水凝膠是一種能夠在體外模擬細胞外基質的新型高分子聚合生物材料。水凝膠本身具有生物惰性, 通過對其理化性質和生物學特性進行精確設計, 能夠在體外為細胞生長和新生組織形成提供機械支持和發育引導。本文主要介紹了水凝膠的設計、性能及其在組織工程與再生醫學、藥物遞送、干細胞培養與細胞療法方面的應用。
引用本文： 葛麗, 劉立偉, 蔣麗娜, 宋文剛. 水凝膠的性能及其在生物醫學中的應用. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(6): 1369-1373. doi: 10.7507/1001-5515.20150242 復制
0 引言
水凝膠是一種由親水性聚合物鏈交聯所形成的三維(three-dimension, 3D)網絡結構。通過對其理化性質和生物學特性進行精確設計，水凝膠能夠在體外高度模擬天然細胞外基質(extracellular matrix，ECM)環境，對細胞的生命活動和組織再生過程進行合理調控。近年來，水凝膠已經應用于生物醫學領域的多個方面，尤其是在組織工程與再生醫學、藥物遞送、干細胞培養與細胞療法等方面取得了重大突破。
1 水凝膠的設計及性能
為使水凝膠具有細胞相容性，通常需要利用生長因子等生物活性分子對凝膠進行修飾，修飾后的凝膠有利于人體內源性細胞的補充、局部組織形成和細胞分化的控制[1]。生長因子修飾凝膠的最直接的方法是將其與凝膠前體溶液混合，但這種方法會導致生長因子迅速耗盡，縮短了其作用時間。研究發現，將生長因子封裝在微球內可以對其實現有效控釋，以發揮更好的生物活性作用。Wang等[2]將血管內皮生長因子和腦源性神經營養因子包埋于微球中再與凝膠結合，其持續釋放時間可以長達30 d，足以支持神經干細胞的存活。
利用ECM蛋白或短肽修飾凝膠可以使其具有生物黏附性，如使凝膠與來自纖維連接蛋白細胞結合域中央的細胞黏附肽結合，這可為細胞提供一種能與凝膠黏附的生物功能位點[3]。但是，最新研究發現，這種改良方法會破壞凝膠內部的分子結構[4]。Ino等[4]用輝光放電技術對聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)水凝膠進行表面改性，其優越性在于不改變PVA的主要特性，同時可以促進細胞對PVA的黏附。
凝膠制備過程中，通過改變聚合物濃度、交聯密度、交聯時間以及交聯劑的種類、濃度、用量，均可實現對凝膠機械特性的調控。利用凝膠的機械特性，可以向細胞傳導重要的生物物理信號，從而調節機體的平衡狀態、組織形態發生、細胞的生長和分化。Murphy等[5]研究發現，骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的發育過程與凝膠的硬度有密切關系，在一定的凝膠硬度范圍內，高硬度的凝膠能夠促進BMSCs向成骨細胞分化，而低硬度的凝膠則有利于BMSCs分化成脂肪細胞。
水凝膠能夠運輸疏水或親水分子，這有利于臨床治療中藥物緩釋的實現。根據使用藥物的性質來改變凝膠的網格大小以控制藥物的釋放。多數水凝膠的網格大小在溶脹狀態下不小于5 nm，遠遠超過大多數藥物小分子的尺寸，有利于藥物在凝膠中的擴散[6]。對于比較大的蛋白質或多肽藥物分子，可以對凝膠的結構和網格尺寸進行設計來控制細胞的機械運動和調節藥物的動力學釋放。
