內質網(ER)通過被稱為"線粒體結合內質網膜(MAMs)"的結構域與線粒體外膜相連。MAMs在細胞內具有重要作用,包括Ca2+信號傳遞、脂質轉運、線粒體分裂融合及能量代謝等。如果這些功能失調則可能導致相關疾病的發生。為此,本文綜述了MAMs的結構、功能及其相應的檢測方法,同時介紹了MAMs在神經退行性疾病、肥胖、腫瘤及心血管疾病中的作用以及相關研究進展。研究提示在臨床相關疾病治療中,MAMs可能作為潛在的治療靶點。
引用本文： 吳思媛, 劉小菁. 線粒體結合內質網膜及其在疾病中作用的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2016, 33(2): 388-393. doi: 10.7507/1001-5515.20160066 復制
引言
內質網(endoplasmic reticulum,ER)是細胞內最大的膜性細胞器，能夠與細胞內的其他膜性結構相互作用；其中,線粒體與ER相連接的部分研究得較為深入和廣泛。
ER和線粒體通過線粒體結合內質網膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)相連。研究顯示，MAMs是特化的內質網膜上的亞區域(subdomain)或稱微結構域(microdomain)，富含膽固醇、鞘磷脂及蛋白質，并能抵抗非離子去垢劑的抽提，是細胞內動態的脂筏樣結構域(raft-like domain)。MAMs在ER與線粒體間進行Ca2+信號傳導、脂質交換等過程中起關鍵作用，參與細胞的Ca2+信號、脂質轉運、線粒體分裂和融合、炎癥小體及自噬小體的形成等[1]。此外，MAMs的組成成分及結構是動態的，隨著細胞處于不同的應激狀態如內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)而改變。一些定位于MAMs上調節Ca2+穩態的分子伴侶(chaperone)，能通過調節Ca2+轉移引起ER膜重構(membrane remodeling)，從而調控ER穩態。這些重要、獨特的生理過程提示了MAMs結構、功能改變在多種疾病，如神經退行性疾病、肥胖、腫瘤及心血管疾病等病理過程中有重要作用，而MAMs結構域中的分子可能成為這些疾病治療的靶點。
1 MAMs的結構
1.1 MAMs的結構簡介
1990年，Vance等[2]通過生物化學的方法從大鼠肝臟中分離出一種細胞內膜結構并將其定義為MAMs。
活細胞成像技術如3D重建和電子斷層掃描(electron tomography,CT)的相關研究表明，僅線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)的一小部分區域(大約12%)是與ER相關的。ER和OMM間的距離最初被認為在100 nm左右；隨后，高速數字成像顯微鏡和CT技術揭示兩者之間的距離可以縮短到10～25 nm，這個距離促使ER上的蛋白能夠直接與OMM上的蛋白與脂質相互作用。盡管ER和線粒體間形成了特定的接觸區域，但它們并不會融合，而是維持各自細胞器固有的結構。MAMs的結構示意圖如圖 1所示。
圖1
MAMs的結構示意圖
Figure1.
Schematic representation of MAMs
1.2 MAMs結構的研究方法
電子顯微鏡是測定ER與線粒體間物理距離、接觸數量及交界長度最直接的方法，該方法還可以與薄層CT聯用進行3D分析。但該技術具有一定局限性，即并不適用于對ER與線粒體間的結構進行常規測定[3]。因此，一種新的方法——三磷酸肌醇受體-電壓依賴性陰離子通道(inositol 1,4,5 triphosphate receptor-voltage dependent anion channel,IP3R-VDAC)鄰位連接技術(proximity ligation assay,PLA)的出現對于分析MAMs的結構應用前景廣闊[4]。此外，應用免疫熒光技術分別標記ER和線粒體是另一種常用的觀察MAMs的方法[5]，但該技術并不能反映ER與線粒體接觸的實際情況。
1.3 MAMs的組成
MAMs是一個高度動態變化的結構域，具有多種類型的蛋白質以適應細胞的需求。現已相繼發現大量ER和線粒體相關蛋白，主要包括：①位于ER或OMM上的Ca2+通道，如三磷酸肌醇受體和電壓依賴性陰離子通道1；②脂質合成及轉移酶類，如磷脂酰乙醇胺甲基轉移酶2(phosphatidylethanolamine methyltransferase 2,PEMT2)和磷脂酰絲氨酸合成酶2(phosphatidylserine synthases 2,PSS2)；③多種分子伴侶，如葡萄糖調節蛋白75(glucose-regulated protein 75,GRP75)、鈣聯蛋白(calnexin,CNX)、鈣網蛋白(calreticulin,CRT)；④內質網應激感受器：蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)；⑤線粒體分裂融合相關蛋白，如線粒體分裂蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)和線粒體融合蛋白2(mitofusin 2,MFN2)；⑥ER分選蛋白：磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸分選蛋白2(phosphofurin acidic cluster sorting protein-2,PACS-2)[6]。
