生物起搏器是治療嚴重緩慢性心律失常的一個新策略, 而尋找合適的起搏細胞是其首要問題。本文綜述了通過轉染基因、化學誘導、共培養以及特定培養基培養的方法將骨髓間充質干細胞、脂肪干細胞誘導為起搏樣細胞的研究進展, 分析了它們作為生物心臟起搏器種子細胞尚需解決的問題。
引用本文： 黃超, 楊向群. 間充質干細胞向起搏樣細胞的誘導分化. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(2): 378-381, 387. doi: 10.7507/1001-5515.20160064 復制
引言
心臟及其傳導系統病變可誘發威脅生命的心律失常，往往需要藥物、手術或者電子起搏器植入等治療[1]。雖然電子起搏器日臻完善，仍存在對體內體液調節不敏感、可能發生感染以及電池使用壽命有限等不足[2]。隨著干細胞、組織工程、再生醫學等學科的發展，生物起搏器的研究逐漸成為研究的熱點。所謂生物起搏器，是指運用生物學原理和相關技術，利用具有起搏功能的細胞或組織來替代病損的起搏或傳導組織，以達到重建、恢復心臟起搏和傳導功能目的。
構建生物起搏器的策略包括對原位心肌細胞的基因轉染、起搏細胞移植及組織工程構建等[3]，目前的研究主要集中在以下兩個方面：一是通過基因操作、重編程使原有心肌細胞轉變為起搏細胞；二是尋找有起搏功能的種子細胞以進行細胞移植，尤其是將干細胞誘導為起搏細胞，包括胚胎干細胞、誘導性多能干細胞和成體干細胞。由于骨髓間充質干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)來源比較廣泛，取材較方便、容易，且沒有倫理學限制，更有可能應用于臨床，因此具有潛在的應用前景。本文主要對BMSCs和ADSCs向起搏樣細胞的誘導分化進行綜述。
1 骨髓間充質干細胞
間充質干細胞是一種非造血基質細胞，國際細胞治療協會推薦用以下標準來鑒定間充質干細胞：①可差速貼壁；②在體外標準誘導環境下可誘導成軟骨、骨和脂肪組織；③表達CD105、CD73和CD90，不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和HLA-DR[4]。BMSCs由Friedenstein等[5]在1976年首次從小鼠骨髓中發現，此后對其分離、純化和培養等進行了更進一步的深入研究，證實BMSCs具有成骨[6]、成軟骨[7]、成肌[8]、成脂肪[9]等多向分化的能力。
1.1 BMSCs的免疫細胞表型
BMSCs的免疫細胞表型比較復雜，許多研究結果不盡相同，Russo等[10]認為BMSCs表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166，而在新鮮分離出來時不表達CD34、CD73；在培養過程中表達CD106、CD49f、PODXL，不表達CD49d、CD54。Minteer等[11]認為BMSCs還表達CD13、MHCⅠ，HLA-ABC，不表達CD34、CD38、CD45、HLA-DR、DP、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、CD40L(CD154)等。
1.2 BMSCs向起搏樣細胞的誘導分化
1.2.1 轉染起搏基因
存在于起搏細胞的超極化激活的環核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization-activated cation channel,HCN)在超極化時能夠激活，并受cAMP調控，能夠產生If電流，從而產生其動作電位的4期自動去極化，進而自發產生新的動作電位，達到起搏心臟的作用。HCN通道有4種，分別是HCN1、HCN2、HCN3、HCN4，其中存在于心臟中的有HCN1、HCN2、HCN4。Potapova等[12]首次應用電穿孔的方法將小鼠HCN2基因轉染進人BMSCs中，隨后將其與大鼠心肌細胞共培養或移植到犬左室心外膜下，記錄到自動去極化的動作電位，并在心外膜下形成異位起搏點，與鄰近心肌細胞產生縫隙連接。其后研究發現，移植細胞數量必須大于700 000個才能夠發揮作用。