘導的多潛能干細胞用相同方法模擬了小腦畸形的病理特征。Koehler等[19]則在擬胚體形成定型外胚層后用骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)因子將其誘導成非神經外胚層，繼而在成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)誘導成前原基外胚層后自發發育成內耳。Suga等[20]用高細胞量的擬胚體添加BMP4因子模擬了頭外胚層發育，并最終體外培育了小鼠垂體，在回植體內后可以使切除原垂體的小鼠恢復垂體分泌功能。類似的其他器官組織還有視杯與視網膜[21]等。
2.2 內胚層器官誘導
內胚層器官不如擬胚體形成的外胚層自發分化性強，基本都采用了將細胞誘導至成體祖細胞階段后再進行立體培養的方式[1]，但是方法則依器官不同而各不相同。如Takebe等[22]利用細胞共培養的方式，將人源的肝臟細胞與臍靜脈內皮細胞和間充質干細胞按5:5:1比例進行共培養，培育了能夠自發形成立體結構的肝芽組織，將其植入小鼠腦內可在48 h內形成組織血管網并融入宿主血循環網內，成活并能夠行使肝臟分泌功能。McCracken等[23]所培養的人胃芽組織是在將多潛能干細胞誘導為前腸細胞后利用人工基底膜特制的液滴內進行立體培養。Watson等[24]培養的腸芽組織則是將誘導的小腸內皮細胞移植在腎被膜下培育。
2.3 限制與發展
細胞誘導模式基本思路是模擬器官發育過程，因而對立體培養過程中的誘導環境要求很高，任何一個細胞誘導立體培養案例都會有一個非常復雜而精確的誘導方案。誘導因子及天數都很明確，出現細微差錯就可能將細胞命運誘導至另一途徑(如圖 2所示)。也是因為器官發育過程復雜，諸多因素并未完全清楚，故而所得都是器官的初級階段如類器官或是芽器官，大多并不能用于器官修復或替代，但是作為疾病模型探索其他方向的研究則意義重大，如遺傳學、新藥開發等。所以，對細胞命運、器官命運控制因素的探索極具前景。
圖2
細胞誘導立體培養外胚層和內胚層類器官模式圖
NOG:骨形成蛋白抑制蛋白(antagonist noggin); RA：視黃酸(retinoic acid); EGF：表皮生長因子(epidermal growth factor); GSK-3i：糖原合成酶激酶抑制劑(glycogen synthase kinase-3 inhibitors); TGFβi：轉化生長因子β抑制劑(transforming growth factorβinhibitors); BMPi：骨形成蛋白抑制劑(bone morphogenetic protein inhibitors)
Figure2. Schematic of endodermal and ectodermal tissues generation from embryonic stem cells/induced pluripotent stem cells in 3D culture3 人工生物材料應用于立體培養
人工生物材料有成分明確、結構可控的優點，已被廣泛應用于再生醫學的研究。有學者認為凝膠材料對細胞立體培養的微環境起到了類似細胞外基質的作用[25]，其不僅可以在生長空間上對細胞給予支持[26]，同時也可以在凝膠培養中動態地更改環境因素以操控細胞的命運走向[27]。在創傷修復中凝膠材料與細胞外基質的應用都非常有效[28]，但是在立體培養中凝膠支架的應用還在初步探索中。曲曉麗等[29]用凝膠支架培養肝臟組織，可以見到肝細胞聚團傾向，但沒有最終得到離體肝臟。凝膠支架不會像去細胞化的細胞外基質一樣保留器官的所有微結構，那么如何確保凝膠中的細胞之間以及細胞與凝膠之間建立正確的聯系？近些年興起的立體打印技術在生物應用的發展開啟了新的思路[30]。比如可將細胞與相應的誘導體系凝膠混合噴涂，而將配套的其他細胞疊加于其涂層之上，人為地制造細胞與環境間的相互關聯[31]。未來凝膠支架的應用能否開啟器官立體培養的新途徑值得期待。