盡管在不同類型的細胞中都發現了MAMs上的相關蛋白，但目前尚不清楚在不同的細胞中，ER與線粒體間的連接區域是否都由相同的蛋白組成。
2 MAMs的分離純化及功能
2.1 MAMs的分離純化
MAMs是脂筏樣結構域，富含有膽固醇和鞘磷脂。因此相比于游離的ER，MAMs的密度較低，也使其能夠與ER分離[7]。最早分離MAMs的方法來自Vance實驗室，他們首先通過差速離心得到粗線粒體(crude mitochondrion,CM)，其中主要包含線粒體、MAMs及其它膜成分；然后通過密度梯度和超速離心得到了MAMs[2]。隨后，分離MAMs的方法逐步被規范化，Wieckowski等[8]詳細報道了如何從動物組織和細胞中分離MAMs和線粒體；Paillard等[9]描述了如何從心臟組織中分離MAMs。根據細胞和組織類型的不同，相應的步驟也可以進行適當的調整。具體的分離步驟參考相應文獻[7-8]。
2.2 MAMs的功能
MAMs不僅是ER和線粒體間蛋白連接的橋梁，也是這兩種細胞器間代謝物和信號分子功能轉運的橋梁，在決定細胞命運的過程中具有重要作用。
2.2.1 調節Ca2+轉運
線粒體基質中Ca2+濃度處于快速的變化中，但線粒體內膜上轉運Ca2+進入線粒體的單向傳遞體(mitochondrial calcium uniporter,MCU)對Ca2+的親和性低，而MAMs的存在使Ca2+能夠順利地進入線粒體[1]。
ER是細胞內主要的鈣庫，在受到外界刺激時能釋放Ca2+進入胞質，線粒體由于與ER空間位置上的接近，也能吸收大量的Ca2+。許多MAMs定位蛋白通過與ER或線粒體固有蛋白相互作用，或改變ER與線粒體連接區的結構調節Ca2+轉運和細胞凋亡[10]。
2.2.2 控制線粒體的分裂和融合
線粒體是一個動態細胞器，不停地經歷分裂和融合。這兩個相反的過程使線粒體的形態、大小、數量及功能時刻處于動態平衡中。
線粒體分裂過程中，內質網小管逐漸包裹線粒體使線粒體形成壓縮區；當線粒體幾乎被內質網包圍時，MAMs上的內質網定位蛋白(inverted formin 2,INF2)被激活以聚合肌動蛋白；肌動蛋白的多聚化不僅為線粒體的進一步壓縮提供驅動力，同時能使與線粒體裂變因子(mitochondrial fission factor,MFF)相互作用的動力蛋白DRP1從胞質轉位到線粒體裂變區，啟動分裂[1]。
線粒體融合主要由線粒體融合蛋白1(mitofusins 1,MFN1)和MFN2調節。MFN1在線粒體融合中起關鍵作用，而MFN2主要維持整個線粒體網膜的穩定。MFN2不僅定位于線粒體，也存在于ER和MAMs，其對于ER與線粒體的連接及穩定MAMs的形成至關重要[11]。
2.2.3 調節脂質的合成及轉運
MAMs是富含脂質代謝相關蛋白的ER亞結構域。參與脂質合成的物質，如磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)和磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)，同時存在于ER和線粒體上。磷脂酸(phosphatidic acid,PA)在MAMs定位酶(phosphatidylserine synthases 1/2,PSS1/PSS2)的催化下形成PS，PS轉位至線粒體，又在磷脂酰絲氨酸脫羧酶(phosphatidylserine decarboxylase,PSD)的作用下合成磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)，PE又返回ER，被另一個MAMs駐留蛋白——PEMT2催化為PC[12]。此外，合成三酰甘油的酶類，如脂肪酸輔酶A連接酶4(fatty acid-CoA ligase 4,FACL4)、脂酰輔酶A(acyl-coenzyme A,acyl-CoA)及二酰基甘油酰基轉移酶(diacylgycerol acyltransferase,DGAT)等也定位于MAMs。ER上的膽固醇也可以通過MAMs轉移至線粒體，在細胞色素P450的作用下形成類固醇。不僅如此，MAMs在鞘脂類的代謝過程中也具有重要作用[13]。
2.2.4 參與內質網應激