水凝膠在一定的物理或化學因素下可進行降解，即生物降解性，通過控制可降解凝膠在體內吸收和/或局部降解的速率可以調節細胞的形態發生和分化[7]。水凝膠的降解方式主要有物理降解和化學降解兩種。環境因素如溫度、pH值等的變化能夠誘導凝膠的物理降解。為實現凝膠降解過程中細胞發育有關的信號轉導過程，細胞內外的離子濃度經常發生波動[8-9]，因此，凝膠中離子濃度的變化也可以作為一種生物物理刺激因素來引導細胞形態發生。凝膠的化學降解通常是指將一些酶的底物序列摻入到凝膠基質中作為生物反應元件，以實現凝膠降解的酶促反應。研究表明，細胞分泌的蛋白酶如基質金屬蛋白酶(metalloprotease，MMP)、膠原酶、纖溶酶等，可以與凝膠骨架上相應的底物包括MMP敏感肽序列、膠原蛋白、纖維蛋白等發生反應，以促進ECM骨架的斷裂和位移，引導組織的形態發生[10]。Turturro等[10]發現，MMP敏感的雙丙烯酸凝膠對新生血管芽的形成方向具有明顯的導向作用。Anderson等[11]用巰基光聚合作用制作了帶有不同濃度MMP敏感肽的聚乙二醇[poly(ethylene glycol)，PEG]水凝膠，并研究了不同程度的凝膠降解對人間充質干細胞分化的影響。
2 水凝膠在生物醫學領域的應用
2.1 組織工程與再生醫學
生物材料的骨架結構在組織工程中扮演著重要作用，其能為細胞生長和新生組織形成提供機械支持和發育引導。在大量生物骨架系統中，水凝膠是組織工程中應用最廣泛的生物材料。
水凝膠的網格結構有利于肝組織再生過程中營養成分的交換[12]。在軟骨和骨組織工程中，膠原水凝膠可以作為一種免疫調節支架來影響軟骨的形成[13]。含有甘蔗糖蜜多聚糖的水凝膠，可運載骨形成蛋白，修復大鼠的顱骨損傷[14]。在凝膠中添加成纖維細胞生長因子能夠促進鼓膜的修復[15]，富含血清蛋白的水凝膠還能促進椎間盤損傷的修復[16]。如果能夠建立適當的具有生物功能的骨架結構，再生細胞便可以在損傷組織中積累，并對基質中所設計的刺激因素做出反應，以引導有利的治療過程發生。Diab等[17]研究表明，將封裝有骨形態發生蛋白-2的小體包埋在絲質凝膠中并注射在大鼠的長骨缺損處，可以引導骨的修復和再生。在神經組織工程中，具有特殊的溶脹和機械力學性能的藻朊酸鹽水凝膠，可以在體外培養神經組織[18]。
新生血管的形成是組織再生的基礎。Sun等[19]的實驗不僅證明了右旋糖酐水凝膠可以促進新生血管形成，而且實現了帶有完整皮膚附屬物的皮膚再生。值得注意的是，實驗用的右旋糖酐水凝膠中沒有添加額外的細胞因子、生長因子或細胞，單純利用水凝膠材料就能實現皮膚再生過程中的新生血管形成，更加顯示出水凝膠在組織發育引導方面的優勢。
2.2 藥物遞送
近年來研究發現，水凝膠還可以作為一種高效的物質遞送系統，向體內運輸小分子或蛋白質藥物、細胞因子、抗原、遺傳物質等，用于藥物開發和臨床治療[20-23]。水凝膠可以負載小分子或蛋白質藥物，并使藥物在體內進行擴散，因此，含有藥物的水凝膠在損傷部位可以作為一個持久釋放藥物的藥劑庫，不僅實現了藥物的有效控釋，還能提高藥物的利用率[20, 24]。此外，通過選擇可進行生物降解的水凝膠材料，甚至可以使凝膠控釋系統從體內清除，以此降低對機體的損傷。紫杉醇(paclitaxel，PTX)作為一種有效的抗腫瘤藥物備受關注，將PTX及時、準確地運送至腫瘤部位，對腫瘤治療的意義重大。Liu等[25]研究發現，利用負載PTX的自組裝多肽合成水凝膠可以有效地抑制人乳腺癌細胞的生長。進一步研究發現，凝膠的彈性與凝膠前體物質——自組裝多肽的濃度有很大的相關性。利用原子力顯微鏡、圓二色譜分析、動態光散射和流變學分析等技術對體外藥物釋放量進行檢測，結果顯示，具有高濃度多肽的水凝膠可以延長近一半的釋放時間，并且能夠更加有效地抑制腫瘤細胞增殖。
