種植體表面涂層改性可提高其骨誘導性, 其中單純鈣磷涂層已被廣泛研究, 但其促骨整合速率慢、抗菌性低, 其他金屬離子如納米鋅離子的加入可彌補這些缺陷。本文闡述了該改良涂層中納米鋅的摻入形式、對材料理化性能的影響以及抑菌性, 同時歸納了鈣離子、鋅離子和無機磷賦予材料的生物學性能主要集中于三種無機離子對成骨細胞增殖分化、蛋白合成及基質礦化等方面的作用, 以全面闡述納米摻鋅鈣磷涂層對骨形成的促進作用。
引用本文： 羅雯靜, 趙靜輝, 孟星, 馬珊珊, 孫千月, 郭天奇, 王玉峰, 周延民. 鈣磷涂層中摻入鋅對成骨的影響及其潛在生物學機制. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(6): 1359-1363. doi: 10.7507/1001-5515.20150240 復制
0 引言
眾所周知，口腔內種植的術后效果與鈦種植體周圍骨形成能力有很大關聯。商業用純鈦雖具有良好生物相容性，但其生物惰性決定了其與宿主骨之間難以形成緊密的骨整合，所以種植體表面改性成為了眾多學者科研工作的研究熱點。其中包括通過表面處理和表面改性改變種植體表面形貌、親水性、剛度和化學組分，以增加種植體的骨誘導性和抗菌性。涂層中的化學構成元素能不同程度地促進成骨細胞活性，抑制破骨細胞生物學行為，進而促進種植體周的骨整合。如鈣和磷，作為成熟骨組織的主要無機成分能在促成骨中發揮重要作用。但單純鈣磷涂層存在機械、結合強度低以及生物性能單一等缺點，因此，有學者致力于在現有鈣磷涂層中摻入其他元素(如納米鋅)來改變涂層材料的理化性能及生物性能。
1 納米摻鋅鈣磷涂層的理化性能及抑菌性
1.1 鋅在鈣磷涂層中的結合形式
鋅原子占據羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)中間間隙位置即wycokoff 2b點后形成了Ca10Znx(PO4)6O2x(OH)2-2x。O2-替代羥基形成O-Zn-O線性結構可保持分子電中性。鋅加入到三磷酸鈣(tricaleium phosphate, TCP)中，該分子可變為Ca3-xZnx(PO4)2。但關于鋅摻入Ca-P涂層現存不同觀點。如認為其溶解度從1~15 mol%不等；鋅原子存在的位置，有學者認為鋅吸附在HA表面(四或六配位體)，也有認為鋅結合進入HA內部并占據1~2個結晶相鈣位點(九配位Ca1位點和/或七配位Ca2位點)[1]。其中Tang等[1]認為鋅最有可能存在于Ca2位點形成四面體配位結合，這就意味著HA的結構會發生巨大改變。Matsunaga等[2]也認可鋅結合進入HA內部，但認為鋅是占據了原有的鈣空缺位。Tang的四面體配位學說雖然也被Bazin等[3]認可，但他們認為鋅吸附于HA表面而非結合入內部。鋅進入β-TCP是通過取代低密度列的鈣，如Ca4、Ca5結晶位點。鋅摻入Ca-P涂層中可促進種植體周圍骨形成同時賦予材料抗菌性能。
1.2 鋅對鈣磷涂層理化性能的影響
有實驗表明隨著摻入鋅含量增加，鈣含量逐漸降低，且Ca的存在形式逐漸趨向于氧化鈣而非HA[4]，鋅過量添加入鈣磷涂層中時會影響HA結晶，當n(Zn)/n(Ca)達到0.5時，HA的結晶會被嚴重破壞，而在0.005~0.05間時，鋅含量對HA相結晶無明顯影響。隨著鋅加入量的增加，HA結晶度逐漸降低，由六邊形橫截面的晶體變為圓截面棒狀，同時鋅的替代及鋅離子間相互移動使HA體積逐漸縮小。鋅可促進涂層-鈦基底結合力。涂層與金屬基底間的結合力由界面結構的匹配度決定，由于鋅的加入，在沉積初期即可形成較強的Ti-O-Ca-Zn鍵，且化學鍵力與鋅濃度呈正相關。同時鋅的加入可增加材料親水性及粗糙度。Tris緩沖液浸泡試驗表明鋅離子在浸泡初期濃度明顯增加，以后無明顯變化。