ERS是ER在各種因素(如缺血缺氧、氧化應激、Ca2+損耗等)刺激下導致ER中未折疊或錯誤折疊的蛋白質積累從而引起的典型救援反應。ERS能誘發ER膜上的三種跨膜蛋白——PERK、需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1α)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)激活，啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)以減輕過剩的蛋白質負荷，但持續性的ERS會引起細胞凋亡[14]。因此，MAMs亦參與調控ERS及ERS相關的凋亡。
研究報道，PERK亦存在于MAMs，并能夠增加ER和線粒體間的距離。敲除MFN2能誘發ERS，增強UPR三條通路的活性，并減弱ERS相關的自噬和凋亡。MFN2還能與PERK相互作用，對PERK進行負調控[15]。另外，MAMs駐留分子伴侶Sigma-1受體(Sigma-1 receptor chaperone,Sig-1R)也與ERS有關，其能穩定IRE1α，促進細胞存活[16]。
2.3 MAMs功能的研究方法
2.3.1 檢測Ca2+濃度瞬時變化
活細胞內檢測Ca2+濃度瞬時變化的基本原理是應用不同熒光探針分別標記ER和線粒體的Ca2+，用激光共聚焦顯微鏡監測在激動劑(如組胺)刺激下，從ER進入線粒體的Ca2+變化[17-18]。
2.3.2 檢測脂質交換
在哺乳動物體內，PA在PSS1/2的作用下形成PS，PS轉位至線粒體，然后在PSD的催化下形成PE。而PS向PE的轉換表明了ER與線粒體間交流的程度，所以可以采用PS與PE的比值(PS/PE)或線粒體PS的含量，對脂質轉移進行定量分析，進一步反映MAMs的功能。在檢測過程中，首先需要應用放射性同位素標記脂質，然后通過薄層色譜或質譜進行鑒定和定量分析[7]。
2.3.3 檢測線粒體功能
①線粒體氧消耗：線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，其主要功能是通過呼吸鏈氧化磷酸化產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)供細胞進行各種生命活動。測定線粒體氧消耗，能間接反映線粒體的功能，主要是采用Seahorse技術測定有氧呼吸氧氣消耗速率(oxygen consumption rate,OCR)[19]，其基本原理是通過靶向線粒體電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)中的各個復合物揭示代謝功能隨時間的變化；也可以采用氧電極進行監測[20]。
②線粒體膜電位：線粒體內負外正的膜電位是線粒體發揮正常功能的前提。線粒體膜電位變化可以采用膜片鉗技術測定，也可以采用JC-1、羅丹明123(Rhodamine123,Rh123)、DioC6等熒光探針，通過熒光顏色的轉變或熒光信號的強弱來檢測線粒體膜電位的變化[21]。
③線粒體活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的產生：ROS主要是由線粒體呼吸鏈產生的一系列活性氧物質，包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基(-OH)等。過多的ROS會使機體出現氧化應激，破壞線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)，造成線粒體ATP合成減少等線粒體結構和功能的改變。因此ROS增多可以作為線粒體功能受損的一個指標[22]。
ROS可以采用熒光探針二氯二氫熒光素二乙酯(chloromethyl 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,CM-H2DCFDA)、二氫乙啶(Dihydroethidium,DHE)、雙氫羅丹明123(Dihydrorhodamine123,DHR123)、線粒體超氧化物熒光探針(mitochondrial superoxide indicator,MitoSOX)等進行測定，根據熒光信號的強弱測定ROS的含量。
3 MAMs與疾病
研究表明，MAMs結構和功能的改變與很多疾病的病理過程相關，MAMs功能紊亂可能是某些疾病發生的重要先兆。
3.1 MAMs與神經退行性疾病
神經元是高度極化的細胞，需要很強的能量供應，而線粒體是細胞內產生ATP的主要場所，因此線粒體在軸突及樹突中的分布對神經元的存活起決定作用。此外，線粒體Ca2+穩態失衡可能是把神經元功能紊亂和MAMs-線粒體間結構或功能破壞聯系起來的一個潛在因素[23]。