4 展望
器官和組織的體外立體培養是一個系統而復雜的工程。我們對細胞培養的觀念從以前的給予細胞生長營養環境要轉變成給予細胞生長發育的微生態，要增強細胞與細胞之間、細胞與環境之間的互動與“交流”，引導細胞向組織形態演變。這就需要給予細胞立體生長的支撐結構，以及誘導細胞正確分化的微環境。當我們用這樣的觀點去執行器官體外誘導培養的時候，細胞共培養就不再是一個方法，而是一個基本理念，目前不僅在去細胞化方法中得到很好的應用，在人工凝膠支架培養中依然非常有效。相應地，細胞外基質對于細胞成長組織化的微環境起到舉足輕重的作用，如何將細胞外基質的功能與人工凝膠支架不受體積限制的特點相融合，以解決目前器官生物支架來源體積限制的問題，是一個值得探索的問題。
另一方面，器官與組織的體外培養面臨無法模擬生物體內血循環式的整體營養代謝問題，盡管通過去細胞化生物支架再生的器官可以利用其原有的血管系統進行營養液的灌注與更換，但是尚無法在大型動物器官中實現，這就與供給人用移植器官的最終目的尚有距離。而人為細胞共建的芽器官或類器官由于并沒有生成有效的血管系統而無法加以利用，也就意味著如果組織過大就無法供給組織中心細胞營養，無法實現組織的體外培育。而生物體內發育來的器官則有這樣天然的血管系統優勢。如目前利用人源肝臟細胞注入肝損傷小鼠體內，利用新注入細胞替代受損肝臟細胞來“再生”人源肝臟的思路[32]，就很好地利用了體內優勢，相關技術替代率可達80%以上。如果將同樣的思路在大型動物上試用，是否可以替代式地得到與人體器官體積近似的人源器官呢？由于大型動物器官質量較大所需細胞數多，是否也可以將立體培養技術結合應用于體內器官替代以得到人源器官呢？這些問題需要我們進一步的研究。
生命工程不是用單一方法來解決所有的問題，而是將諸多的方法相結合來解決某一個問題，在人類器官再造的問題上也應如此。器官發育過程中關鍵因子的研究保障了由干細胞誘導成各種器官成體細胞的可能性，多樣的立體培養方案保證了細胞向組織和芽器官的過渡，是否能利用大型動物體內培育的方法得到真正可用于移植的人類器官值得期待。未來醫學的解決方案一定是融合的方案。希望在科技發展迅速的今天，器官再生能取得新突破。
引言
相較于傳統平面培養方式(即在培養皿等平面容器內進行的體外培養方式)，立體培養主要是指能夠在物理空間中自發地向平面外的縱軸進行增殖與生長的細胞培養方式，并在此種模式下培育出立體的器官或是類器官。組織中的細胞之間不再僅僅是物理接觸關系，而是形成更緊密的細胞間生物通信，相互影響、誘導、反饋[1]，協作式發育并形成具有功能的器官。傳統培養模式可以在體外培養近乎所有已知類型的細胞，但不能建立有效的細胞間通信，因而未能向器官體外培養更近一步。現有的立體培養模式已經能夠培養出具有功能的器官，然而不同立體培養方法都有各自的針對性與特點。例如：細胞外基質立體培養方法是目前唯一培養出功能較健全的器官的方法；無支架立體培養模式可以培養出芽器官或是類器官；人工材料支架的培養方式應用前景廣泛，在創傷及骨修復方面有較好效果[2]。在此我們對立體培養方案進行總結和分析。
1 細胞外基質支架立體培養模式
人體內的每種器官中都有能支持器官形態的生物支架[3]，其主要構成是細胞外基質[4]。利用去細胞化技術去除器官內的細胞并保留其生物支架，再將細胞注入支架內進行立體培養可達到再生器官的目的。這就是細胞外基質支架進行立體培養的基本思路，如圖 1所示。
圖1
生物支架立體培養基本思路示意圖
Figure1.