1.3 摻入鋅的抑菌性及機制
納米鋅粒子是粒徑大小為1~100 nm的納米顆粒，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、霉菌及病毒均具有較強的殺傷力。一般認為其抗菌能力與離子濃度、存在形式、載體成分及材料表面涂層粗糙度、材料表面電荷量、鋅離子釋放能力等有關。而關于鋅離子的抑菌機制主要包括：一、溶出抗菌學說，即抗菌材料中溶出的鋅離子與細菌接觸而產生的抗菌作用。鋅離子溶出抗菌的機制為：①破壞細胞膜功能：鋅離子釋放至微生物細胞膜時，所帶正電荷改變膜內外的極化狀態及離子濃度差, 阻礙營養物質運輸。②進入菌體內，與蛋白質中氮和氧元素絡合, 破壞空間構象；結合或代替激發酶活性的金屬離子, 如Mg2+、Fe3+和鈣等導致酶類變性。③與核酸結合, 破壞細胞的分裂繁殖能力，達到抑菌和殺菌的目的。二、接觸抗菌學說：鋅通過電荷吸附至細菌表面與其膜中蛋白中的巰基、氨基等功能團反應使蛋白質變性，進而破壞細菌能量代謝系統、呼吸系統及電子傳輸系統。三、光催化抗菌學說：鋅及其氧化物在光照的條件下催化水和溶解的氧生成OH-和O2-等氧自由基，可與胞膜中的不飽和脂肪酸反應，造成膜流動性降低、通透性增加，破壞酶活性，甚至在DNA復制階段破壞其氫鍵和主鏈，抑制細菌的繁殖。
2 納米摻鋅鈣磷涂層的生物學性能
2.1 鈣磷涂層對成骨的影響及機制
2.1.1 鈣磷涂層對成骨的影響
天然骨組織是一種主要由有機蛋白、無機礦物質及細胞構成的結締組織[5]。在組織工程學中，骨的修復與再生過程是生物材料、細胞與微環境共同作用的結果[6]。鈣磷涂層因其與骨質無機成分極其相似，而被運用于骨缺損修復治療中。同時，鈣磷涂層可增強生物材料親水性，促進機體內液體的快速滲透并穩定血凝塊，進而機化成骨[7]。Lee等[8]構建并檢測了多孔狀β-TCP/HA復合物的生物性能，結果顯示此種涂層在數量及質量上明顯促進新骨形成。β-TCP因具有骨誘導性而在臨床上得到了廣泛的應用[9]。將此材料放入培養基時，培養基中大量鈣磷離子析出并沉積于材料表面，最終形成鈣磷晶體[10]。已有大量體內、外實驗從不同角度證明鈣離子(Ca2+)和磷酸鹽(PO43-)離子可促進成骨相關細胞的遷移、增殖和分化。現對鈣磷元素的促成骨機制進行簡單總結。
2.1.2 鈣促成骨機制
①促細胞遷移：高濃度Ca2+(3~10 mmol/L)可劑量依賴性吸引前體成骨細胞遷移到骨吸收區域。Ca2+流入胞內致膜極化在維持細胞遷移上發揮重要作用[9]。②促細胞增殖：鈣在適宜濃度和處理時間條件下，可誘導細胞進入DNA合成及細胞分裂階段；鈣信號通路下游的磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，P3K)和絲蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase，AKT)可保證成骨細胞存活。③促細胞礦化：Ca2+通過存在于成骨細胞中的Ca2+敏感性通道、電壓門控Ca2+通道或1，4，5-三磷酸肌醇受體進入胞內激活鈣/鈣調蛋白通路，最終影響C-FOS和活性T細胞轉錄因子(nuclear factor of activated T cell, NFAT2)、核轉錄因子(nuclear factor-kappa B, Nf-κB)等轉錄因子活性，并刺激其向細胞核內移位，進而促進RUNX2表達，參與調控成骨細胞增殖和分化[11-12]，同時上調骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)基因表達，活化BMP信號通路。