人體呼出的氣體攜帶有重要的生理信息, 而呼出氣體檢測技術具有采樣無損、操作便利等優點, 是醫療檢測領域的研究熱點。質子轉移反應質譜(PTR-MS)因靈敏度高、響應速度快、特異性好等優點, 在呼出氣體檢測領域發揮著不可替代的作用。本文介紹了PTR-MS的基本原理, 綜述了PTR-MS在呼出氣體檢測領域的研究進展, 分析了影響測量結果的主要因素, 并對其發展方向進行了展望。
引用本文： 趙學玒, 李維康, 杜康, 孫運, 楊文, 汪曣. 質子轉移反應質譜在呼氣檢測領域的研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(6): 1374-1379. doi: 10.7507/1001-5515.20150243 復制
0 引言
人體呼出氣體中含有大量的揮發性有機物(volatile organic compounds，VOCs)，每一份呼氣樣品中VOCs的種類可多達上千種[1]。呼出氣體中的VOCs與人體的健康狀況和新陳代謝密切相關[2]，并攜帶大量的生理信息。例如研究表明異戊二烯、丙酮、甲醇、苯、正丁醛等可能與肺癌有一定關系[3]；氰化氫可以作為綠膿桿菌引起的慢性呼吸道感染的呼氣標志物[4]；吸煙人群中乙腈的含量要比正常人群高出一個量級[5]；糖尿病患者呼出氣體中丙酮的含量較高[6]；環己酮、十二烷、乙基苯胺等在直腸癌患者的呼出氣體中含量遠高于正常人群，可以為醫療診斷提供參考[7]。此外，呼出氣體檢測還具有無損、快速、取樣方便等優勢，逐漸成為現代臨床醫學和分析檢測領域的研究熱點[8]。目前常用的呼出氣體檢測方法是單點采樣后利用色譜或色譜-質譜進行離線分析[9]，這種方法費時費力，且不能滿足實時在線監測的需求。質子轉移反應質譜(proton transfer reaction mass spectrometry，PTR-MS)是近年來被廣泛應用于呼吸氣體檢測領域的新型質譜技術。與傳統的檢測方法相比，質子轉移反應質譜技術不僅可以滿足在線監測的需求，而且具有高靈敏度和低檢測限等優勢[10]。此外，質子轉移反應質譜技術還具有以下優點：①與用于分析分子結構的質譜儀器不同，PTR-MS是一種軟電離技術，只有分子峰和極少碎片峰[11]，譜圖解析容易；②不需要標定，可直接獲得被測物的絕對濃度；③不需要工作氣體，運行成本低，操作維護簡單；④質譜方法是全譜分析，能夠發現未知物；⑤因為不受空氣中主要成分的影響，樣品前處理簡單。
本文將對PTR-MS的原理及其在呼出氣體檢測領域的研究進展進行綜述，并對PTR-MS檢測呼出氣體的幾種影響因素做簡要的分析總結。
1 PTR-MS介紹
1.1 反應原理
質子轉移反應質譜是一種基于質子轉移反應的化學電離源質譜，20世紀90年代中期由奧地利Innsbruck大學Werner Lindinger及其課題組成員結合化學電離源技術與流動漂移管模型技術首次提出。常用的試劑離子包括H3O+、NH4+、NO+和O2+等[12]。H3O+是呼出氣體中VOCs檢測最常用的試劑離子，因為大多數VOCs(除了CH4和C2H4等少數有機物)的質子親和勢(700~900 kJ/mol)大于H2O的質子親和勢(691 kJ/mol)，而呼氣主要成分(N2、O2、CO2等)的質子親和勢小于H2O[13]，即H3O+可與大多數VOCs發生質子轉移反應，而不與呼出氣體的主要成分發生質子轉移反應。因此用PTR-MS進行呼出氣體VOCs測量時，一般情況下無需對樣品進行預處理。
水蒸氣經電離后產生H3O+，然后進入漂移管后發生擴散和碰撞，H3O+將質子轉移給待測物使其離子化。以M表示待測VOCs，則上述反應如式(1)所示：
| ${{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}{\text{ + M}} \to {{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{O + M}}{{\text{H}}^{\text{ + }}}$ |
質子化的VOCs離子經質量分析器(如四極桿質譜、飛行時間質譜等)后被離子檢測器檢測到，經過計算即可得到VOCs的絕對濃度。
1.2 濃度計算
經過漂移管的質子轉移反應后，H3O+的濃度可以由式(2)表示：
| $\left[{{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right]{\text{=}}{\left[{{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right]_{\text{0}}}{\text{exp}}\left({{\text{-}}\left[{\text{M}} \right]{\text{k}}t} \right)$ |
其中，[H3O+]0為初始反應試劑離子濃度，k為反應速率常數，t為平均反應時間，[M]為待測物濃度。實際過程中H3O+由于擴散與漂移管壁發生碰撞而損失的量，相對于H3O+的實際含量非常少，因此可認為其損失量全部用于質子轉移反應。式(1)中MH+的濃度可以表示為