Schematic of decellularized and repopulation strategy
1.1 器官支架制取
目前制取特定器官的支架需要依靠同種器官進行去細胞化操作。去細胞化的方法大致可分為物理法、酶消化法和化學法三種[5]。由于大多數用去細胞化培養器官的培養裝置都具有灌流功能，所以直接通過化學制劑灌注的方法比較常見。化學制劑中非離子性洗滌劑聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)以及離子性洗滌劑十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfonate, SDS)交替使用效果較好[6]，盡管不同方案所采用的方法差距很大，但是都可以達到去除細胞和純化細胞外基質的效果，并且取得的生物支架通常也會經過機械強度測試以及顯微鏡下觀察等方法來保證支架的質量[6]。目前取得的支架涵蓋心、肺、肝、腎等主要器官，然而實現器官再生的僅有大鼠器官支架，大型動物器官的支架尚無成功再生器官的案例[7-8]。
1.2 細胞灌注培養
由于去除細胞的生物支架保留了原器官的所有結構，所以細胞灌注通常利用培養裝置從原器官支架的動脈注入并從靜脈口將溢出的液體回收進行再灌注。而灌注的細胞種類則需根據支架來源器官進行選擇以確保細胞能夠在“正確”的結構中行使自身的功能。由于細胞外基質與種植的細胞之間未見明顯的排斥反應，所以可以實現將異體細胞或是異種細胞在支架內進行種植[6]。在大鼠肺臟與心臟支架上已經有種植人源細胞的案例，且可以得到有功能的再生器官。
灌注細胞通常采用包含目的器官體細胞在內的幾種相關細胞共同灌注(如表 1所示)，而細胞灌注液則為對應細胞的培養液，需要與灌注細胞種類相匹配，同時也會加入一些輔助因子參與成體祖細胞的誘導，以使主功能細胞可以更快地建立細胞與細胞以及細胞與支架間的連接，形成具有整體功能的再生器官。也有直接將大鼠腎臟細胞外基質支架嫁接到同種大鼠腎臟上，利用宿主腎臟細胞爬附增殖的方式[9]，這種再生方式耗時更長(達56天)，但是在后續培養上卻相對簡單。
表1
部分器官支架灌注混合細胞案例
Table1.
Cases of repopulation with mixed-cells perfusion
1.3 離體培養器官裝置
器官培養裝置依據器官不同會有各自的特殊設計，但是基本會滿足這樣幾個條件：①培養裝置通常是完全密閉的培養空間，以達到醫用無菌環境。特殊器官如肺臟需要與空氣接觸時則會用抗生素進行抑菌。②有器官內的血管網循環通路和器官外的培養液循環通路，兩個通路共同完成組織培養液循環工作。③配備必要的檢測設備及數據采集系統[14]。比如Langendorff離體心臟灌流系統[15]，它的雙循環通道不僅可連接離體心臟動、靜脈口，通道上的檢測調節閥還可以實時調節流量模擬體內循環，配套的信息采集系統則可記錄心臟的收縮功能等指標。更多離體心臟監測技術都是在這個系統基礎之上進行設計，如可同時監測心電及pH值等多項指標的心臟金屬外膜檢測網等[16]。肺臟則需要有血管及氣管兩套循環通道，后期進行的氣血交換檢測也要在肺臟立體培養的裝置中進行[12]。
1.4 目前的成果與限制
利用大鼠肺臟細胞外基質支架再生的肺臟器官是目前唯一能夠回植同種動物體內并行使基本功能的再生器官[13]，在替換宿主半只肺臟的情形下可以保證同步呼吸頻率以及氣血交換，維持血內氧飽和度。鼠和人異種細胞再植的心臟器官盡管能夠保證心臟所有細胞同頻率跳動[11]，但是力度較弱，尚不能完成正常泵血功能，具體原因還有待進一步探討。腎臟[9]與肝臟[6]的再植實驗是建立在將支架嫁接在宿主同種器官上實現的，盡管完成了修復器官功能的目的，尚不能確認能否用于臟器衰竭的治療。