Cheng等[13]通過慢病毒將小鼠HCN4轉染進犬的BMSCs中，可產生If電流，注射至犬右心室壁中，在刺激犬迷走神經時，發現右室有其特定頻率的自主搏動。Wei等[14]通過慢病毒轉染小鼠HCN4進入犬BMSCs中，并注射至完全房室傳導阻滯的犬左室前壁，發現犬的最大心率快于正常組，運動后的心率變異高于正常組。Zhou等[15]體外研究證實，通過慢病毒轉染人HCN1的兔BMSCs，可產生IHCN1，可使與其共培養的新生兔心肌細胞跳動頻率加快。Nong等[16]最近的研究表明，移植細胞的連接蛋白43表達低，可能是影響起搏效果的重要原因。這些研究表明向BMSCs中轉染起搏基因，BMSCs可以產生If，體外和體內都能使得周圍的心肌細胞產生跳動。但BMSCs本身并不具備起搏細胞的結構基礎，僅用單一的基因轉染無法成為起搏細胞。此外，基因轉染后的BMSCs在體內的長時間效果尚需進一步研究。
1.2.2 化學誘導
在干細胞的研究過程中，5-氮雜胞苷(5-azacytidine,5-AZA)作為誘導劑，經常被用來誘導干細胞向心肌細胞的定向分化。研究發現，小鼠BMSCs經過5-AZA誘導后，部分能夠自發跳動，并能檢測到竇房結樣和心室肌樣的動作電位。Yang等[17]發現用10μmol/L 5-AZA誘導人BMSCs，4周后開始表達起搏基因HCN2、HCN4。用5-AZA和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)誘導大鼠BMSCs 24 h后，與新生大鼠心肌細胞間接共培養，可分化成球狀和桿狀的細胞，檢測到其竇房結樣、心室肌樣的動作電位，同時表達HCN4、Tbx3等和起搏細胞密切相關的基因，并進一步證實神經調節蛋白-1/酪氨酸蛋白激酶受體通路對大鼠BMSCs的這種分化起促進作用[18]。然而，由于5-AZA的細胞毒性及其致突變作用，目前沒有報道使用5-AZA對BMSCs向起搏細胞誘導的動物實驗，也限制了其在臨床應用的價值。
1.2.3 共培養
干細胞所處的微環境、細胞間的直接接觸是其定向分化的關鍵因素。因此，目前已經應用竇房結細胞、心肌細胞或者心肌裂解液、條件培養基等共培養，通過直接或者間接接觸來誘導BMSCs向起搏樣細胞的定向分化。宋波等[19]將3代大鼠BMSCs和大鼠竇房結組織混合但不直接接觸，隨著培養時間的延長(1～3周)，HCN4和connexin 40的表達水平均逐漸增加。Li等[18]用5-AZA和bFGF誘導大鼠BMSCs 24 h，再與新生大鼠心肌細胞間接共培養，檢測到竇房結樣動作電位及HCN4、Tbx3等起搏相關基因的表達。這些研究均未對誘導分化的具體機制進行研究，可以作為下一步的研究方向。
2 脂肪干細胞
ADSCs是一種脂肪來源的間充質干細胞，它是Zuk等[20]在2001年首次從人的脂肪抽吸物中發現大量類似干細胞的細胞，能夠被誘導成骨、成軟骨、成肌、成脂肪分化。ADSCs同BMSCs一樣具有多向分化潛能，目前已被證實其成骨[21]、成軟骨[22]、成肌[23]、成脂肪[24]等多向分化能力。
2.1 ADSCs的免疫細胞表型
ADSCs主要表達CD105、CD73、CD90，不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA-II[25]。Minteer等[11]認為其表達CD13、CD29、CD34、CD73、CD90、CD105、CD166、MHCⅠ、HLA-ABC，不表達CD38、CD45、CD106、HLA-DR、DP、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、CD40L。Russo等[10]認為ADSCs和BMSCs都表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166，但ADSCs在新鮮分離時會表達CD34，在培養過程中會表達CD49d、CD54，不表達CD106、CD49f、PODXL。
2.2 ADSCs向起搏樣細胞的誘導分化
2.2.1 轉染基因