| $\begin{gathered} \left[{{\text{M}}{{\text{H}}^{\text{ + }}}} \right]{\text{=}}{\left[{{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right]_{\text{0}}}\left[{{\text{1-exp}}\left({{\text{-}}\left[{\text{M}} \right]{\text{k}}t} \right)} \right] \approx \hfill \\ {\left[{{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right]_{\text{0}}}\left[{\text{M}} \right]{\text{k}}t \hfill \\ \end{gathered} $ |
式(3)中，約等號成立的前提是[M]kt非常小，即H3O+中只有少部分參與漂移管中的質子轉移反應。由于H3O+和MH+的濃度分別與各自的每秒計數率cps(H3O+)和cps(MH+)成正比，因此被測物M的絕對濃度可以表示為
| $\left[{\text{M}} \right]{\text{=}}\frac{{{\text{cps}}\left({{\text{M}}{{\text{H}}^{\text{ + }}}} \right)}}{{{\text{cps}}\left({{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right)}}\frac{1}{{{\text{k}}t}}$ |
式(4)中，cps(H3O+)和cps(MH+)可以由離子檢測器直接測得，反應速率常數k可通過實驗或查閱相關文獻得到，平均反應時間t可以通過計算離子經過漂移管的平均時間得到，如式(5)所示:
| $t=\frac{L}{{{v_d}}}{\text{=}}\frac{L}{{\mu E}}$ |
其中，L為漂移管長度，vd=μE表示離子在漂移管內的漂移速率，E為電場強度，μ為離子在漂移管內的遷移率，其計算方法由公式(6)給出:
| $\mu={\mu _0}\frac{T}{{283K}}\frac{{1013{\text{mbar}}}}{{{P_{{\text{drift}}}}}}$ |
其中，μ0為H3O+在空氣中的遷移率，T為以K為單位的漂移管內反應室的溫度，Pdrift為以mbar為單位的漂移管內壓強。由此可以得到式(4)中的全部變量，進而計算出被測物M的絕對濃度。
2 PTR-MS用于呼出氣體檢測領域的研究進展
PTR-MS在呼出氣體檢測領域的研究由來已久，其應用領域也十分廣泛。PTR-MS在呼出氣體檢測領域最直接的應用是檢測與疾病相關的呼氣標志物，這也是研究早期的主要方向之一。目前已有多項研究證實可以用PTR-MS測量呼出氣體的方法分析與疾病相關的呼氣標志物。此外，PTR-MS實時監測特性可以在診斷和治療的過程中為醫護人員和研究人員提供實時有效的生理信息。近年來也有一些課題組另辟蹊徑，以小白鼠的呼出氣體為研究對象，對不同的飲食結構進行分析。下面將主要按照研究內容對PTR-MS在呼出氣體檢測領域的研究進展進行綜述。
2.1 呼氣標志物檢測
自1998年世界上第一臺商業化PTR-MS(Ionicon)儀器問世以來，以奧地利Innsbruck醫科大學為代表的多個課題組就致力于PTR-MS測量呼氣標志物的研究。其主要研究方法是用PTR-MS檢測患者的呼出氣體，通過與正常人群的呼氣成分進行比對，分析和確定與某種疾病相關的呼氣標志物。
幽門螺旋桿菌可以引起多種胃部疾病，如慢性胃炎、胃黏膜損傷等，甚至可能增加患胃癌的風險。目前常用的檢測方法主要是包括細菌的直接檢查、尿毒酶活性測定、免疫學檢測及聚合酶鏈反應等，但這些方法具有取樣復雜、有損、檢測周期長等缺點。Lechner等[14]運用PTR-MS對14名幽門螺旋桿菌患者和11名健康志愿者的呼出氣體成分進行了分析，發現相比于正常人群，患者呼氣中的氰化氫和硝酸含量都有明顯的升高, 其中氰化氫是由幽門螺桿菌自身產生，而硝酸的升高可能是由慢性炎癥所引起。受試者工作特性曲線(receiver operating characteristics，ROC)顯示，氰化氫和硝酸的曲線下面積(area under ROC curve, AUC)分別達到0.756和0.805，具有較高的診斷準確性。這一研究為幽門螺旋桿菌的診斷方法提供了新的思路，相比于傳統檢測方法，具有無創采樣、實時檢測等優勢。但研究中實驗樣本偏少，診斷的準確性有待提高。
血液中膽固醇的含量是評價身體健康狀況的重要指標之一，對冠心病、甲亢等疾病的診斷具有重要的參考價值。Karl等[15]運用PTR-MS檢測了患者在服用降脂藥物前后的呼氣中異戊二烯的濃度，發現呼出氣體中異戊二烯的濃度和血清中的膽固醇含量呈明顯的線性關系，由此判斷異戊二烯可能是評價血液中膽固醇水平的呼氣標志物。呼氣中異戊二烯的濃度主要與心跳速率和呼氣速率有關，只要保證測量過程中的心跳速率和呼氣速率的穩定，所測的內源性異戊二烯的濃度就可以維持在一個相對穩定的值，進而證實了呼出氣體測量方法評價人體膽固醇水平的實際可行性，對無損快速地檢測血液中的膽固醇水平具有重要意義。
肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。如果能在早期階段通過快速無損的方法加以診斷和治療，無疑會極大地提高肺癌患者的存活率。Wehinger等[16]用PTR-MS測量了17名原發性肺癌患者和170名健康志愿者的呼出氣體成分，發現在質量數為31(可能是質子化的甲醛)和43(可能是質子化的異丙醇碎片)處，原發性肺癌患者組的濃度明顯偏高。以此為基礎建立評價模型，靈敏度達到0.54±0.20，準確性和特異性分別達到0.96±0.02和0.99±0.01，可有效地區分健康組和患者組。研究未能確定兩種標志物的具體成分，也未能解釋濃度偏高的醫學成因。但相比傳統的檢測手段，這一方法簡便無創，在原發性肺癌的早期診斷領域有著廣闊的應用前景。
PTR-MS可以對呼出氣體進行全譜掃描，發現未知VOCs和更多的生理信息。Kohl等[17]用質子轉移反應飛行時間質譜(proton transfer reaction-time of flight-mass spectrometry, PTR-TOF-MS)對96例接受腎臟移植的患者在手術前后呼出氣體中的含氧VOCs進行了在線檢測，并用質子轉移反應三重四極桿質譜(proton transfer reaction-triple quadrupole-mass spectrometry, PTR-QqQ-MS)進行碰撞誘導解離實驗以進行化學鑒定。實驗得到了41個最主要的含氧VOCs信號，其中只有質量數為115(分子式可能是C7H14O)的離子呈現出了與肌氨酸酐(當前被廣泛接受的腎臟功能標志物)較為相關的趨勢。由于在一些患者中質量數為115的呼氣化合物的濃度在腎臟移植手術之前是偏高的，在手術之后會有所降低，因此可以推斷這一化合物并非由于手術時或者手術后使用藥品而產生，而很有可能是腎臟功能缺陷導致的尿毒癥溶質在體內積累造成的。由此可以認定質量數為115的呼氣化合物有可能是一種新的評價人體腎臟功能的呼氣標志物。研究首次發現了一種可能與人體腎臟功能相關的含氧VOCs，完善了與人體腎功能相關的呼氣標志物的檢測和研究工作，對今后的理論研究和實際診斷都有很好的借鑒作用。
相比于傳統的檢測方法，PTR-MS具有無損采樣、快速檢測等優勢，在呼氣標志物的檢測領域發揮著重要作用。由于某些疾病的成因復雜多變，且大多數研究的實驗樣本量偏少，研究領域內很難就某種疾病的呼氣標志物達成共識，也無法對診斷結果的準確性提出統一有效的評價方法。因此到目前為止，PTR-MS測量呼出氣體標志物的方法仍不足以代替常規的檢測方法，只能作為實際醫療診斷的一種輔助手段。
2.2 實時信息監測
常規的呼出氣體檢測方法，如氣相色譜-質譜聯用技術(gas chromatography-mass spectroscopy, GC-MS)，需要對樣品進行預處理及離線分析，因而無法分析藥物療效、環境影響等實時信息。PTR-MS無需對樣品進行預處理，可以在診斷和治療的過程中為醫護人員和研究人員提供實時有效的生理信息。
異丙酚是麻醉藥物的主要成分之一，實時監測血液中異丙酚的含量對保障患者生命安全具有重要意義。為了分析在評價麻醉藥物療效時以呼出氣體檢測代替傳統血液采樣的可行性，Kamysek等[18]以豬為實驗對象，用PTR-MS對呼出氣體進行實時在線監測，并用固相微萃取氣相色譜質譜法(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectroscopy，SPME-GC-MS)對藥物在血液中的含量進行間斷性檢測，分析兩者之間可能存在的關系。研究證實異丙酚在呼出氣體和血液中的含量具有較好的一致性(回歸系數R2=0.959)，這就為采用呼氣檢測手段評價血液中麻醉藥物的含量提供了可靠的依據，使得以呼氣檢測手段定量分析手術過程中的麻醉藥物療效成為可能。相比傳統的血液采樣分析方法，PTR-MS監測呼出氣體法實時、無創，有助于醫師更精確地控制麻醉藥物的用量。
2.3 飲食結構分析
飲食結構與人體的健康狀況息息相關。不同的飲食結構會對身體狀況和新陳代謝造成不同的影響，而這一影響也會通過呼出氣體中部分VOCs含量的差別表現出來。因此通過PTR-MS檢測呼出氣體的變化，可以有效地反映飲食結構變化的相關信息。目前已有多個課題組對這一領域開展研究工作。
為了研究非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)與飲食結構可能存在的關系，Aprea等[19]用PTR-TOF-MS對不同飲食結構(多脂飲食和普通飲食)和飲品結構(咖啡和水)的實驗小白鼠的呼出氣體進行了檢測。實驗發現，甲醇、含硫化合物(主要是二甲基砜和二甲基硫)和乙腈的含量主要與飲食有關，苯酚和乙腈與飲品有關，氨與飲食和飲品的共同作用有關，其中甲醇、含硫化合物和氨最有可能和肝臟新陳代謝有關。這一研究也證實了PTR-MS測量呼出氣體以區分不同飲食結構的可行性，為后續的實驗研究提供了條件。以此為基礎，Aprea等[20]于2013年再次運用PTR-TOF-MS對無麩質飲食結構下乳糜瀉患者的呼出氣體中的代謝產物進行了檢測，證實了堅持無麩質飲食結構下乳糜瀉患者的呼出氣體成分濃度與正常人群并無明顯差別。