除了對細胞增殖分化有影響外，鈣還能直接參與到基質礦化過程中，但對于參與形式現存兩種觀點：①直接成核：Ca-P結晶與可溶性功能化基質膠原二聚體結合成核后形成穩定礦化復合物后結合到膠原纖維上的特定區域。同時，Ca-P促骨鈣素表達而骨鈣素可促進Ca2+與胞外基質的結合，進而調控礦化晶體的生長和大小。②分泌礦化：成骨細胞內部含鈣磷晶體的質膜小泡介導胞外基質礦化。
2.1.3 磷促成骨機制
磷對成骨細胞的調節呈濃度依賴，2~4 mmol/L即可促進成骨細胞分泌蛋白，而高濃度外源性磷(5~7 mmol/L)可導致線粒體功能障礙，使成骨細胞凋亡和非生理性礦物質沉積。磷是胞內信號傳導通路的重要組分。PO43-會調控細胞周期和增殖, 改變信號轉導通路(如Fos相關抗原-1：fra-1)、胞外信號調節蛋白激酶(如extracellular regulated protein kinases ERK1/2)和基因表達及成骨相關蛋白分泌，如γ-羧基谷氨酸基質蛋白。磷酸充分酸蝕過的純鈦種植體表面可形成一層Ti(H2PO4)3多聚薄膜。這層膜可化學性結合到細胞基質和富磷酸基、羥基官能團以誘導體外仿生礦化。磷酸化鈦表面可明顯促進細胞增殖、分化，賦予種植體極高的細胞親和性[13]。磷在生理性骨基質礦化過程中的作用主要由堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)及BMP-2介導。BMP-2可作用于鈉依賴性磷轉運體以促進磷轉運，磷會抑制活化的鋅中心解離進而增加ALP活性。磷和鋅是僅有的兩種具有直接調節ALP活性功能的無機離子。
2.2 鋅對成骨的影響及機制
2.2.1 鋅對成骨的影響
無機物如金屬離子銅、鋅、鍶被證實可促進骨及血管形成而被認為具有極大應用前景。已有實驗表明，通過電化學沉積方法在純鈦表面構建摻鋅鈣磷涂層可促進成骨細胞分化增殖，這對種植體周骨整合存在潛在的促進作用[14]。鋅既是骨組織組成成分，又參與骨代謝過程，它影響的酶達100多種[15]。比如鋅是糖原合成激酶的抑制劑，而這種酶參與Wnt信號通路，由此可知鋅可通過調節相關酶活性而在骨形成中發揮作用。另外一些學者發現鋅可誘導骨髓間充質干細胞成骨分化[16]。Alvarez等[17]用Zn(OH)42-溶液處理種植體發現其骨結合率明顯上升；Li等[18]證實含有鋅的α-TCP可促進新骨形成。雖然納米摻鋅鈣磷涂層對骨形成有促進效果，但也有學者發現在動物實驗晚期這種涂層會促進骨吸收，這可能與釋放鋅離子濃度累積過高及種植體植入方式有關。一般認為低量鋅(＜1wt%)有較好的生物相容性、抗菌性，有學者認為1.3wt%鋅進入HA可增強成骨細胞反應，但TCP中摻入大于1.2wt%的鋅是具有細胞毒性的。關于鋅的促成骨效果、生物降解濃度、促礦化物形成能力、活化成骨細胞性能及抗炎、促血管化行為等方面的文獻報道存在不少差異[19]。過量鋅積聚會抑制成骨細胞活性甚至致調亡，因此鋅緩釋問題是一個研究重點。Sharma等[20]通過氧化鋅納米微球細胞共培養檢測培養液中離子濃度，發現鋅于第6小時濃度達1.2μg/mL之后24 h內保持穩定，也有研究顯示摻入鋅TCP具緩釋能力。
2.2.2 鋅促成骨機制