在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發病過程中，MAMs的結構和功能均發生了改變[24]。AD患者中，β-淀粉樣蛋白在MAMs上大量沉積，而β-淀粉樣蛋白是由早老蛋白1和2(presenilin1/2,PS1/2)酶切淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)而形成[25]。PS1/2主要定位于MAMs，而這兩種蛋白在AD患者中也發生了突變或被異常調節。
另一種神經退行性疾病帕金森綜合征(Parkinson’s disease,PD)，也與MAMs功能失調有關。Parkin和第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)若發生基因突變能誘發假定蛋白激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)表達，導致家族性PD的發生。α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在PD的病理過程中也具有重要作用。α-Syn主要存在于胞質和線粒體，然而野生型α-Syn位于MAMs，而非線粒體上，其突變會引起其與MAMs的接觸減少[26]。Calì等[27]通過在Hela細胞中過表達α-Syn，發現從ER流入線粒體的Ca2+含量增加，證實α-Syn通過增加MAMs的含量調節線粒體Ca2+穩態。
3.2 MAMs與肥胖及心血管疾病
線粒體功能失調和ERS在肥胖相關并發癥(如胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病等)的發生發展中起到關鍵作用。
肥胖和肥胖相關代謝疾病發生過程中，會導致ERS和線粒體功能紊亂的增強[28-29]。然而，線粒體和ER又是通過MAMs相連，線粒體功能失調必然會影響ER的功能，反之亦然。在3T3L1脂肪細胞中，線粒體功能受損后會激活ERS；高脂飲食(high fat diet,HFD)喂養的小鼠也同時發生了線粒體功能障礙和ERS [30]。
Arruda等[19]研究發現，肥胖小鼠肝臟中MAMs發生重排，聚集增加，同時伴隨線粒體Ca2+超載及線粒體功能失調。然而，并非所有研究都認為MAMs的增加是不利的，近來Schneeberger等[31]證明在下丘腦阿片黑素細胞皮質激素原(pro-opiomelanocortin,POMC)神經元中下調MFN2的表達會引起MAMs的減少、ERS誘發的瘦素抵抗、能量代謝緩慢及肥胖。
心血管疾病與肥胖、代謝綜合征、胰島素抵抗及Ⅱ型糖尿病有關。研究發現，在乳鼠原代心肌細胞中，胰島素能誘發Ca2+釋放，進而被線粒體吸收；而用去甲腎上腺素(norepinephrine,Ne)處理心肌細胞后，ER和線粒體間距離增加，線粒體Ca2+攝入增加，蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)磷酸化及葡萄糖的進入減少，提示有胰島素抵抗的發生[32]。
3.3 MAMs與腫瘤
早幼粒細胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia,PML)是一種細胞核腫瘤抑制因子，同時也是一種凋亡調節分子。在多種腫瘤(如急性早幼粒細胞白血病、乳腺癌、小細胞肺癌)中，PML功能有缺失或缺陷。研究發現，細胞核外，PML定位于MAMs上，通過與磷酸酶2A相互作用調節Akt依賴的IP3R磷酸化。而IP3R的磷酸化狀態是決定有多少Ca2+從ER流入線粒體的一個重要因素，過多的Ca2+攝入導致線粒體Ca2+超載，引發線粒體相關凋亡的發生。同樣地，定位于MAMs上的PTEN也能影響Akt/IP3R信號通路[10]，提示MAMs可能是決定腫瘤細胞命運的重要結構。
在生長因子刺激下，雷帕霉素復合物2(mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2)會在MAMs上富集，通過與IP3R-GRP75-VDAC1復合物相互作用調控線粒體功能[33]。此外，在乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中表達下調的一種角蛋白連接蛋白(trichoplein/mitostatin,TpMs)也能定位于MAMs，通過與MFN2相互作用調節Ca2+信號[34]。
3.4 MAMs與其它疾病
ATP結合盒蛋白(ATP binding cassette transporter C6,ABCC6)突變能引起結締組織病變，導致彈性纖維假黃瘤。最初ABCC6被認為定位于肝、腎細胞的細胞膜上，而Martin等[35]研究發現其主要位于MAMs，且ABCC6敲除鼠表現出線粒體大小、數量及結構的改變，同時線粒體氧消耗速率減少。另一個能調節MAMs功能的蛋白是網狀組織蛋白4B(reticulon-4B,Nogo-B)。Sutendra等[36]報道了肺動脈高壓患者肺動脈中Nogo-B的表達水平是正常人的兩倍；在肺動脈高壓時，Nogo-B的升高與MAMs的功能改變及凋亡抑制有關。