為了分析西方高脂肪飲食結構對呼出氣體的影響，Kistler等[21]用PTR-TOF-MS測量了不同飲食結構(高脂肪飲食和低脂肪飲食)下小白鼠的呼出氣體成分。結果顯示，飲食結構由以植物原料為主的飼料，分別變成脂肪含量不同的半純化飼料后，甲醇、乙酸甲酯和二甲基砜離子的濃度顯著減少。研究證實，高脂肪飲食結構會影響呼出氣體中部分VOCs的濃度，為分析新陳代謝功能提供了依據。
研究證實了PTR-MS不僅可以對不同飲食結構進行區分，而且可以通過檢測呼出氣體的變化評價新陳代謝功能，檢測方法無損簡便，是極具潛力的飲食結構分析手段。
2.4 我國目前的研究進展
中科院安徽光學精密機械研究所是國內PTR-MS檢測呼出氣體的主要研究單位，不僅搭建了可在線檢測呼氣VOCs的PTR-MS系統，而且以此為基礎完成了對高血糖呼氣標志物的研究工作。
沈成銀等[22]通過對自主研制的大氣成分在線檢測PTR-MS的進樣管路系統進行改造，建立了可在線檢測呼氣VOCs的PTR-MS裝置。通過控制呼氣進樣系統的旁路流量來實現對進樣速度的控制，可實時監測呼氣中指定成分的濃度變化，也可對呼氣成分進行快速全譜分析。以此為基礎，楊彬等[23]對70例血糖含量正常的志愿者與22例高血糖志愿者的呼氣進行實時在線分析。實驗結果表明兩組受試者呼氣存在5種差異VOCs，其質荷比(m/z)分別為61、31、120、104、82。以5種VOCs建立判別模型的ROC曲線顯示，診斷靈敏度為0.864，特異度為0.843，AUC=0.926，具有較高的準確性。同時作者還發現兩組受試者的呼氣丙酮含量無顯著差異，由此推斷丙酮含量與血糖濃度之間無相關性。然而研究未能確定5種VOCs的確切成分和代謝來源，相關研究仍處于探索階段。
3 呼出氣體影響因素分析
PTR-MS檢測呼出氣體中VOCs的濃度時，檢測結果會受到CO2濃度、氣體濕度、檢測環境等多種因素的影響。綜合分析各因素的影響程度，對呼出氣體VOCs濃度測量的準確性具有重要意義。
3.1 CO2濃度對呼出氣體測量結果的影響
CO2是人體呼出氣體的主要成分之一，其濃度可能隨身體健康狀態和呼氣采集方式的不同存在較大差異。Keck等[24]針對人體呼出氣體中的幾種主要VOCs(包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丙酮和異戊二烯等)，分析了不同CO2濃度對其測量結果的影響。研究發現當CO2濃度升高5%時，幾種VOCs的測量濃度均有一定的升高，如甲醇測量濃度約升高10%，而乙醇的測量濃度升高約60%。主要原因是CO2的質量數遠大于空氣平均分子質量數，CO2濃度升高使得離子遷移率μ下降，離子遷移速率vd和平均中間質動能KEcm隨之下降，造成漂移管內水合氫離子團簇(H2O·H3O+)濃度的升高，使得呼出氣體中VOCs的測量濃度偏高。
3.2 氣體濕度對呼出氣體測量結果的影響
人體呼出氣體的相對濕度較高，且易受到環境濕度、肺活量、身體健康狀態等多種因素的影響。Beauchamp等[25]研究了不同呼出氣體相對濕度與水合氫離子團簇(H2O·H3O+)濃度的關系。當相對濕度由20%增長至90%時，水合氫離子團簇的濃度由3%增長至12%。與CO2的影響方式類似，水合氫離子團簇的增加會造成呼出氣體中VOCs的測量濃度偏高。由于實驗在室溫(22.4℃)下進行，此時90%的相對濕度相當于體溫(37℃)下40%的相對濕度，而正常生理狀況下人體的呼出氣體濕度可以達到100%，因此相對濕度對于測量結果的影響程度遠大于CO2。此外，由于呼出氣體的濕度較高，水合氫離子團簇計數值cps(37)常會達到2×106以上。這么高的信號值可能會使電子倍增器達到飽和狀態，造成測量結果偏低，長時間測量甚至可能會對電子倍增器造成損傷。
3.3 檢測環境對呼出氣體測量結果的影響
檢測環境中的背景VOCs同樣會對PTR-MS檢測呼出氣體造成干擾，實際測量中應針對具體的檢測環境確定主要的背景VOCs并加以分析研究。例如在麻醉后監測治療室(post anesthesia care unit，PACU)內，七氟醚的濃度明顯高于人體呼出氣體的正常范圍。為了分析七氟醚在檢測環境和呼出氣體中可能存在的濃度關系，Trefz等[26]運用PTR-TOF-MS對PACU內志愿者的呼出氣體進行實時在線監測。結果證實呼出氣體中七氟醚的濃度與外部檢測環境具有較好的一致性(R2=0.94)。這一結果證實了外部環境會對呼出氣體的檢測結果造成影響，如何排除不同檢測環境下的背景VOCs干擾尚在進一步研究之中。
此外，PTR-MS測量結果還會受到呼氣方式、采樣方式等多方因素的影響。如何科學評價各因素對測量結果的影響程度，并針對各因素建立有效的修正方法，是下一步的主要研究方向。
4 總結與展望
相比于傳統的血液、尿液檢測等手段，呼出氣體檢測具有采樣無損、操作便利等優點，是醫療檢測領域的研究熱點。在眾多呼出氣體檢測手段中，PTR-MS由于其特有的樣品無需預處理、靈敏度高、響應速度快、不受空氣中常規組分干擾等優點，在人體呼出氣體檢測領域具有廣闊的應用空間。早期的研究以分析疾病與呼氣標志物的關系為主要目標，其中的許多研究成果已經證實了PTR-MS在線檢測呼出氣體的可行性和準確性，并且確定了部分疾病的呼氣標志物。但是由于VOCs的含量在個體之間存在著較大的差異，并且不同研究的實驗標準和條件也不盡相同，因此很難形成統一的標準規范來分析和研究呼氣標志物與疾病的具體關系。近年來PTR-MS在呼出氣體研究領域的應用趨于廣泛化，如分析飲食結構、評價藥物療效、研究新陳代謝等。可以預見人體呼出氣體檢測的標準化和規范化將會是未來科研工作者的共同目標。而隨著PTR-MS的商品化、小型化以及各種性能參數的提高，其在人體呼出氣體檢測領域必將發揮著日益重要的作用。