現階段關于鋅對骨代謝影響的機制仍未完全闡述。鋅可活化ALP、促膠原合成、促成骨細胞分化增殖、礦化，抑制成骨細胞終末凋亡的同時可抑制破骨細胞分化及骨吸收[21-23]。體外實驗表明，在氟化的羥基磷灰石涂層中摻入鋅離子可增加細胞活力并促進骨形成。有學者認為鋅在成骨中的作用主要通過胞內外鋅運動完成。鋅離子轉運主要由貯藏蛋白和離子轉運體介導。鋅轉運體家族成員包括促鋅內流的SLC39基因調控的ZIP類及促鋅外流的SLC30調控的鋅T類。通過微陣列分析技術觀察到BMP和轉化生長因子-β在ZIP13-KO細胞中受影響，隨后smad在細胞核內的定位也受干擾，ZIP功能的損害可致骨形成遲緩；在鋅T5-KO小鼠體內骨形成速率降低，ALP及礦化活動受抑。有學者認為在細胞內存在鋅離子信號通路，但具體路徑有待研究[24]。鋅是成骨細胞中ALP輔基，可增強ALP活性。缺鋅會導致ALP活性下降。ALP中存在鋅原子，它是ALP同源二聚體金屬基質酶的重要組分[25]。鋅對ALP活性增強的作用主要表現在細胞培養早期即細胞增殖(第1~5天)到基質成熟和早期礦化(第10天)階段。另一方面，鋅作為細胞膜不可或缺的成分，對溶酶體膜起著保護作用。在破骨細胞內存在大量溶酶體，鋅缺乏會降低膜穩定性，使其發生特異性改變。最近，Yamasaki等[26]報道內質網L型鈣通道的a1D亞基是胞內鋅信號門控開關，它會積極調控抗原刺激后肥大細胞內NF-κB結合DNA能力。另有實驗顯示鋅促成骨抑破骨可能與NF-κB的拮抗及骨橋蛋白的活化有關[21]。NF-κB是一個多效性轉錄因子，負責調控破骨細胞形成、功能及存活。鋅信號可能參與某個由NF-κB介導的致破骨信號通路如RANK通路。在缺鋅小鼠模型體內檢測到NF-κB調控靶向基因表達上調，其中包括白介素-1β、腫瘤壞死因子-α等。而在加入鋅后，這些反應都明顯降低。TNF-α是致破骨發生細胞因子，不僅上調核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)產量，與RANKL協同促進破骨細胞活性，同時抑制成骨細胞成骨。從這一角度講，鋅可抑制NF-κB活性，通過降低TNF活性而間接促成骨。鋅會降低抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)及組織蛋白酶K(cathepsin K)活性, 下調NF-κB、c-fos、c-jun受體和TRAP、cathepsin K mRNA水平明顯降低，從而抑制破骨細胞分化。事實上，鋅不僅影響破骨細胞生物活性影響骨吸收，還會調控巨噬細胞向破骨細胞分化[27]。
缺鋅能影響所有類型膠原的生物合成及降解。細胞膠原水平在鋅處理第一天不會立即上升，而是隨時間延長逐漸增加。有實驗表明第十天鋅濃度達到最大(25 mmol/L)時，膠原的合成水平最高。基質膠原會參與細胞黏附過程，因此鋅可促進成骨樣細胞黏附，促進骨基質成熟。
通過膜片鉗技術發現心肌細胞內存在鋅、鈣內向電流。使用鈣通道阻滯劑尼莫地平后不但不會抑制細胞對65Zn的攝取，反而增強細胞攝取量。學者初步將這一現象解釋為：鋅、鈣是細胞活動必需的二價陽離子，二者對應的轉運蛋白在空間功能上相互制衡，這兩種離子的轉運相互拮抗。但現尚不能肯定成骨細胞中是否存在鋅、鈣競爭性內流通道。
4 結論