對ADSCs轉染起搏基因的研究，國內外報道的比較少，李勇等[26]將人HCN2基因轉染進大鼠ADSCs中，并將其與乳鼠心室肌細胞共培養，發現ADSCs能表達較強的人HCN2基因及蛋白，產生If電流，并能使心室肌細胞的自發性搏動明顯增快增強。Li等[27]通過慢病毒使CD73+的ADSCs過表達Gata4、Baf60c、Tbx5，8 d后分化為自發跳動的細胞，頻率為80～120次/min，但并未鑒定是否為起搏細胞，也未檢測其是否具有起搏特征，因此尚有待更深入的研究。
2.2.2 化學誘導
Rangappa等[28]在2003年首次利用不同濃度的5-AZA來誘導兔腹部脂肪來源的ADSCs，2周后20%~30%的細胞表現出球樣形態，3周后這些細胞開始自發跳動，但對跳動細胞是否為起搏細胞未做鑒定。而Yang等[17]將人BMSCs和ADSCs經10μmol/L 5-AZA誘導48 h，4周后，通過比較發現，ADSCs增殖能力強于BMSCs，肌鈣蛋白I表達也高于BMSCs，且起搏基因HCN2、HCN4等表達的時間比BMSCs早，表達量也比BMSCs多，認為ADSCs更容易誘導。然而，并不是所有的ADSCs經5-AZA誘導都可以向起搏樣細胞分化，Lee等[29]分別用5、10μmol/L 5-AZA誘導人腹部皮下脂肪來源的ADSCs，觀察8周，并沒發現其分化為跳動的細胞，也未做起搏特征的鑒定。因此，5-AZA誘導ADSCs向起搏細胞分化尚存爭論，其機制也不是很清楚，還有待更深入的探索。
2.2.3 共培養
研究發現，將人皮下脂肪來源的ADSCs與4～6周大鼠心肌提取液共培養，可觀察到細胞有跳動現象。Choi等[30]將人皮下脂肪來源的ADSCs與新生大鼠心肌細胞(1∶10)直接接觸共培養，1周后細胞能夠自發跳動，檢測到細胞鈣瞬變、與周圍心肌細胞形成縫隙連接，具有一定的起搏特征。但其他一些研究卻得到了陰性結果，可能與組織來源、誘導條件差異有關，但具體原因尚不明確。
2.2.4 特定培養基培養
Planat-Bénard等[31]發現6周齡小鼠腹股溝和肩胛間的ADSCs在含有15%胎牛血清的甲基纖維素培養基培養下，1～2周后可以自發地分化為跳動的心肌細胞，自發產生動作電位。結合藥理學檢測，認為心肌細胞中混有起搏細胞。Palpant等[32]篩選出小鼠肩胛間Sca1+/c-kit+的ADSCs在上述條件培養1周后，分化為自發跳動的細胞，通過檢測鈣瞬變，證明其有起搏功能，指出非經典Wnt通路在其中起到促進的作用。Zhao等[33]也做了類似的研究，發現ADSCs自發地分化為跳動的細胞，證實Rho因子相關蛋白激酶起著重要的作用，但并沒有對這些細胞進行鑒定。然而這些研究未嚴格區分ADSCs是來源于白色脂肪還是棕色脂肪。Dromard等[34]證實心肌樣細胞跳動與培養基中鈣的含量有關，同時認為這些能夠分化為起搏樣細胞的干細胞主要來自于棕色脂肪。
Jumabay等[35]用含有20%胎牛血清的常規培養基培養小鼠去分化白色脂肪細胞2周后，發現一些自發跳動的細胞，并具有4期自動去極化的特點，具有起搏細胞的特性。而Yamada等[36]從小鼠棕色脂肪組織中篩選出CD29+的ADSCs，用含有10%胎牛血清的常規培養基培養后發現有部分細胞能夠自發跳動。Liu等[37]對從棕色脂肪組織中分離ADSCs的方法進行改進，提高了跳動細胞的比例。但兩者并未對這些跳動的細胞進行起搏特征的鑒定。陳磊等[38]在體外用含有15%胎牛血清的常規培養基培養來自小鼠肩胛間棕色脂肪的ADSCs，發現可分化為自發跳動的細胞，并證實這些自發跳動的細胞具有起搏特征，同時證實經典Wnt通路在棕色脂肪源性ADSCs自發分化為起搏樣細胞中的重要作用。
無論是甲基纖維素培養基誘導還是含有不同濃度胎牛血清的常規培養基誘導，相比于其他方法，更加容易、方便。但是，這些細胞中起搏細胞的比例都比較低，目前還不能滿足作為起搏種子細胞的要求。此外，上述研究都局限在二維條件，有待深入到三維條件下和動物實驗中進行驗證。
3 前景展望