4 總結
越來越多的證據表明：MAMs作為細胞內兩個重要細胞器間的連接區域，起到調控兩者間物質交換和多種反應的關鍵作用。然而，目前仍不清楚在疾病過程中ER與線粒體間交流的具體機制，即MAMs是如何對疾病的發生發展產生影響。所以，對MAMs動態結構進一步的研究會促進對MAMs功能及其在疾病病理過程中作用的了解，為以后的疾病治療提供相關的基礎及潛在的靶分子。
引言
內質網(endoplasmic reticulum,ER)是細胞內最大的膜性細胞器，能夠與細胞內的其他膜性結構相互作用；其中,線粒體與ER相連接的部分研究得較為深入和廣泛。
ER和線粒體通過線粒體結合內質網膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes,MAMs)相連。研究顯示，MAMs是特化的內質網膜上的亞區域(subdomain)或稱微結構域(microdomain)，富含膽固醇、鞘磷脂及蛋白質，并能抵抗非離子去垢劑的抽提，是細胞內動態的脂筏樣結構域(raft-like domain)。MAMs在ER與線粒體間進行Ca2+信號傳導、脂質交換等過程中起關鍵作用，參與細胞的Ca2+信號、脂質轉運、線粒體分裂和融合、炎癥小體及自噬小體的形成等[1]。此外，MAMs的組成成分及結構是動態的，隨著細胞處于不同的應激狀態如內質網應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)而改變。一些定位于MAMs上調節Ca2+穩態的分子伴侶(chaperone)，能通過調節Ca2+轉移引起ER膜重構(membrane remodeling)，從而調控ER穩態。這些重要、獨特的生理過程提示了MAMs結構、功能改變在多種疾病，如神經退行性疾病、肥胖、腫瘤及心血管疾病等病理過程中有重要作用，而MAMs結構域中的分子可能成為這些疾病治療的靶點。
1 MAMs的結構
1.1 MAMs的結構簡介
1990年，Vance等[2]通過生物化學的方法從大鼠肝臟中分離出一種細胞內膜結構并將其定義為MAMs。
活細胞成像技術如3D重建和電子斷層掃描(electron tomography,CT)的相關研究表明，僅線粒體外膜(outer mitochondrial membrane,OMM)的一小部分區域(大約12%)是與ER相關的。ER和OMM間的距離最初被認為在100 nm左右；隨后，高速數字成像顯微鏡和CT技術揭示兩者之間的距離可以縮短到10～25 nm，這個距離促使ER上的蛋白能夠直接與OMM上的蛋白與脂質相互作用。盡管ER和線粒體間形成了特定的接觸區域，但它們并不會融合，而是維持各自細胞器固有的結構。MAMs的結構示意圖如圖 1所示。
圖1
MAMs的結構示意圖
Figure1.
Schematic representation of MAMs
1.2 MAMs結構的研究方法
電子顯微鏡是測定ER與線粒體間物理距離、接觸數量及交界長度最直接的方法，該方法還可以與薄層CT聯用進行3D分析。但該技術具有一定局限性，即并不適用于對ER與線粒體間的結構進行常規測定[3]。因此，一種新的方法——三磷酸肌醇受體-電壓依賴性陰離子通道(inositol 1,4,5 triphosphate receptor-voltage dependent anion channel,IP3R-VDAC)鄰位連接技術(proximity ligation assay,PLA)的出現對于分析MAMs的結構應用前景廣闊[4]。此外，應用免疫熒光技術分別標記ER和線粒體是另一種常用的觀察MAMs的方法[5]，但該技術并不能反映ER與線粒體接觸的實際情況。
1.3 MAMs的組成
MAMs是一個高度動態變化的結構域，具有多種類型的蛋白質以適應細胞的需求。現已相繼發現大量ER和線粒體相關蛋白，主要包括：①位于ER或OMM上的Ca2+通道，如三磷酸肌醇受體和電壓依賴性陰離子通道1；②脂質合成及轉移酶類，如磷脂酰乙醇胺甲基轉移酶2(phosphatidylethanolamine methyltransferase 2,PEMT2)和磷脂酰絲氨酸合成酶2(phosphatidylserine synthases 2,PSS2)；③多種分子伴侶，如葡萄糖調節蛋白75(glucose-regulated protein 75,GRP75)、鈣聯蛋白(calnexin,CNX)、鈣網蛋白(calreticulin,CRT)；④內質網應激感受器：蛋白激酶R樣內質網激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)；⑤線粒體分裂融合相關蛋白，如線粒體分裂蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)和線粒體融合蛋白2(mitofusin 2,MFN2)；⑥ER分選蛋白：磷酸弗林蛋白酶酸性氨基酸分選蛋白2(phosphofurin acidic cluster sorting protein-2,PACS-2)[6]。