綜上所述，傳統鈣磷涂層存在機械及生物學性能方面的缺陷，在涂層中摻入鋅不僅能賦予材料以抑菌性和改善理化性能，同時能在安全劑量范圍內以時間劑量依賴性方式促成骨，具體作用形式包括促成骨樣細胞生成，成骨細胞遷移、黏附、增殖、分化和基質礦化，同時抑制破骨細胞功能和調控凋亡。加之鋅離子在抑菌方面的優勢，Zn-Ca-P涂層有利于種植體周骨整合。如果日后這種復合生物材料應用到臨床，相信能明顯改善種植術后效果。但對于此種改良涂層的研究仍不成熟，很多問題仍未探究明確，其中包括三種離子間的相互作用、離子緩釋問題、涂層厚度、強度調控、構建方法優化及各元素調控成骨的具體生物學機制，這些都可能成為今后的研究熱點。
0 引言
眾所周知，口腔內種植的術后效果與鈦種植體周圍骨形成能力有很大關聯。商業用純鈦雖具有良好生物相容性，但其生物惰性決定了其與宿主骨之間難以形成緊密的骨整合，所以種植體表面改性成為了眾多學者科研工作的研究熱點。其中包括通過表面處理和表面改性改變種植體表面形貌、親水性、剛度和化學組分，以增加種植體的骨誘導性和抗菌性。涂層中的化學構成元素能不同程度地促進成骨細胞活性，抑制破骨細胞生物學行為，進而促進種植體周的骨整合。如鈣和磷，作為成熟骨組織的主要無機成分能在促成骨中發揮重要作用。但單純鈣磷涂層存在機械、結合強度低以及生物性能單一等缺點，因此，有學者致力于在現有鈣磷涂層中摻入其他元素(如納米鋅)來改變涂層材料的理化性能及生物性能。
1 納米摻鋅鈣磷涂層的理化性能及抑菌性
1.1 鋅在鈣磷涂層中的結合形式
鋅原子占據羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)中間間隙位置即wycokoff 2b點后形成了Ca10Znx(PO4)6O2x(OH)2-2x。O2-替代羥基形成O-Zn-O線性結構可保持分子電中性。鋅加入到三磷酸鈣(tricaleium phosphate, TCP)中，該分子可變為Ca3-xZnx(PO4)2。但關于鋅摻入Ca-P涂層現存不同觀點。如認為其溶解度從1~15 mol%不等；鋅原子存在的位置，有學者認為鋅吸附在HA表面(四或六配位體)，也有認為鋅結合進入HA內部并占據1~2個結晶相鈣位點(九配位Ca1位點和/或七配位Ca2位點)[1]。其中Tang等[1]認為鋅最有可能存在于Ca2位點形成四面體配位結合，這就意味著HA的結構會發生巨大改變。Matsunaga等[2]也認可鋅結合進入HA內部，但認為鋅是占據了原有的鈣空缺位。Tang的四面體配位學說雖然也被Bazin等[3]認可，但他們認為鋅吸附于HA表面而非結合入內部。鋅進入β-TCP是通過取代低密度列的鈣，如Ca4、Ca5結晶位點。鋅摻入Ca-P涂層中可促進種植體周圍骨形成同時賦予材料抗菌性能。
1.2 鋅對鈣磷涂層理化性能的影響
有實驗表明隨著摻入鋅含量增加，鈣含量逐漸降低，且Ca的存在形式逐漸趨向于氧化鈣而非HA[4]，鋅過量添加入鈣磷涂層中時會影響HA結晶，當n(Zn)/n(Ca)達到0.5時，HA的結晶會被嚴重破壞，而在0.005~0.05間時，鋅含量對HA相結晶無明顯影響。隨著鋅加入量的增加，HA結晶度逐漸降低，由六邊形橫截面的晶體變為圓截面棒狀，同時鋅的替代及鋅離子間相互移動使HA體積逐漸縮小。鋅可促進涂層-鈦基底結合力。涂層與金屬基底間的結合力由界面結構的匹配度決定，由于鋅的加入，在沉積初期即可形成較強的Ti-O-Ca-Zn鍵，且化學鍵力與鋅濃度呈正相關。同時鋅的加入可增加材料親水性及粗糙度。Tris緩沖液浸泡試驗表明鋅離子在浸泡初期濃度明顯增加，以后無明顯變化。
1.3 摻入鋅的抑菌性及機制