ADSCs比BMSCs來源更加廣泛，取材容易，安全性高，而且ADSCs的增殖活性、分化能力等不遜于BMSCs，因此更有臨床應用價值。雖然目前間充質干細胞向起搏樣細胞分化的研究已經有了很大的進展，但是距離構建生物起搏器還有很長的一段路要走，迫切需要更多更深入的研究。如對干細胞的誘導方法還須進一步改進，提高起搏樣細胞的分化比例；通過篩選某個標志或者其他的方法，純化起搏樣細胞；對干細胞定向分化為起搏樣細胞的主要機制還有待深入地研究和探討，從而更好地調控干細胞向起搏樣細胞的定向分化；三維條件下細胞誘導分化、在體條件下的動物實驗也是下一步研究的方向。
引言
心臟及其傳導系統病變可誘發威脅生命的心律失常，往往需要藥物、手術或者電子起搏器植入等治療[1]。雖然電子起搏器日臻完善，仍存在對體內體液調節不敏感、可能發生感染以及電池使用壽命有限等不足[2]。隨著干細胞、組織工程、再生醫學等學科的發展，生物起搏器的研究逐漸成為研究的熱點。所謂生物起搏器，是指運用生物學原理和相關技術，利用具有起搏功能的細胞或組織來替代病損的起搏或傳導組織，以達到重建、恢復心臟起搏和傳導功能目的。
構建生物起搏器的策略包括對原位心肌細胞的基因轉染、起搏細胞移植及組織工程構建等[3]，目前的研究主要集中在以下兩個方面：一是通過基因操作、重編程使原有心肌細胞轉變為起搏細胞；二是尋找有起搏功能的種子細胞以進行細胞移植，尤其是將干細胞誘導為起搏細胞，包括胚胎干細胞、誘導性多能干細胞和成體干細胞。由于骨髓間充質干細胞(bone-marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)和脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)來源比較廣泛，取材較方便、容易，且沒有倫理學限制，更有可能應用于臨床，因此具有潛在的應用前景。本文主要對BMSCs和ADSCs向起搏樣細胞的誘導分化進行綜述。
1 骨髓間充質干細胞
間充質干細胞是一種非造血基質細胞，國際細胞治療協會推薦用以下標準來鑒定間充質干細胞：①可差速貼壁；②在體外標準誘導環境下可誘導成軟骨、骨和脂肪組織；③表達CD105、CD73和CD90，不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α、CD19和HLA-DR[4]。BMSCs由Friedenstein等[5]在1976年首次從小鼠骨髓中發現，此后對其分離、純化和培養等進行了更進一步的深入研究，證實BMSCs具有成骨[6]、成軟骨[7]、成肌[8]、成脂肪[9]等多向分化的能力。
1.1 BMSCs的免疫細胞表型
BMSCs的免疫細胞表型比較復雜，許多研究結果不盡相同，Russo等[10]認為BMSCs表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166，而在新鮮分離出來時不表達CD34、CD73；在培養過程中表達CD106、CD49f、PODXL，不表達CD49d、CD54。Minteer等[11]認為BMSCs還表達CD13、MHCⅠ，HLA-ABC，不表達CD34、CD38、CD45、HLA-DR、DP、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、CD40L(CD154)等。
1.2 BMSCs向起搏樣細胞的誘導分化
1.2.1 轉染起搏基因
存在于起搏細胞的超極化激活的環核苷酸門控陽離子通道(hyperpolarization-activated cation channel,HCN)在超極化時能夠激活，并受cAMP調控，能夠產生If電流，從而產生其動作電位的4期自動去極化，進而自發產生新的動作電位，達到起搏心臟的作用。HCN通道有4種，分別是HCN1、HCN2、HCN3、HCN4，其中存在于心臟中的有HCN1、HCN2、HCN4。Potapova等[12]首次應用電穿孔的方法將小鼠HCN2基因轉染進人BMSCs中，隨后將其與大鼠心肌細胞共培養或移植到犬左室心外膜下，記錄到自動去極化的動作電位，并在心外膜下形成異位起搏點，與鄰近心肌細胞產生縫隙連接。其后研究發現，移植細胞數量必須大于700 000個才能夠發揮作用。Cheng等[13]通過慢病毒將小鼠HCN4轉染進犬的BMSCs中，可產生If電流，注射至犬右心室壁中，在刺激犬迷走神經時，發現右室有其特定頻率的自主搏動。