細胞外基質的應用因為未出現免疫排斥現象，為人類的器官再生開啟了一條新思路，如在神經損傷修復、皮膚修復，甚至是肌肉修復上都可以采用人源或是豬等大型動物源的組織細胞外基質來促進功能修復。但是在重要臟器，尤其是針對臟器衰竭的問題，細胞外基質是否能直接用于修復，暫沒有數據支持。在臟器立體培養的研究中所采用的器官大部分來源于大鼠，但是這種體積的器官對于人體來說不足以勝任，從大型動物臟器獲取生物支架進行再生也尚無有效數據，如何突破細胞外基質支架進行的離體器官再生所面臨的體積限制，是今后研究需要深入探索的方向。
2 無支架立體培養模式
無支架培養模式主要是利用細胞培養微環境的變化誘導細胞自發地形成組織或是類器官。隨著誘導多潛能干細胞技術的出現[17]，獲得多潛能干細胞途徑豐富且高效。干細胞定向誘導為特定的成體細胞或祖細胞技術方案日漸成熟[1]，這為細胞誘導立體培養技術提供了良好的基礎。目前利用細胞誘導方式培養出的類器官主要集中在外胚層和內胚層衍生器官。
2.1 外胚層器官誘導
利用無血清培養基可以將多潛能干細胞聚合培養形成擬胚體，并可以向三個胚層分化，但是更傾向于分化成外胚層[18]，目前所有的外胚層誘導器官案例大多是采用擬胚體誘導方法。Lancaster等[18]利用擬胚體誘導方法培育了腦樣類器官，在得到擬胚體后用添加了N2因子的培養液將其誘導成神經外胚層，繼而在生物效應器中用分化培養液進行立體培養，30 d后得到表層分布著包括前腦、海馬體、背側皮層和前額葉等結構的腦樣類器官，并在此基礎上取小腦癥患者細胞誘導的多潛能干細胞用相同方法模擬了小腦畸形的病理特征。Koehler等[19]則在擬胚體形成定型外胚層后用骨形成蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)因子將其誘導成非神經外胚層，繼而在成纖維細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)誘導成前原基外胚層后自發發育成內耳。Suga等[20]用高細胞量的擬胚體添加BMP4因子模擬了頭外胚層發育，并最終體外培育了小鼠垂體，在回植體內后可以使切除原垂體的小鼠恢復垂體分泌功能。類似的其他器官組織還有視杯與視網膜[21]等。
2.2 內胚層器官誘導
內胚層器官不如擬胚體形成的外胚層自發分化性強，基本都采用了將細胞誘導至成體祖細胞階段后再進行立體培養的方式[1]，但是方法則依器官不同而各不相同。如Takebe等[22]利用細胞共培養的方式，將人源的肝臟細胞與臍靜脈內皮細胞和間充質干細胞按5:5:1比例進行共培養，培育了能夠自發形成立體結構的肝芽組織，將其植入小鼠腦內可在48 h內形成組織血管網并融入宿主血循環網內，成活并能夠行使肝臟分泌功能。McCracken等[23]所培養的人胃芽組織是在將多潛能干細胞誘導為前腸細胞后利用人工基底膜特制的液滴內進行立體培養。Watson等[24]培養的腸芽組織則是將誘導的小腸內皮細胞移植在腎被膜下培育。
2.3 限制與發展
細胞誘導模式基本思路是模擬器官發育過程，因而對立體培養過程中的誘導環境要求很高，任何一個細胞誘導立體培養案例都會有一個非常復雜而精確的誘導方案。誘導因子及天數都很明確，出現細微差錯就可能將細胞命運誘導至另一途徑(如圖 2所示)。也是因為器官發育過程復雜，諸多因素并未完全清楚，故而所得都是器官的初級階段如類器官或是芽器官，大多并不能用于器官修復或替代，但是作為疾病模型探索其他方向的研究則意義重大，如遺傳學、新藥開發等。所以，對細胞命運、器官命運控制因素的探索極具前景。
圖2
細胞誘導立體培養外胚層和內胚層類器官模式圖