納米鋅粒子是粒徑大小為1~100 nm的納米顆粒，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、霉菌及病毒均具有較強的殺傷力。一般認為其抗菌能力與離子濃度、存在形式、載體成分及材料表面涂層粗糙度、材料表面電荷量、鋅離子釋放能力等有關。而關于鋅離子的抑菌機制主要包括：一、溶出抗菌學說，即抗菌材料中溶出的鋅離子與細菌接觸而產生的抗菌作用。鋅離子溶出抗菌的機制為：①破壞細胞膜功能：鋅離子釋放至微生物細胞膜時，所帶正電荷改變膜內外的極化狀態及離子濃度差, 阻礙營養物質運輸。②進入菌體內，與蛋白質中氮和氧元素絡合, 破壞空間構象；結合或代替激發酶活性的金屬離子, 如Mg2+、Fe3+和鈣等導致酶類變性。③與核酸結合, 破壞細胞的分裂繁殖能力，達到抑菌和殺菌的目的。二、接觸抗菌學說：鋅通過電荷吸附至細菌表面與其膜中蛋白中的巰基、氨基等功能團反應使蛋白質變性，進而破壞細菌能量代謝系統、呼吸系統及電子傳輸系統。三、光催化抗菌學說：鋅及其氧化物在光照的條件下催化水和溶解的氧生成OH-和O2-等氧自由基，可與胞膜中的不飽和脂肪酸反應，造成膜流動性降低、通透性增加，破壞酶活性，甚至在DNA復制階段破壞其氫鍵和主鏈，抑制細菌的繁殖。
2 納米摻鋅鈣磷涂層的生物學性能
2.1 鈣磷涂層對成骨的影響及機制
2.1.1 鈣磷涂層對成骨的影響
天然骨組織是一種主要由有機蛋白、無機礦物質及細胞構成的結締組織[5]。在組織工程學中，骨的修復與再生過程是生物材料、細胞與微環境共同作用的結果[6]。鈣磷涂層因其與骨質無機成分極其相似，而被運用于骨缺損修復治療中。同時，鈣磷涂層可增強生物材料親水性，促進機體內液體的快速滲透并穩定血凝塊，進而機化成骨[7]。Lee等[8]構建并檢測了多孔狀β-TCP/HA復合物的生物性能，結果顯示此種涂層在數量及質量上明顯促進新骨形成。β-TCP因具有骨誘導性而在臨床上得到了廣泛的應用[9]。將此材料放入培養基時，培養基中大量鈣磷離子析出并沉積于材料表面，最終形成鈣磷晶體[10]。已有大量體內、外實驗從不同角度證明鈣離子(Ca2+)和磷酸鹽(PO43-)離子可促進成骨相關細胞的遷移、增殖和分化。現對鈣磷元素的促成骨機制進行簡單總結。
2.1.2 鈣促成骨機制
①促細胞遷移：高濃度Ca2+(3~10 mmol/L)可劑量依賴性吸引前體成骨細胞遷移到骨吸收區域。Ca2+流入胞內致膜極化在維持細胞遷移上發揮重要作用[9]。②促細胞增殖：鈣在適宜濃度和處理時間條件下，可誘導細胞進入DNA合成及細胞分裂階段；鈣信號通路下游的磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，P3K)和絲蘇氨酸激酶(serine-threonine kinase，AKT)可保證成骨細胞存活。③促細胞礦化：Ca2+通過存在于成骨細胞中的Ca2+敏感性通道、電壓門控Ca2+通道或1，4，5-三磷酸肌醇受體進入胞內激活鈣/鈣調蛋白通路，最終影響C-FOS和活性T細胞轉錄因子(nuclear factor of activated T cell, NFAT2)、核轉錄因子(nuclear factor-kappa B, Nf-κB)等轉錄因子活性，并刺激其向細胞核內移位，進而促進RUNX2表達，參與調控成骨細胞增殖和分化[11-12]，同時上調骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)基因表達，活化BMP信號通路。除了對細胞增殖分化有影響外，鈣還能直接參與到基質礦化過程中，但對于參與形式現存兩種觀點：①直接成核：Ca-P結晶與可溶性功能化基質膠原二聚體結合成核后形成穩定礦化復合物后結合到膠原纖維上的特定區域。同時，Ca-P促骨鈣素表達而骨鈣素可促進Ca2+與胞外基質的結合，進而調控礦化晶體的生長和大小。②分泌礦化：成骨細胞內部含鈣磷晶體的質膜小泡介導胞外基質礦化。