0 引言
人體呼出氣體中含有大量的揮發性有機物(volatile organic compounds，VOCs)，每一份呼氣樣品中VOCs的種類可多達上千種[1]。呼出氣體中的VOCs與人體的健康狀況和新陳代謝密切相關[2]，并攜帶大量的生理信息。例如研究表明異戊二烯、丙酮、甲醇、苯、正丁醛等可能與肺癌有一定關系[3]；氰化氫可以作為綠膿桿菌引起的慢性呼吸道感染的呼氣標志物[4]；吸煙人群中乙腈的含量要比正常人群高出一個量級[5]；糖尿病患者呼出氣體中丙酮的含量較高[6]；環己酮、十二烷、乙基苯胺等在直腸癌患者的呼出氣體中含量遠高于正常人群，可以為醫療診斷提供參考[7]。此外，呼出氣體檢測還具有無損、快速、取樣方便等優勢，逐漸成為現代臨床醫學和分析檢測領域的研究熱點[8]。目前常用的呼出氣體檢測方法是單點采樣后利用色譜或色譜-質譜進行離線分析[9]，這種方法費時費力，且不能滿足實時在線監測的需求。質子轉移反應質譜(proton transfer reaction mass spectrometry，PTR-MS)是近年來被廣泛應用于呼吸氣體檢測領域的新型質譜技術。與傳統的檢測方法相比，質子轉移反應質譜技術不僅可以滿足在線監測的需求，而且具有高靈敏度和低檢測限等優勢[10]。此外，質子轉移反應質譜技術還具有以下優點：①與用于分析分子結構的質譜儀器不同，PTR-MS是一種軟電離技術，只有分子峰和極少碎片峰[11]，譜圖解析容易；②不需要標定，可直接獲得被測物的絕對濃度；③不需要工作氣體，運行成本低，操作維護簡單；④質譜方法是全譜分析，能夠發現未知物；⑤因為不受空氣中主要成分的影響，樣品前處理簡單。
本文將對PTR-MS的原理及其在呼出氣體檢測領域的研究進展進行綜述，并對PTR-MS檢測呼出氣體的幾種影響因素做簡要的分析總結。
1 PTR-MS介紹
1.1 反應原理
質子轉移反應質譜是一種基于質子轉移反應的化學電離源質譜，20世紀90年代中期由奧地利Innsbruck大學Werner Lindinger及其課題組成員結合化學電離源技術與流動漂移管模型技術首次提出。常用的試劑離子包括H3O+、NH4+、NO+和O2+等[12]。H3O+是呼出氣體中VOCs檢測最常用的試劑離子，因為大多數VOCs(除了CH4和C2H4等少數有機物)的質子親和勢(700~900 kJ/mol)大于H2O的質子親和勢(691 kJ/mol)，而呼氣主要成分(N2、O2、CO2等)的質子親和勢小于H2O[13]，即H3O+可與大多數VOCs發生質子轉移反應，而不與呼出氣體的主要成分發生質子轉移反應。因此用PTR-MS進行呼出氣體VOCs測量時，一般情況下無需對樣品進行預處理。
水蒸氣經電離后產生H3O+，然后進入漂移管后發生擴散和碰撞，H3O+將質子轉移給待測物使其離子化。以M表示待測VOCs，則上述反應如式(1)所示：
| ${{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}{\text{ + M}} \to {{\text{H}}_{\text{2}}}{\text{O + M}}{{\text{H}}^{\text{ + }}}$ |
質子化的VOCs離子經質量分析器(如四極桿質譜、飛行時間質譜等)后被離子檢測器檢測到，經過計算即可得到VOCs的絕對濃度。
1.2 濃度計算
經過漂移管的質子轉移反應后，H3O+的濃度可以由式(2)表示：
| $\left[{{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right]{\text{=}}{\left[{{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right]_{\text{0}}}{\text{exp}}\left({{\text{-}}\left[{\text{M}} \right]{\text{k}}t} \right)$ |
其中，[H3O+]0為初始反應試劑離子濃度，k為反應速率常數，t為平均反應時間，[M]為待測物濃度。實際過程中H3O+由于擴散與漂移管壁發生碰撞而損失的量，相對于H3O+的實際含量非常少，因此可認為其損失量全部用于質子轉移反應。式(1)中MH+的濃度可以表示為
| $\begin{gathered} \left[{{\text{M}}{{\text{H}}^{\text{ + }}}} \right]{\text{=}}{\left[{{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right]_{\text{0}}}\left[{{\text{1-exp}}\left({{\text{-}}\left[{\text{M}} \right]{\text{k}}t} \right)} \right] \approx \hfill \\ {\left[{{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right]_{\text{0}}}\left[{\text{M}} \right]{\text{k}}t \hfill \\ \end{gathered} $ |