Wei等[14]通過慢病毒轉染小鼠HCN4進入犬BMSCs中，并注射至完全房室傳導阻滯的犬左室前壁，發現犬的最大心率快于正常組，運動后的心率變異高于正常組。Zhou等[15]體外研究證實，通過慢病毒轉染人HCN1的兔BMSCs，可產生IHCN1，可使與其共培養的新生兔心肌細胞跳動頻率加快。Nong等[16]最近的研究表明，移植細胞的連接蛋白43表達低，可能是影響起搏效果的重要原因。這些研究表明向BMSCs中轉染起搏基因，BMSCs可以產生If，體外和體內都能使得周圍的心肌細胞產生跳動。但BMSCs本身并不具備起搏細胞的結構基礎，僅用單一的基因轉染無法成為起搏細胞。此外，基因轉染后的BMSCs在體內的長時間效果尚需進一步研究。
1.2.2 化學誘導
在干細胞的研究過程中，5-氮雜胞苷(5-azacytidine,5-AZA)作為誘導劑，經常被用來誘導干細胞向心肌細胞的定向分化。研究發現，小鼠BMSCs經過5-AZA誘導后，部分能夠自發跳動，并能檢測到竇房結樣和心室肌樣的動作電位。Yang等[17]發現用10μmol/L 5-AZA誘導人BMSCs，4周后開始表達起搏基因HCN2、HCN4。用5-AZA和堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)誘導大鼠BMSCs 24 h后，與新生大鼠心肌細胞間接共培養，可分化成球狀和桿狀的細胞，檢測到其竇房結樣、心室肌樣的動作電位，同時表達HCN4、Tbx3等和起搏細胞密切相關的基因，并進一步證實神經調節蛋白-1/酪氨酸蛋白激酶受體通路對大鼠BMSCs的這種分化起促進作用[18]。然而，由于5-AZA的細胞毒性及其致突變作用，目前沒有報道使用5-AZA對BMSCs向起搏細胞誘導的動物實驗，也限制了其在臨床應用的價值。
1.2.3 共培養
干細胞所處的微環境、細胞間的直接接觸是其定向分化的關鍵因素。因此，目前已經應用竇房結細胞、心肌細胞或者心肌裂解液、條件培養基等共培養，通過直接或者間接接觸來誘導BMSCs向起搏樣細胞的定向分化。宋波等[19]將3代大鼠BMSCs和大鼠竇房結組織混合但不直接接觸，隨著培養時間的延長(1～3周)，HCN4和connexin 40的表達水平均逐漸增加。Li等[18]用5-AZA和bFGF誘導大鼠BMSCs 24 h，再與新生大鼠心肌細胞間接共培養，檢測到竇房結樣動作電位及HCN4、Tbx3等起搏相關基因的表達。這些研究均未對誘導分化的具體機制進行研究，可以作為下一步的研究方向。
2 脂肪干細胞
ADSCs是一種脂肪來源的間充質干細胞，它是Zuk等[20]在2001年首次從人的脂肪抽吸物中發現大量類似干細胞的細胞，能夠被誘導成骨、成軟骨、成肌、成脂肪分化。ADSCs同BMSCs一樣具有多向分化潛能，目前已被證實其成骨[21]、成軟骨[22]、成肌[23]、成脂肪[24]等多向分化能力。
2.1 ADSCs的免疫細胞表型
ADSCs主要表達CD105、CD73、CD90，不表達CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19、HLA-II[25]。Minteer等[11]認為其表達CD13、CD29、CD34、CD73、CD90、CD105、CD166、MHCⅠ、HLA-ABC，不表達CD38、CD45、CD106、HLA-DR、DP、MHCⅡ、CD80、CD86、CD40、CD40L。Russo等[10]認為ADSCs和BMSCs都表達CD29、CD44、CD73、CD90、CD105以及CD166，但ADSCs在新鮮分離時會表達CD34，在培養過程中會表達CD49d、CD54，不表達CD106、CD49f、PODXL。
2.2 ADSCs向起搏樣細胞的誘導分化
2.2.1 轉染基因
對ADSCs轉染起搏基因的研究，國內外報道的比較少，李勇等[26]將人HCN2基因轉染進大鼠ADSCs中，并將其與乳鼠心室肌細胞共培養，發現ADSCs能表達較強的人HCN2基因及蛋白，產生If電流，并能使心室肌細胞的自發性搏動明顯增快增強。Li等[27]通過慢病毒使CD73+的ADSCs過表達Gata4、Baf60c、Tbx5，8 d后分化為自發跳動的細胞，頻率為80～120次/min，但并未鑒定是否為起搏細胞，也未檢測其是否具有起搏特征，因此尚有待更深入的研究。