2.1.3 磷促成骨機制
磷對成骨細胞的調節呈濃度依賴，2~4 mmol/L即可促進成骨細胞分泌蛋白，而高濃度外源性磷(5~7 mmol/L)可導致線粒體功能障礙，使成骨細胞凋亡和非生理性礦物質沉積。磷是胞內信號傳導通路的重要組分。PO43-會調控細胞周期和增殖, 改變信號轉導通路(如Fos相關抗原-1：fra-1)、胞外信號調節蛋白激酶(如extracellular regulated protein kinases ERK1/2)和基因表達及成骨相關蛋白分泌，如γ-羧基谷氨酸基質蛋白。磷酸充分酸蝕過的純鈦種植體表面可形成一層Ti(H2PO4)3多聚薄膜。這層膜可化學性結合到細胞基質和富磷酸基、羥基官能團以誘導體外仿生礦化。磷酸化鈦表面可明顯促進細胞增殖、分化，賦予種植體極高的細胞親和性[13]。磷在生理性骨基質礦化過程中的作用主要由堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)及BMP-2介導。BMP-2可作用于鈉依賴性磷轉運體以促進磷轉運，磷會抑制活化的鋅中心解離進而增加ALP活性。磷和鋅是僅有的兩種具有直接調節ALP活性功能的無機離子。
2.2 鋅對成骨的影響及機制
2.2.1 鋅對成骨的影響
無機物如金屬離子銅、鋅、鍶被證實可促進骨及血管形成而被認為具有極大應用前景。已有實驗表明，通過電化學沉積方法在純鈦表面構建摻鋅鈣磷涂層可促進成骨細胞分化增殖，這對種植體周骨整合存在潛在的促進作用[14]。鋅既是骨組織組成成分，又參與骨代謝過程，它影響的酶達100多種[15]。比如鋅是糖原合成激酶的抑制劑，而這種酶參與Wnt信號通路，由此可知鋅可通過調節相關酶活性而在骨形成中發揮作用。另外一些學者發現鋅可誘導骨髓間充質干細胞成骨分化[16]。Alvarez等[17]用Zn(OH)42-溶液處理種植體發現其骨結合率明顯上升；Li等[18]證實含有鋅的α-TCP可促進新骨形成。雖然納米摻鋅鈣磷涂層對骨形成有促進效果，但也有學者發現在動物實驗晚期這種涂層會促進骨吸收，這可能與釋放鋅離子濃度累積過高及種植體植入方式有關。一般認為低量鋅(＜1wt%)有較好的生物相容性、抗菌性，有學者認為1.3wt%鋅進入HA可增強成骨細胞反應，但TCP中摻入大于1.2wt%的鋅是具有細胞毒性的。關于鋅的促成骨效果、生物降解濃度、促礦化物形成能力、活化成骨細胞性能及抗炎、促血管化行為等方面的文獻報道存在不少差異[19]。過量鋅積聚會抑制成骨細胞活性甚至致調亡，因此鋅緩釋問題是一個研究重點。Sharma等[20]通過氧化鋅納米微球細胞共培養檢測培養液中離子濃度，發現鋅于第6小時濃度達1.2μg/mL之后24 h內保持穩定，也有研究顯示摻入鋅TCP具緩釋能力。
2.2.2 鋅促成骨機制