NOG:骨形成蛋白抑制蛋白(antagonist noggin); RA：視黃酸(retinoic acid); EGF：表皮生長因子(epidermal growth factor); GSK-3i：糖原合成酶激酶抑制劑(glycogen synthase kinase-3 inhibitors); TGFβi：轉化生長因子β抑制劑(transforming growth factorβinhibitors); BMPi：骨形成蛋白抑制劑(bone morphogenetic protein inhibitors)
Figure2. Schematic of endodermal and ectodermal tissues generation from embryonic stem cells/induced pluripotent stem cells in 3D culture3 人工生物材料應用于立體培養
人工生物材料有成分明確、結構可控的優點，已被廣泛應用于再生醫學的研究。有學者認為凝膠材料對細胞立體培養的微環境起到了類似細胞外基質的作用[25]，其不僅可以在生長空間上對細胞給予支持[26]，同時也可以在凝膠培養中動態地更改環境因素以操控細胞的命運走向[27]。在創傷修復中凝膠材料與細胞外基質的應用都非常有效[28]，但是在立體培養中凝膠支架的應用還在初步探索中。曲曉麗等[29]用凝膠支架培養肝臟組織，可以見到肝細胞聚團傾向，但沒有最終得到離體肝臟。凝膠支架不會像去細胞化的細胞外基質一樣保留器官的所有微結構，那么如何確保凝膠中的細胞之間以及細胞與凝膠之間建立正確的聯系？近些年興起的立體打印技術在生物應用的發展開啟了新的思路[30]。比如可將細胞與相應的誘導體系凝膠混合噴涂，而將配套的其他細胞疊加于其涂層之上，人為地制造細胞與環境間的相互關聯[31]。未來凝膠支架的應用能否開啟器官立體培養的新途徑值得期待。
4 展望
器官和組織的體外立體培養是一個系統而復雜的工程。我們對細胞培養的觀念從以前的給予細胞生長營養環境要轉變成給予細胞生長發育的微生態，要增強細胞與細胞之間、細胞與環境之間的互動與“交流”，引導細胞向組織形態演變。這就需要給予細胞立體生長的支撐結構，以及誘導細胞正確分化的微環境。當我們用這樣的觀點去執行器官體外誘導培養的時候，細胞共培養就不再是一個方法，而是一個基本理念，目前不僅在去細胞化方法中得到很好的應用，在人工凝膠支架培養中依然非常有效。相應地，細胞外基質對于細胞成長組織化的微環境起到舉足輕重的作用，如何將細胞外基質的功能與人工凝膠支架不受體積限制的特點相融合，以解決目前器官生物支架來源體積限制的問題，是一個值得探索的問題。
另一方面，器官與組織的體外培養面臨無法模擬生物體內血循環式的整體營養代謝問題，盡管通過去細胞化生物支架再生的器官可以利用其原有的血管系統進行營養液的灌注與更換，但是尚無法在大型動物器官中實現，這就與供給人用移植器官的最終目的尚有距離。而人為細胞共建的芽器官或類器官由于并沒有生成有效的血管系統而無法加以利用，也就意味著如果組織過大就無法供給組織中心細胞營養，無法實現組織的體外培育。而生物體內發育來的器官則有這樣天然的血管系統優勢。如目前利用人源肝臟細胞注入肝損傷小鼠體內，利用新注入細胞替代受損肝臟細胞來“再生”人源肝臟的思路[32]，就很好地利用了體內優勢，相關技術替代率可達80%以上。如果將同樣的思路在大型動物上試用，是否可以替代式地得到與人體器官體積近似的人源器官呢？由于大型動物器官質量較大所需細胞數多，是否也可以將立體培養技術結合應用于體內器官替代以得到人源器官呢？這些問題需要我們進一步的研究。
生命工程不是用單一方法來解決所有的問題，而是將諸多的方法相結合來解決某一個問題，在人類器官再造的問題上也應如此。器官發育過程中關鍵因子的研究保障了由干細胞誘導成各種器官成體細胞的可能性，多樣的立體培養方案保證了細胞向組織和芽器官的過渡，是否能利用大型動物體內培育的方法得到真正可用于移植的人類器官值得期待。未來醫學的解決方案一定是融合的方案。希望在科技發展迅速的今天，器官再生能取得新突破。