利用凝膠藥物遞送系統設計出的納米級血管注射劑，在神經損傷治療方面取得了顯著成效。神經系統的再生能力是有限的，中樞神經系統損傷，尤其是大腦的損傷更具毀滅性。由于血腦屏障的限制，加上有些口服藥物經過藥代學首關消除后血液循環中的有效藥物量明顯減少，因此傳統的口服或靜脈注射藥物并不能獲得理想的治療效果。水凝膠注射劑恰恰克服了這一難題，將藥物包裹成納米微粒封裝在凝膠中進行皮下注射(如圖 1所示)，凝膠可在病灶部位作為一種持續的藥物遞送系統釋放藥物，有助于獲得更好的治療效果[26]。此外，水凝膠還可用于心血管、代謝等相關疾病的細胞療法，如對動脈粥樣硬化[27]、肌肉萎縮癥[28]、糖尿病[29]等疾病的治療，均已取得顯著療效。
圖1
水凝膠的藥物遞送系統
(a)正常腦組織；(b)口服或靜脈注射藥物；(c)水凝膠注射劑遞送藥物
Figure1. Drug delivery system of hydrogel(a) normal brain tissue; (b) drugs with oral administration or intravenous injection; (c) drugs applying hydrogel injection
2.3 三維干細胞培養與干細胞療法
多能干細胞(pluripotent stem cells，PSCs)在醫學發展和臨床治療方面有著巨大的應用價值。然而，目前我們對PSCs的很多認識都來源于傳統的二維(two-dimension, 2D)細胞培養系統，細胞的形態和生理功能與其在體內天然的3D微環境生長時具有很大差距。因此，對3D培養微環境的研究能夠使我們進一步完善體外干細胞培養系統，更好地理解細胞在體內的潛在功能。Lou等[30]首次利用植物來源的纖絲化纖維素水凝膠培養人PSCs，結果表明，與傳統的2D培養系統相比，水凝膠作為可調節的3D培養基質能夠支持干細胞更持久地發育。此外，細胞在3D環境中添加纖維素酶比在2D環境中添加纖維素酶更容易增殖。在此基礎上，進一步研究發現，不同種類的水凝膠系統對干細胞的分化潛力會產生不同的影響[31-32]。BMSCs主要涉及骨損傷修復中軟骨的再生過程，若將人BMSCs培養在成分不同的水凝膠中來誘導其向軟骨細胞分化，其黏多糖的分泌量和軟骨相關基因的表達量是不同的[31]。Gilbert等[33]研究證明，成人肌肉干細胞在彈性模量大于106 kPa的硬質塑膠培養皿中培養一周，細胞通常會失去多能性并且大量死亡；然而，當將其培養在彈性模量為12 kPa并且具有生物活性的化學交聯PEG水凝膠中時，細胞能夠在體外高效增殖，并且在植入體內后能夠獲得更高的成活率。這些研究提示我們，水凝膠培養系統的差異性在精確控制干細胞分化方面具有重要意義，即合理選擇損傷填充物可以獲得更加理想的治療效果。
3 前景與展望
水凝膠作為一種極具發展前景的生物材料已在生物醫學領域的多個方面產生了巨大的影響。例如，可以用水凝膠治療組織損傷[14-17, 19]；在對干細胞的研究中發現，水凝膠可以代替組織培養皿[34]；復雜的藥物治療方案可以用簡單的可注射凝膠取代[16, 22]；含有抗癌藥物的水凝膠能夠代替全身化療[25]。
雖然水凝膠在生物醫學領域具有廣泛的應用前景，但就目前的研究現狀來看，只有少數具有生物功能的水凝膠在臨床應用中初見成效。由于復雜的ECM在體外難以精確復制，因此，在體外構建動態的細胞生長發育微環境是未來進行水凝膠研究的一大挑戰。此外，另一個亟待解決的問題是組織的血管網絡重建，這不僅需要先進的組織工程技術構建3D仿生模型，還需要在血管再生術中考慮細胞與細胞間以及細胞與微環境間的聯系，以使凝膠植入物能夠與患者的血液循環系統融合，避免排斥。