現階段關于鋅對骨代謝影響的機制仍未完全闡述。鋅可活化ALP、促膠原合成、促成骨細胞分化增殖、礦化，抑制成骨細胞終末凋亡的同時可抑制破骨細胞分化及骨吸收[21-23]。體外實驗表明，在氟化的羥基磷灰石涂層中摻入鋅離子可增加細胞活力并促進骨形成。有學者認為鋅在成骨中的作用主要通過胞內外鋅運動完成。鋅離子轉運主要由貯藏蛋白和離子轉運體介導。鋅轉運體家族成員包括促鋅內流的SLC39基因調控的ZIP類及促鋅外流的SLC30調控的鋅T類。通過微陣列分析技術觀察到BMP和轉化生長因子-β在ZIP13-KO細胞中受影響，隨后smad在細胞核內的定位也受干擾，ZIP功能的損害可致骨形成遲緩；在鋅T5-KO小鼠體內骨形成速率降低，ALP及礦化活動受抑。有學者認為在細胞內存在鋅離子信號通路，但具體路徑有待研究[24]。鋅是成骨細胞中ALP輔基，可增強ALP活性。缺鋅會導致ALP活性下降。ALP中存在鋅原子，它是ALP同源二聚體金屬基質酶的重要組分[25]。鋅對ALP活性增強的作用主要表現在細胞培養早期即細胞增殖(第1~5天)到基質成熟和早期礦化(第10天)階段。另一方面，鋅作為細胞膜不可或缺的成分，對溶酶體膜起著保護作用。在破骨細胞內存在大量溶酶體，鋅缺乏會降低膜穩定性，使其發生特異性改變。最近，Yamasaki等[26]報道內質網L型鈣通道的a1D亞基是胞內鋅信號門控開關，它會積極調控抗原刺激后肥大細胞內NF-κB結合DNA能力。另有實驗顯示鋅促成骨抑破骨可能與NF-κB的拮抗及骨橋蛋白的活化有關[21]。NF-κB是一個多效性轉錄因子，負責調控破骨細胞形成、功能及存活。鋅信號可能參與某個由NF-κB介導的致破骨信號通路如RANK通路。在缺鋅小鼠模型體內檢測到NF-κB調控靶向基因表達上調，其中包括白介素-1β、腫瘤壞死因子-α等。而在加入鋅后，這些反應都明顯降低。TNF-α是致破骨發生細胞因子，不僅上調核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κB ligand, RANKL)產量，與RANKL協同促進破骨細胞活性，同時抑制成骨細胞成骨。從這一角度講，鋅可抑制NF-κB活性，通過降低TNF活性而間接促成骨。鋅會降低抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)及組織蛋白酶K(cathepsin K)活性, 下調NF-κB、c-fos、c-jun受體和TRAP、cathepsin K mRNA水平明顯降低，從而抑制破骨細胞分化。事實上，鋅不僅影響破骨細胞生物活性影響骨吸收，還會調控巨噬細胞向破骨細胞分化[27]。
缺鋅能影響所有類型膠原的生物合成及降解。細胞膠原水平在鋅處理第一天不會立即上升，而是隨時間延長逐漸增加。有實驗表明第十天鋅濃度達到最大(25 mmol/L)時，膠原的合成水平最高。基質膠原會參與細胞黏附過程，因此鋅可促進成骨樣細胞黏附，促進骨基質成熟。
通過膜片鉗技術發現心肌細胞內存在鋅、鈣內向電流。使用鈣通道阻滯劑尼莫地平后不但不會抑制細胞對65Zn的攝取，反而增強細胞攝取量。學者初步將這一現象解釋為：鋅、鈣是細胞活動必需的二價陽離子，二者對應的轉運蛋白在空間功能上相互制衡，這兩種離子的轉運相互拮抗。但現尚不能肯定成骨細胞中是否存在鋅、鈣競爭性內流通道。
4 結論
綜上所述，傳統鈣磷涂層存在機械及生物學性能方面的缺陷，在涂層中摻入鋅不僅能賦予材料以抑菌性和改善理化性能，同時能在安全劑量范圍內以時間劑量依賴性方式促成骨，具體作用形式包括促成骨樣細胞生成，成骨細胞遷移、黏附、增殖、分化和基質礦化，同時抑制破骨細胞功能和調控凋亡。加之鋅離子在抑菌方面的優勢，Zn-Ca-P涂層有利于種植體周骨整合。如果日后這種復合生物材料應用到臨床，相信能明顯改善種植術后效果。但對于此種改良涂層的研究仍不成熟，很多問題仍未探究明確，其中包括三種離子間的相互作用、離子緩釋問題、涂層厚度、強度調控、構建方法優化及各元素調控成骨的具體生物學機制，這些都可能成為今后的研究熱點。