盡管在不同類型的細胞中都發現了MAMs上的相關蛋白，但目前尚不清楚在不同的細胞中，ER與線粒體間的連接區域是否都由相同的蛋白組成。
2 MAMs的分離純化及功能
2.1 MAMs的分離純化
MAMs是脂筏樣結構域，富含有膽固醇和鞘磷脂。因此相比于游離的ER，MAMs的密度較低，也使其能夠與ER分離[7]。最早分離MAMs的方法來自Vance實驗室，他們首先通過差速離心得到粗線粒體(crude mitochondrion,CM)，其中主要包含線粒體、MAMs及其它膜成分；然后通過密度梯度和超速離心得到了MAMs[2]。隨后，分離MAMs的方法逐步被規范化，Wieckowski等[8]詳細報道了如何從動物組織和細胞中分離MAMs和線粒體；Paillard等[9]描述了如何從心臟組織中分離MAMs。根據細胞和組織類型的不同，相應的步驟也可以進行適當的調整。具體的分離步驟參考相應文獻[7-8]。
2.2 MAMs的功能
MAMs不僅是ER和線粒體間蛋白連接的橋梁，也是這兩種細胞器間代謝物和信號分子功能轉運的橋梁，在決定細胞命運的過程中具有重要作用。
2.2.1 調節Ca2+轉運
線粒體基質中Ca2+濃度處于快速的變化中，但線粒體內膜上轉運Ca2+進入線粒體的單向傳遞體(mitochondrial calcium uniporter,MCU)對Ca2+的親和性低，而MAMs的存在使Ca2+能夠順利地進入線粒體[1]。
ER是細胞內主要的鈣庫，在受到外界刺激時能釋放Ca2+進入胞質，線粒體由于與ER空間位置上的接近，也能吸收大量的Ca2+。許多MAMs定位蛋白通過與ER或線粒體固有蛋白相互作用，或改變ER與線粒體連接區的結構調節Ca2+轉運和細胞凋亡[10]。
2.2.2 控制線粒體的分裂和融合
線粒體是一個動態細胞器，不停地經歷分裂和融合。這兩個相反的過程使線粒體的形態、大小、數量及功能時刻處于動態平衡中。
線粒體分裂過程中，內質網小管逐漸包裹線粒體使線粒體形成壓縮區；當線粒體幾乎被內質網包圍時，MAMs上的內質網定位蛋白(inverted formin 2,INF2)被激活以聚合肌動蛋白；肌動蛋白的多聚化不僅為線粒體的進一步壓縮提供驅動力，同時能使與線粒體裂變因子(mitochondrial fission factor,MFF)相互作用的動力蛋白DRP1從胞質轉位到線粒體裂變區，啟動分裂[1]。
線粒體融合主要由線粒體融合蛋白1(mitofusins 1,MFN1)和MFN2調節。MFN1在線粒體融合中起關鍵作用，而MFN2主要維持整個線粒體網膜的穩定。MFN2不僅定位于線粒體，也存在于ER和MAMs，其對于ER與線粒體的連接及穩定MAMs的形成至關重要[11]。
2.2.3 調節脂質的合成及轉運
MAMs是富含脂質代謝相關蛋白的ER亞結構域。參與脂質合成的物質，如磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PC)和磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)，同時存在于ER和線粒體上。磷脂酸(phosphatidic acid,PA)在MAMs定位酶(phosphatidylserine synthases 1/2,PSS1/PSS2)的催化下形成PS，PS轉位至線粒體，又在磷脂酰絲氨酸脫羧酶(phosphatidylserine decarboxylase,PSD)的作用下合成磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine,PE)，PE又返回ER，被另一個MAMs駐留蛋白——PEMT2催化為PC[12]。此外，合成三酰甘油的酶類，如脂肪酸輔酶A連接酶4(fatty acid-CoA ligase 4,FACL4)、脂酰輔酶A(acyl-coenzyme A,acyl-CoA)及二酰基甘油酰基轉移酶(diacylgycerol acyltransferase,DGAT)等也定位于MAMs。ER上的膽固醇也可以通過MAMs轉移至線粒體，在細胞色素P450的作用下形成類固醇。不僅如此，MAMs在鞘脂類的代謝過程中也具有重要作用[13]。
2.2.4 參與內質網應激
ERS是ER在各種因素(如缺血缺氧、氧化應激、Ca2+損耗等)刺激下導致ER中未折疊或錯誤折疊的蛋白質積累從而引起的典型救援反應。ERS能誘發ER膜上的三種跨膜蛋白——PERK、需肌醇酶1(inositol-requiring enzyme 1,IRE1α)和活化轉錄因子6(activating transcription factor 6,ATF6)激活，啟動未折疊蛋白反應(unfolded protein response,UPR)以減輕過剩的蛋白質負荷，但持續性的ERS會引起細胞凋亡[14]。因此，MAMs亦參與調控ERS及ERS相關的凋亡。