通過優化設計來進一步改善水凝膠的性能，其應用可能會擴大到生物醫學領域的其它方面。目前，研究者們嘗試利用水凝膠進行器官打印來模仿天然組織的功能，作為疾病模型用于藥物篩選，促進藥物從實驗室研究向臨床應用過渡。此外，水凝膠設計及應用技術的迅猛發展還可能會對生物技術、藥理學和生物傳感器的研究產生重要影響，并為蛋白質的大規模生產和個性化的藥敏檢測提供方案。
0 引言
水凝膠是一種由親水性聚合物鏈交聯所形成的三維(three-dimension, 3D)網絡結構。通過對其理化性質和生物學特性進行精確設計，水凝膠能夠在體外高度模擬天然細胞外基質(extracellular matrix，ECM)環境，對細胞的生命活動和組織再生過程進行合理調控。近年來，水凝膠已經應用于生物醫學領域的多個方面，尤其是在組織工程與再生醫學、藥物遞送、干細胞培養與細胞療法等方面取得了重大突破。
1 水凝膠的設計及性能
為使水凝膠具有細胞相容性，通常需要利用生長因子等生物活性分子對凝膠進行修飾，修飾后的凝膠有利于人體內源性細胞的補充、局部組織形成和細胞分化的控制[1]。生長因子修飾凝膠的最直接的方法是將其與凝膠前體溶液混合，但這種方法會導致生長因子迅速耗盡，縮短了其作用時間。研究發現，將生長因子封裝在微球內可以對其實現有效控釋，以發揮更好的生物活性作用。Wang等[2]將血管內皮生長因子和腦源性神經營養因子包埋于微球中再與凝膠結合，其持續釋放時間可以長達30 d，足以支持神經干細胞的存活。
利用ECM蛋白或短肽修飾凝膠可以使其具有生物黏附性，如使凝膠與來自纖維連接蛋白細胞結合域中央的細胞黏附肽結合，這可為細胞提供一種能與凝膠黏附的生物功能位點[3]。但是，最新研究發現，這種改良方法會破壞凝膠內部的分子結構[4]。Ino等[4]用輝光放電技術對聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)水凝膠進行表面改性，其優越性在于不改變PVA的主要特性，同時可以促進細胞對PVA的黏附。
凝膠制備過程中，通過改變聚合物濃度、交聯密度、交聯時間以及交聯劑的種類、濃度、用量，均可實現對凝膠機械特性的調控。利用凝膠的機械特性，可以向細胞傳導重要的生物物理信號，從而調節機體的平衡狀態、組織形態發生、細胞的生長和分化。Murphy等[5]研究發現，骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的發育過程與凝膠的硬度有密切關系，在一定的凝膠硬度范圍內，高硬度的凝膠能夠促進BMSCs向成骨細胞分化，而低硬度的凝膠則有利于BMSCs分化成脂肪細胞。
水凝膠能夠運輸疏水或親水分子，這有利于臨床治療中藥物緩釋的實現。根據使用藥物的性質來改變凝膠的網格大小以控制藥物的釋放。多數水凝膠的網格大小在溶脹狀態下不小于5 nm，遠遠超過大多數藥物小分子的尺寸，有利于藥物在凝膠中的擴散[6]。對于比較大的蛋白質或多肽藥物分子，可以對凝膠的結構和網格尺寸進行設計來控制細胞的機械運動和調節藥物的動力學釋放。
水凝膠在一定的物理或化學因素下可進行降解，即生物降解性，通過控制可降解凝膠在體內吸收和/或局部降解的速率可以調節細胞的形態發生和分化[7]。水凝膠的降解方式主要有物理降解和化學降解兩種。環境因素如溫度、pH值等的變化能夠誘導凝膠的物理降解。為實現凝膠降解過程中細胞發育有關的信號轉導過程，細胞內外的離子濃度經常發生波動[8-9]，因此，凝膠中離子濃度的變化也可以作為一種生物物理刺激因素來引導細胞形態發生。凝膠的化學降解通常是指將一些酶的底物序列摻入到凝膠基質中作為生物反應元件，以實現凝膠降解的酶促反應。