式(3)中，約等號成立的前提是[M]kt非常小，即H3O+中只有少部分參與漂移管中的質子轉移反應。由于H3O+和MH+的濃度分別與各自的每秒計數率cps(H3O+)和cps(MH+)成正比，因此被測物M的絕對濃度可以表示為
| $\left[{\text{M}} \right]{\text{=}}\frac{{{\text{cps}}\left({{\text{M}}{{\text{H}}^{\text{ + }}}} \right)}}{{{\text{cps}}\left({{{\text{H}}_{\text{3}}}{{\text{O}}^{\text{ + }}}} \right)}}\frac{1}{{{\text{k}}t}}$ |
式(4)中，cps(H3O+)和cps(MH+)可以由離子檢測器直接測得，反應速率常數k可通過實驗或查閱相關文獻得到，平均反應時間t可以通過計算離子經過漂移管的平均時間得到，如式(5)所示:
| $t=\frac{L}{{{v_d}}}{\text{=}}\frac{L}{{\mu E}}$ |
其中，L為漂移管長度，vd=μE表示離子在漂移管內的漂移速率，E為電場強度，μ為離子在漂移管內的遷移率，其計算方法由公式(6)給出:
| $\mu={\mu _0}\frac{T}{{283K}}\frac{{1013{\text{mbar}}}}{{{P_{{\text{drift}}}}}}$ |
其中，μ0為H3O+在空氣中的遷移率，T為以K為單位的漂移管內反應室的溫度，Pdrift為以mbar為單位的漂移管內壓強。由此可以得到式(4)中的全部變量，進而計算出被測物M的絕對濃度。
2 PTR-MS用于呼出氣體檢測領域的研究進展
PTR-MS在呼出氣體檢測領域的研究由來已久，其應用領域也十分廣泛。PTR-MS在呼出氣體檢測領域最直接的應用是檢測與疾病相關的呼氣標志物，這也是研究早期的主要方向之一。目前已有多項研究證實可以用PTR-MS測量呼出氣體的方法分析與疾病相關的呼氣標志物。此外，PTR-MS實時監測特性可以在診斷和治療的過程中為醫護人員和研究人員提供實時有效的生理信息。近年來也有一些課題組另辟蹊徑，以小白鼠的呼出氣體為研究對象，對不同的飲食結構進行分析。下面將主要按照研究內容對PTR-MS在呼出氣體檢測領域的研究進展進行綜述。
2.1 呼氣標志物檢測
自1998年世界上第一臺商業化PTR-MS(Ionicon)儀器問世以來，以奧地利Innsbruck醫科大學為代表的多個課題組就致力于PTR-MS測量呼氣標志物的研究。其主要研究方法是用PTR-MS檢測患者的呼出氣體，通過與正常人群的呼氣成分進行比對，分析和確定與某種疾病相關的呼氣標志物。
幽門螺旋桿菌可以引起多種胃部疾病，如慢性胃炎、胃黏膜損傷等，甚至可能增加患胃癌的風險。目前常用的檢測方法主要是包括細菌的直接檢查、尿毒酶活性測定、免疫學檢測及聚合酶鏈反應等，但這些方法具有取樣復雜、有損、檢測周期長等缺點。Lechner等[14]運用PTR-MS對14名幽門螺旋桿菌患者和11名健康志愿者的呼出氣體成分進行了分析，發現相比于正常人群，患者呼氣中的氰化氫和硝酸含量都有明顯的升高, 其中氰化氫是由幽門螺桿菌自身產生，而硝酸的升高可能是由慢性炎癥所引起。受試者工作特性曲線(receiver operating characteristics，ROC)顯示，氰化氫和硝酸的曲線下面積(area under ROC curve, AUC)分別達到0.756和0.805，具有較高的診斷準確性。這一研究為幽門螺旋桿菌的診斷方法提供了新的思路，相比于傳統檢測方法，具有無創采樣、實時檢測等優勢。但研究中實驗樣本偏少，診斷的準確性有待提高。
血液中膽固醇的含量是評價身體健康狀況的重要指標之一，對冠心病、甲亢等疾病的診斷具有重要的參考價值。Karl等[15]運用PTR-MS檢測了患者在服用降脂藥物前后的呼氣中異戊二烯的濃度，發現呼出氣體中異戊二烯的濃度和血清中的膽固醇含量呈明顯的線性關系，由此判斷異戊二烯可能是評價血液中膽固醇水平的呼氣標志物。呼氣中異戊二烯的濃度主要與心跳速率和呼氣速率有關，只要保證測量過程中的心跳速率和呼氣速率的穩定，所測的內源性異戊二烯的濃度就可以維持在一個相對穩定的值，進而證實了呼出氣體測量方法評價人體膽固醇水平的實際可行性，對無損快速地檢測血液中的膽固醇水平具有重要意義。
肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。如果能在早期階段通過快速無損的方法加以診斷和治療，無疑會極大地提高肺癌患者的存活率。Wehinger等[16]用PTR-MS測量了17名原發性肺癌患者和170名健康志愿者的呼出氣體成分，發現在質量數為31(可能是質子化的甲醛)和43(可能是質子化的異丙醇碎片)處，原發性肺癌患者組的濃度明顯偏高。以此為基礎建立評價模型，靈敏度達到0.54±0.20，準確性和特異性分別達到0.96±0.02和0.99±0.01，可有效地區分健康組和患者組。研究未能確定兩種標志物的具體成分，也未能解釋濃度偏高的醫學成因。但相比傳統的檢測手段，這一方法簡便無創，在原發性肺癌的早期診斷領域有著廣闊的應用前景。