研究報道，PERK亦存在于MAMs，并能夠增加ER和線粒體間的距離。敲除MFN2能誘發ERS，增強UPR三條通路的活性，并減弱ERS相關的自噬和凋亡。MFN2還能與PERK相互作用，對PERK進行負調控[15]。另外，MAMs駐留分子伴侶Sigma-1受體(Sigma-1 receptor chaperone,Sig-1R)也與ERS有關，其能穩定IRE1α，促進細胞存活[16]。
2.3 MAMs功能的研究方法
2.3.1 檢測Ca2+濃度瞬時變化
活細胞內檢測Ca2+濃度瞬時變化的基本原理是應用不同熒光探針分別標記ER和線粒體的Ca2+，用激光共聚焦顯微鏡監測在激動劑(如組胺)刺激下，從ER進入線粒體的Ca2+變化[17-18]。
2.3.2 檢測脂質交換
在哺乳動物體內，PA在PSS1/2的作用下形成PS，PS轉位至線粒體，然后在PSD的催化下形成PE。而PS向PE的轉換表明了ER與線粒體間交流的程度，所以可以采用PS與PE的比值(PS/PE)或線粒體PS的含量，對脂質轉移進行定量分析，進一步反映MAMs的功能。在檢測過程中，首先需要應用放射性同位素標記脂質，然后通過薄層色譜或質譜進行鑒定和定量分析[7]。
2.3.3 檢測線粒體功能
①線粒體氧消耗：線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，其主要功能是通過呼吸鏈氧化磷酸化產生三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)供細胞進行各種生命活動。測定線粒體氧消耗，能間接反映線粒體的功能，主要是采用Seahorse技術測定有氧呼吸氧氣消耗速率(oxygen consumption rate,OCR)[19]，其基本原理是通過靶向線粒體電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)中的各個復合物揭示代謝功能隨時間的變化；也可以采用氧電極進行監測[20]。
②線粒體膜電位：線粒體內負外正的膜電位是線粒體發揮正常功能的前提。線粒體膜電位變化可以采用膜片鉗技術測定，也可以采用JC-1、羅丹明123(Rhodamine123,Rh123)、DioC6等熒光探針，通過熒光顏色的轉變或熒光信號的強弱來檢測線粒體膜電位的變化[21]。
③線粒體活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的產生：ROS主要是由線粒體呼吸鏈產生的一系列活性氧物質，包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基(-OH)等。過多的ROS會使機體出現氧化應激，破壞線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)，造成線粒體ATP合成減少等線粒體結構和功能的改變。因此ROS增多可以作為線粒體功能受損的一個指標[22]。
ROS可以采用熒光探針二氯二氫熒光素二乙酯(chloromethyl 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate,CM-H2DCFDA)、二氫乙啶(Dihydroethidium,DHE)、雙氫羅丹明123(Dihydrorhodamine123,DHR123)、線粒體超氧化物熒光探針(mitochondrial superoxide indicator,MitoSOX)等進行測定，根據熒光信號的強弱測定ROS的含量。
3 MAMs與疾病
研究表明，MAMs結構和功能的改變與很多疾病的病理過程相關，MAMs功能紊亂可能是某些疾病發生的重要先兆。
3.1 MAMs與神經退行性疾病
神經元是高度極化的細胞，需要很強的能量供應，而線粒體是細胞內產生ATP的主要場所，因此線粒體在軸突及樹突中的分布對神經元的存活起決定作用。此外，線粒體Ca2+穩態失衡可能是把神經元功能紊亂和MAMs-線粒體間結構或功能破壞聯系起來的一個潛在因素[23]。
在阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)發病過程中，MAMs的結構和功能均發生了改變[24]。AD患者中，β-淀粉樣蛋白在MAMs上大量沉積，而β-淀粉樣蛋白是由早老蛋白1和2(presenilin1/2,PS1/2)酶切淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP)而形成[25]。PS1/2主要定位于MAMs，而這兩種蛋白在AD患者中也發生了突變或被異常調節。