2.2.2 化學誘導
Rangappa等[28]在2003年首次利用不同濃度的5-AZA來誘導兔腹部脂肪來源的ADSCs，2周后20%~30%的細胞表現出球樣形態，3周后這些細胞開始自發跳動，但對跳動細胞是否為起搏細胞未做鑒定。而Yang等[17]將人BMSCs和ADSCs經10μmol/L 5-AZA誘導48 h，4周后，通過比較發現，ADSCs增殖能力強于BMSCs，肌鈣蛋白I表達也高于BMSCs，且起搏基因HCN2、HCN4等表達的時間比BMSCs早，表達量也比BMSCs多，認為ADSCs更容易誘導。然而，并不是所有的ADSCs經5-AZA誘導都可以向起搏樣細胞分化，Lee等[29]分別用5、10μmol/L 5-AZA誘導人腹部皮下脂肪來源的ADSCs，觀察8周，并沒發現其分化為跳動的細胞，也未做起搏特征的鑒定。因此，5-AZA誘導ADSCs向起搏細胞分化尚存爭論，其機制也不是很清楚，還有待更深入的探索。
2.2.3 共培養
研究發現，將人皮下脂肪來源的ADSCs與4～6周大鼠心肌提取液共培養，可觀察到細胞有跳動現象。Choi等[30]將人皮下脂肪來源的ADSCs與新生大鼠心肌細胞(1∶10)直接接觸共培養，1周后細胞能夠自發跳動，檢測到細胞鈣瞬變、與周圍心肌細胞形成縫隙連接，具有一定的起搏特征。但其他一些研究卻得到了陰性結果，可能與組織來源、誘導條件差異有關，但具體原因尚不明確。
2.2.4 特定培養基培養
Planat-Bénard等[31]發現6周齡小鼠腹股溝和肩胛間的ADSCs在含有15%胎牛血清的甲基纖維素培養基培養下，1～2周后可以自發地分化為跳動的心肌細胞，自發產生動作電位。結合藥理學檢測，認為心肌細胞中混有起搏細胞。Palpant等[32]篩選出小鼠肩胛間Sca1+/c-kit+的ADSCs在上述條件培養1周后，分化為自發跳動的細胞，通過檢測鈣瞬變，證明其有起搏功能，指出非經典Wnt通路在其中起到促進的作用。Zhao等[33]也做了類似的研究，發現ADSCs自發地分化為跳動的細胞，證實Rho因子相關蛋白激酶起著重要的作用，但并沒有對這些細胞進行鑒定。然而這些研究未嚴格區分ADSCs是來源于白色脂肪還是棕色脂肪。Dromard等[34]證實心肌樣細胞跳動與培養基中鈣的含量有關，同時認為這些能夠分化為起搏樣細胞的干細胞主要來自于棕色脂肪。
Jumabay等[35]用含有20%胎牛血清的常規培養基培養小鼠去分化白色脂肪細胞2周后，發現一些自發跳動的細胞，并具有4期自動去極化的特點，具有起搏細胞的特性。而Yamada等[36]從小鼠棕色脂肪組織中篩選出CD29+的ADSCs，用含有10%胎牛血清的常規培養基培養后發現有部分細胞能夠自發跳動。Liu等[37]對從棕色脂肪組織中分離ADSCs的方法進行改進，提高了跳動細胞的比例。但兩者并未對這些跳動的細胞進行起搏特征的鑒定。陳磊等[38]在體外用含有15%胎牛血清的常規培養基培養來自小鼠肩胛間棕色脂肪的ADSCs，發現可分化為自發跳動的細胞，并證實這些自發跳動的細胞具有起搏特征，同時證實經典Wnt通路在棕色脂肪源性ADSCs自發分化為起搏樣細胞中的重要作用。
無論是甲基纖維素培養基誘導還是含有不同濃度胎牛血清的常規培養基誘導，相比于其他方法，更加容易、方便。但是，這些細胞中起搏細胞的比例都比較低，目前還不能滿足作為起搏種子細胞的要求。此外，上述研究都局限在二維條件，有待深入到三維條件下和動物實驗中進行驗證。
3 前景展望
ADSCs比BMSCs來源更加廣泛，取材容易，安全性高，而且ADSCs的增殖活性、分化能力等不遜于BMSCs，因此更有臨床應用價值。雖然目前間充質干細胞向起搏樣細胞分化的研究已經有了很大的進展，但是距離構建生物起搏器還有很長的一段路要走，迫切需要更多更深入的研究。如對干細胞的誘導方法還須進一步改進，提高起搏樣細胞的分化比例；通過篩選某個標志或者其他的方法，純化起搏樣細胞；對干細胞定向分化為起搏樣細胞的主要機制還有待深入地研究和探討，從而更好地調控干細胞向起搏樣細胞的定向分化；三維條件下細胞誘導分化、在體條件下的動物實驗也是下一步研究的方向。