PTR-MS可以對呼出氣體進行全譜掃描，發現未知VOCs和更多的生理信息。Kohl等[17]用質子轉移反應飛行時間質譜(proton transfer reaction-time of flight-mass spectrometry, PTR-TOF-MS)對96例接受腎臟移植的患者在手術前后呼出氣體中的含氧VOCs進行了在線檢測，并用質子轉移反應三重四極桿質譜(proton transfer reaction-triple quadrupole-mass spectrometry, PTR-QqQ-MS)進行碰撞誘導解離實驗以進行化學鑒定。實驗得到了41個最主要的含氧VOCs信號，其中只有質量數為115(分子式可能是C7H14O)的離子呈現出了與肌氨酸酐(當前被廣泛接受的腎臟功能標志物)較為相關的趨勢。由于在一些患者中質量數為115的呼氣化合物的濃度在腎臟移植手術之前是偏高的，在手術之后會有所降低，因此可以推斷這一化合物并非由于手術時或者手術后使用藥品而產生，而很有可能是腎臟功能缺陷導致的尿毒癥溶質在體內積累造成的。由此可以認定質量數為115的呼氣化合物有可能是一種新的評價人體腎臟功能的呼氣標志物。研究首次發現了一種可能與人體腎臟功能相關的含氧VOCs，完善了與人體腎功能相關的呼氣標志物的檢測和研究工作，對今后的理論研究和實際診斷都有很好的借鑒作用。
相比于傳統的檢測方法，PTR-MS具有無損采樣、快速檢測等優勢，在呼氣標志物的檢測領域發揮著重要作用。由于某些疾病的成因復雜多變，且大多數研究的實驗樣本量偏少，研究領域內很難就某種疾病的呼氣標志物達成共識，也無法對診斷結果的準確性提出統一有效的評價方法。因此到目前為止，PTR-MS測量呼出氣體標志物的方法仍不足以代替常規的檢測方法，只能作為實際醫療診斷的一種輔助手段。
2.2 實時信息監測
常規的呼出氣體檢測方法，如氣相色譜-質譜聯用技術(gas chromatography-mass spectroscopy, GC-MS)，需要對樣品進行預處理及離線分析，因而無法分析藥物療效、環境影響等實時信息。PTR-MS無需對樣品進行預處理，可以在診斷和治療的過程中為醫護人員和研究人員提供實時有效的生理信息。
異丙酚是麻醉藥物的主要成分之一，實時監測血液中異丙酚的含量對保障患者生命安全具有重要意義。為了分析在評價麻醉藥物療效時以呼出氣體檢測代替傳統血液采樣的可行性，Kamysek等[18]以豬為實驗對象，用PTR-MS對呼出氣體進行實時在線監測，并用固相微萃取氣相色譜質譜法(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectroscopy，SPME-GC-MS)對藥物在血液中的含量進行間斷性檢測，分析兩者之間可能存在的關系。研究證實異丙酚在呼出氣體和血液中的含量具有較好的一致性(回歸系數R2=0.959)，這就為采用呼氣檢測手段評價血液中麻醉藥物的含量提供了可靠的依據，使得以呼氣檢測手段定量分析手術過程中的麻醉藥物療效成為可能。相比傳統的血液采樣分析方法，PTR-MS監測呼出氣體法實時、無創，有助于醫師更精確地控制麻醉藥物的用量。
2.3 飲食結構分析
飲食結構與人體的健康狀況息息相關。不同的飲食結構會對身體狀況和新陳代謝造成不同的影響，而這一影響也會通過呼出氣體中部分VOCs含量的差別表現出來。因此通過PTR-MS檢測呼出氣體的變化，可以有效地反映飲食結構變化的相關信息。目前已有多個課題組對這一領域開展研究工作。
為了研究非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)與飲食結構可能存在的關系，Aprea等[19]用PTR-TOF-MS對不同飲食結構(多脂飲食和普通飲食)和飲品結構(咖啡和水)的實驗小白鼠的呼出氣體進行了檢測。實驗發現，甲醇、含硫化合物(主要是二甲基砜和二甲基硫)和乙腈的含量主要與飲食有關，苯酚和乙腈與飲品有關，氨與飲食和飲品的共同作用有關，其中甲醇、含硫化合物和氨最有可能和肝臟新陳代謝有關。這一研究也證實了PTR-MS測量呼出氣體以區分不同飲食結構的可行性，為后續的實驗研究提供了條件。以此為基礎，Aprea等[20]于2013年再次運用PTR-TOF-MS對無麩質飲食結構下乳糜瀉患者的呼出氣體中的代謝產物進行了檢測，證實了堅持無麩質飲食結構下乳糜瀉患者的呼出氣體成分濃度與正常人群并無明顯差別。
為了分析西方高脂肪飲食結構對呼出氣體的影響，Kistler等[21]用PTR-TOF-MS測量了不同飲食結構(高脂肪飲食和低脂肪飲食)下小白鼠的呼出氣體成分。結果顯示，飲食結構由以植物原料為主的飼料，分別變成脂肪含量不同的半純化飼料后，甲醇、乙酸甲酯和二甲基砜離子的濃度顯著減少。研究證實，高脂肪飲食結構會影響呼出氣體中部分VOCs的濃度，為分析新陳代謝功能提供了依據。