另一種神經退行性疾病帕金森綜合征(Parkinson’s disease,PD)，也與MAMs功能失調有關。Parkin和第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)若發生基因突變能誘發假定蛋白激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1)表達，導致家族性PD的發生。α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-Syn)在PD的病理過程中也具有重要作用。α-Syn主要存在于胞質和線粒體，然而野生型α-Syn位于MAMs，而非線粒體上，其突變會引起其與MAMs的接觸減少[26]。Calì等[27]通過在Hela細胞中過表達α-Syn，發現從ER流入線粒體的Ca2+含量增加，證實α-Syn通過增加MAMs的含量調節線粒體Ca2+穩態。
3.2 MAMs與肥胖及心血管疾病
線粒體功能失調和ERS在肥胖相關并發癥(如胰島素抵抗、Ⅱ型糖尿病等)的發生發展中起到關鍵作用。
肥胖和肥胖相關代謝疾病發生過程中，會導致ERS和線粒體功能紊亂的增強[28-29]。然而，線粒體和ER又是通過MAMs相連，線粒體功能失調必然會影響ER的功能，反之亦然。在3T3L1脂肪細胞中，線粒體功能受損后會激活ERS；高脂飲食(high fat diet,HFD)喂養的小鼠也同時發生了線粒體功能障礙和ERS [30]。
Arruda等[19]研究發現，肥胖小鼠肝臟中MAMs發生重排，聚集增加，同時伴隨線粒體Ca2+超載及線粒體功能失調。然而，并非所有研究都認為MAMs的增加是不利的，近來Schneeberger等[31]證明在下丘腦阿片黑素細胞皮質激素原(pro-opiomelanocortin,POMC)神經元中下調MFN2的表達會引起MAMs的減少、ERS誘發的瘦素抵抗、能量代謝緩慢及肥胖。
心血管疾病與肥胖、代謝綜合征、胰島素抵抗及Ⅱ型糖尿病有關。研究發現，在乳鼠原代心肌細胞中，胰島素能誘發Ca2+釋放，進而被線粒體吸收；而用去甲腎上腺素(norepinephrine,Ne)處理心肌細胞后，ER和線粒體間距離增加，線粒體Ca2+攝入增加，蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)磷酸化及葡萄糖的進入減少，提示有胰島素抵抗的發生[32]。
3.3 MAMs與腫瘤
早幼粒細胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia,PML)是一種細胞核腫瘤抑制因子，同時也是一種凋亡調節分子。在多種腫瘤(如急性早幼粒細胞白血病、乳腺癌、小細胞肺癌)中，PML功能有缺失或缺陷。研究發現，細胞核外，PML定位于MAMs上，通過與磷酸酶2A相互作用調節Akt依賴的IP3R磷酸化。而IP3R的磷酸化狀態是決定有多少Ca2+從ER流入線粒體的一個重要因素，過多的Ca2+攝入導致線粒體Ca2+超載，引發線粒體相關凋亡的發生。同樣地，定位于MAMs上的PTEN也能影響Akt/IP3R信號通路[10]，提示MAMs可能是決定腫瘤細胞命運的重要結構。
在生長因子刺激下，雷帕霉素復合物2(mammalian target of rapamycin complex 2,mTORC2)會在MAMs上富集，通過與IP3R-GRP75-VDAC1復合物相互作用調控線粒體功能[33]。此外，在乳腺癌、前列腺癌等腫瘤中表達下調的一種角蛋白連接蛋白(trichoplein/mitostatin,TpMs)也能定位于MAMs，通過與MFN2相互作用調節Ca2+信號[34]。
3.4 MAMs與其它疾病
ATP結合盒蛋白(ATP binding cassette transporter C6,ABCC6)突變能引起結締組織病變，導致彈性纖維假黃瘤。最初ABCC6被認為定位于肝、腎細胞的細胞膜上，而Martin等[35]研究發現其主要位于MAMs，且ABCC6敲除鼠表現出線粒體大小、數量及結構的改變，同時線粒體氧消耗速率減少。另一個能調節MAMs功能的蛋白是網狀組織蛋白4B(reticulon-4B,Nogo-B)。Sutendra等[36]報道了肺動脈高壓患者肺動脈中Nogo-B的表達水平是正常人的兩倍；在肺動脈高壓時，Nogo-B的升高與MAMs的功能改變及凋亡抑制有關。
4 總結
越來越多的證據表明：MAMs作為細胞內兩個重要細胞器間的連接區域，起到調控兩者間物質交換和多種反應的關鍵作用。然而，目前仍不清楚在疾病過程中ER與線粒體間交流的具體機制，即MAMs是如何對疾病的發生發展產生影響。所以，對MAMs動態結構進一步的研究會促進對MAMs功能及其在疾病病理過程中作用的了解，為以后的疾病治療提供相關的基礎及潛在的靶分子。