研究表明，細胞分泌的蛋白酶如基質金屬蛋白酶(metalloprotease，MMP)、膠原酶、纖溶酶等，可以與凝膠骨架上相應的底物包括MMP敏感肽序列、膠原蛋白、纖維蛋白等發生反應，以促進ECM骨架的斷裂和位移，引導組織的形態發生[10]。Turturro等[10]發現，MMP敏感的雙丙烯酸凝膠對新生血管芽的形成方向具有明顯的導向作用。Anderson等[11]用巰基光聚合作用制作了帶有不同濃度MMP敏感肽的聚乙二醇[poly(ethylene glycol)，PEG]水凝膠，并研究了不同程度的凝膠降解對人間充質干細胞分化的影響。
2 水凝膠在生物醫學領域的應用
2.1 組織工程與再生醫學
生物材料的骨架結構在組織工程中扮演著重要作用，其能為細胞生長和新生組織形成提供機械支持和發育引導。在大量生物骨架系統中，水凝膠是組織工程中應用最廣泛的生物材料。
水凝膠的網格結構有利于肝組織再生過程中營養成分的交換[12]。在軟骨和骨組織工程中，膠原水凝膠可以作為一種免疫調節支架來影響軟骨的形成[13]。含有甘蔗糖蜜多聚糖的水凝膠，可運載骨形成蛋白，修復大鼠的顱骨損傷[14]。在凝膠中添加成纖維細胞生長因子能夠促進鼓膜的修復[15]，富含血清蛋白的水凝膠還能促進椎間盤損傷的修復[16]。如果能夠建立適當的具有生物功能的骨架結構，再生細胞便可以在損傷組織中積累，并對基質中所設計的刺激因素做出反應，以引導有利的治療過程發生。Diab等[17]研究表明，將封裝有骨形態發生蛋白-2的小體包埋在絲質凝膠中并注射在大鼠的長骨缺損處，可以引導骨的修復和再生。在神經組織工程中，具有特殊的溶脹和機械力學性能的藻朊酸鹽水凝膠，可以在體外培養神經組織[18]。
新生血管的形成是組織再生的基礎。Sun等[19]的實驗不僅證明了右旋糖酐水凝膠可以促進新生血管形成，而且實現了帶有完整皮膚附屬物的皮膚再生。值得注意的是，實驗用的右旋糖酐水凝膠中沒有添加額外的細胞因子、生長因子或細胞，單純利用水凝膠材料就能實現皮膚再生過程中的新生血管形成，更加顯示出水凝膠在組織發育引導方面的優勢。
2.2 藥物遞送
近年來研究發現，水凝膠還可以作為一種高效的物質遞送系統，向體內運輸小分子或蛋白質藥物、細胞因子、抗原、遺傳物質等，用于藥物開發和臨床治療[20-23]。水凝膠可以負載小分子或蛋白質藥物，并使藥物在體內進行擴散，因此，含有藥物的水凝膠在損傷部位可以作為一個持久釋放藥物的藥劑庫，不僅實現了藥物的有效控釋，還能提高藥物的利用率[20, 24]。此外，通過選擇可進行生物降解的水凝膠材料，甚至可以使凝膠控釋系統從體內清除，以此降低對機體的損傷。紫杉醇(paclitaxel，PTX)作為一種有效的抗腫瘤藥物備受關注，將PTX及時、準確地運送至腫瘤部位，對腫瘤治療的意義重大。Liu等[25]研究發現，利用負載PTX的自組裝多肽合成水凝膠可以有效地抑制人乳腺癌細胞的生長。進一步研究發現，凝膠的彈性與凝膠前體物質——自組裝多肽的濃度有很大的相關性。利用原子力顯微鏡、圓二色譜分析、動態光散射和流變學分析等技術對體外藥物釋放量進行檢測，結果顯示，具有高濃度多肽的水凝膠可以延長近一半的釋放時間，并且能夠更加有效地抑制腫瘤細胞增殖。
利用凝膠藥物遞送系統設計出的納米級血管注射劑，在神經損傷治療方面取得了顯著成效。神經系統的再生能力是有限的，中樞神經系統損傷，尤其是大腦的損傷更具毀滅性。由于血腦屏障的限制，加上有些口服藥物經過藥代學首關消除后血液循環中的有效藥物量明顯減少，因此傳統的口服或靜脈注射藥物并不能獲得理想的治療效果。水凝膠注射劑恰恰克服了這一難題，將藥物包裹成納米微粒封裝在凝膠中進行皮下注射(如圖 1所示)，凝膠可在病灶部位作為一種持續的藥物遞送系統釋放藥物，有助于獲得更好的治療效果[26]。此外，水凝膠還可用于心血管、代謝等相關疾病的細胞療法，如對動脈粥樣硬化[27]、肌肉萎縮癥[28]、糖尿病[29]等疾病的治療，均已取得顯著療效。