研究證實了PTR-MS不僅可以對不同飲食結構進行區分，而且可以通過檢測呼出氣體的變化評價新陳代謝功能，檢測方法無損簡便，是極具潛力的飲食結構分析手段。
2.4 我國目前的研究進展
中科院安徽光學精密機械研究所是國內PTR-MS檢測呼出氣體的主要研究單位，不僅搭建了可在線檢測呼氣VOCs的PTR-MS系統，而且以此為基礎完成了對高血糖呼氣標志物的研究工作。
沈成銀等[22]通過對自主研制的大氣成分在線檢測PTR-MS的進樣管路系統進行改造，建立了可在線檢測呼氣VOCs的PTR-MS裝置。通過控制呼氣進樣系統的旁路流量來實現對進樣速度的控制，可實時監測呼氣中指定成分的濃度變化，也可對呼氣成分進行快速全譜分析。以此為基礎，楊彬等[23]對70例血糖含量正常的志愿者與22例高血糖志愿者的呼氣進行實時在線分析。實驗結果表明兩組受試者呼氣存在5種差異VOCs，其質荷比(m/z)分別為61、31、120、104、82。以5種VOCs建立判別模型的ROC曲線顯示，診斷靈敏度為0.864，特異度為0.843，AUC=0.926，具有較高的準確性。同時作者還發現兩組受試者的呼氣丙酮含量無顯著差異，由此推斷丙酮含量與血糖濃度之間無相關性。然而研究未能確定5種VOCs的確切成分和代謝來源，相關研究仍處于探索階段。
3 呼出氣體影響因素分析
PTR-MS檢測呼出氣體中VOCs的濃度時，檢測結果會受到CO2濃度、氣體濕度、檢測環境等多種因素的影響。綜合分析各因素的影響程度，對呼出氣體VOCs濃度測量的準確性具有重要意義。
3.1 CO2濃度對呼出氣體測量結果的影響
CO2是人體呼出氣體的主要成分之一，其濃度可能隨身體健康狀態和呼氣采集方式的不同存在較大差異。Keck等[24]針對人體呼出氣體中的幾種主要VOCs(包括甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、丙酮和異戊二烯等)，分析了不同CO2濃度對其測量結果的影響。研究發現當CO2濃度升高5%時，幾種VOCs的測量濃度均有一定的升高，如甲醇測量濃度約升高10%，而乙醇的測量濃度升高約60%。主要原因是CO2的質量數遠大于空氣平均分子質量數，CO2濃度升高使得離子遷移率μ下降，離子遷移速率vd和平均中間質動能KEcm隨之下降，造成漂移管內水合氫離子團簇(H2O·H3O+)濃度的升高，使得呼出氣體中VOCs的測量濃度偏高。
3.2 氣體濕度對呼出氣體測量結果的影響
人體呼出氣體的相對濕度較高，且易受到環境濕度、肺活量、身體健康狀態等多種因素的影響。Beauchamp等[25]研究了不同呼出氣體相對濕度與水合氫離子團簇(H2O·H3O+)濃度的關系。當相對濕度由20%增長至90%時，水合氫離子團簇的濃度由3%增長至12%。與CO2的影響方式類似，水合氫離子團簇的增加會造成呼出氣體中VOCs的測量濃度偏高。由于實驗在室溫(22.4℃)下進行，此時90%的相對濕度相當于體溫(37℃)下40%的相對濕度，而正常生理狀況下人體的呼出氣體濕度可以達到100%，因此相對濕度對于測量結果的影響程度遠大于CO2。此外，由于呼出氣體的濕度較高，水合氫離子團簇計數值cps(37)常會達到2×106以上。這么高的信號值可能會使電子倍增器達到飽和狀態，造成測量結果偏低，長時間測量甚至可能會對電子倍增器造成損傷。
3.3 檢測環境對呼出氣體測量結果的影響
檢測環境中的背景VOCs同樣會對PTR-MS檢測呼出氣體造成干擾，實際測量中應針對具體的檢測環境確定主要的背景VOCs并加以分析研究。例如在麻醉后監測治療室(post anesthesia care unit，PACU)內，七氟醚的濃度明顯高于人體呼出氣體的正常范圍。為了分析七氟醚在檢測環境和呼出氣體中可能存在的濃度關系，Trefz等[26]運用PTR-TOF-MS對PACU內志愿者的呼出氣體進行實時在線監測。結果證實呼出氣體中七氟醚的濃度與外部檢測環境具有較好的一致性(R2=0.94)。這一結果證實了外部環境會對呼出氣體的檢測結果造成影響，如何排除不同檢測環境下的背景VOCs干擾尚在進一步研究之中。
此外，PTR-MS測量結果還會受到呼氣方式、采樣方式等多方因素的影響。如何科學評價各因素對測量結果的影響程度，并針對各因素建立有效的修正方法，是下一步的主要研究方向。
4 總結與展望
相比于傳統的血液、尿液檢測等手段，呼出氣體檢測具有采樣無損、操作便利等優點，是醫療檢測領域的研究熱點。在眾多呼出氣體檢測手段中，PTR-MS由于其特有的樣品無需預處理、靈敏度高、響應速度快、不受空氣中常規組分干擾等優點，在人體呼出氣體檢測領域具有廣闊的應用空間。早期的研究以分析疾病與呼氣標志物的關系為主要目標，其中的許多研究成果已經證實了PTR-MS在線檢測呼出氣體的可行性和準確性，并且確定了部分疾病的呼氣標志物。但是由于VOCs的含量在個體之間存在著較大的差異，并且不同研究的實驗標準和條件也不盡相同，因此很難形成統一的標準規范來分析和研究呼氣標志物與疾病的具體關系。近年來PTR-MS在呼出氣體研究領域的應用趨于廣泛化，如分析飲食結構、評價藥物療效、研究新陳代謝等。可以預見人體呼出氣體檢測的標準化和規范化將會是未來科研工作者的共同目標。而隨著PTR-MS的商品化、小型化以及各種性能參數的提高，其在人體呼出氣體檢測領域必將發揮著日益重要的作用。