圖1
水凝膠的藥物遞送系統
(a)正常腦組織；(b)口服或靜脈注射藥物；(c)水凝膠注射劑遞送藥物
Figure1. Drug delivery system of hydrogel(a) normal brain tissue; (b) drugs with oral administration or intravenous injection; (c) drugs applying hydrogel injection
2.3 三維干細胞培養與干細胞療法
多能干細胞(pluripotent stem cells，PSCs)在醫學發展和臨床治療方面有著巨大的應用價值。然而，目前我們對PSCs的很多認識都來源于傳統的二維(two-dimension, 2D)細胞培養系統，細胞的形態和生理功能與其在體內天然的3D微環境生長時具有很大差距。因此，對3D培養微環境的研究能夠使我們進一步完善體外干細胞培養系統，更好地理解細胞在體內的潛在功能。Lou等[30]首次利用植物來源的纖絲化纖維素水凝膠培養人PSCs，結果表明，與傳統的2D培養系統相比，水凝膠作為可調節的3D培養基質能夠支持干細胞更持久地發育。此外，細胞在3D環境中添加纖維素酶比在2D環境中添加纖維素酶更容易增殖。在此基礎上，進一步研究發現，不同種類的水凝膠系統對干細胞的分化潛力會產生不同的影響[31-32]。BMSCs主要涉及骨損傷修復中軟骨的再生過程，若將人BMSCs培養在成分不同的水凝膠中來誘導其向軟骨細胞分化，其黏多糖的分泌量和軟骨相關基因的表達量是不同的[31]。Gilbert等[33]研究證明，成人肌肉干細胞在彈性模量大于106 kPa的硬質塑膠培養皿中培養一周，細胞通常會失去多能性并且大量死亡；然而，當將其培養在彈性模量為12 kPa并且具有生物活性的化學交聯PEG水凝膠中時，細胞能夠在體外高效增殖，并且在植入體內后能夠獲得更高的成活率。這些研究提示我們，水凝膠培養系統的差異性在精確控制干細胞分化方面具有重要意義，即合理選擇損傷填充物可以獲得更加理想的治療效果。
3 前景與展望
水凝膠作為一種極具發展前景的生物材料已在生物醫學領域的多個方面產生了巨大的影響。例如，可以用水凝膠治療組織損傷[14-17, 19]；在對干細胞的研究中發現，水凝膠可以代替組織培養皿[34]；復雜的藥物治療方案可以用簡單的可注射凝膠取代[16, 22]；含有抗癌藥物的水凝膠能夠代替全身化療[25]。
雖然水凝膠在生物醫學領域具有廣泛的應用前景，但就目前的研究現狀來看，只有少數具有生物功能的水凝膠在臨床應用中初見成效。由于復雜的ECM在體外難以精確復制，因此，在體外構建動態的細胞生長發育微環境是未來進行水凝膠研究的一大挑戰。此外，另一個亟待解決的問題是組織的血管網絡重建，這不僅需要先進的組織工程技術構建3D仿生模型，還需要在血管再生術中考慮細胞與細胞間以及細胞與微環境間的聯系，以使凝膠植入物能夠與患者的血液循環系統融合，避免排斥。
通過優化設計來進一步改善水凝膠的性能，其應用可能會擴大到生物醫學領域的其它方面。目前，研究者們嘗試利用水凝膠進行器官打印來模仿天然組織的功能，作為疾病模型用于藥物篩選，促進藥物從實驗室研究向臨床應用過渡。此外，水凝膠設計及應用技術的迅猛發展還可能會對生物技術、藥理學和生物傳感器的研究產生重要影響，并為蛋白質的大規模生產和個性化的藥敏檢測提供方案。
