青霉素是世界上最早應用于臨床治療的β-內酰胺類藥物, 目前仍被廣泛應用。產黃青霉(P.Chrysogenum)是青霉素的生產菌, 其合成和調控機制已經研究得比較完善, 但在其蛋白質組學方面的研究起步較晚且相對較少。本文綜述了青霉素的合成與應用, 以及產黃青霉的改造及其蛋白質組學的研究進展。在此基礎上, 重點介紹了蛋白質組學對于研究菌株蛋白表達的優勢。
引用本文： 王順, 王培紅, 張楠, 高瑞昶. 青霉素生產菌-產黃青霉的蛋白質組學研究進展. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(6): 1354-1358. doi: 10.7507/1001-5515.20150239 復制
0 引言
青霉素是β-內酰胺類抗生素中的一類，因抗菌活性強、低毒、便宜等因素而被廣泛應用。隨著科技的發展，抗生素加快了更新換代的趨勢，但青霉素仍被廣泛用于革蘭陽性細菌感染的臨床治療，效果顯著。與此同時，很多新出現的疾病也對青霉素產量提出了更高的要求，高通量研究勢在必行。21世紀后，生物工程進入了“組學”研究時代，如基因組學、蛋白質組學等。蛋白質組學是在整體水平研究蛋白質的動態變化，能更好地幫助人們了解蛋白質間的相互作用與細胞的活動規律、功能及調控相應功能的機制等。對產黃青霉的蛋白質組學研究，將會成為研究青霉素生產的新方向，這不僅有利于研究產黃青霉的蛋白表達和青霉素生產之間的協同關系，而且可以進一步探索以這種通用型真菌作為生產其他化合物的細胞工廠的新途徑，以期合成更多對人類有益的生物代謝產物。
1 青霉素和產黃青霉菌
青霉素可與細胞壁粘肽結構競爭轉肽酶活性中心，干擾細菌細胞壁的合成，從而達到抑制細菌生長的目的[1]。1928年Fleming首次發現該種抗生素，之后將其命名為青霉素[2]。產黃青霉是工業上典型的青霉素生產菌，1943年首次分離出產黃青霉NRRL 1951，青霉素產量150 mg/L，由此產黃青霉成為生產青霉素的主要菌種[3]。NRRL 1951經多代誘變，得到了青霉素產量日益增高、性狀越來越優良的產黃青霉菌株，如X-1612、Wis Q-176、Wis BL3-D10、Wis 48-701、Wis 49-133、Wis 54-1255、DS04825、AS-P-78等[4]，如圖 1所示。產黃青霉合成青霉素的途徑也得到闡釋[5]，首先是L-半胱氨酸、L-纈氨酸和L-α-氨基己二酸經三肽合成酶(L-α-aminoadipate, L-cysteine and L-valine tripeptide synthetase, ACVS)催化形成L-α-氨基己二酸-L-半胱氨酸-D-纈氨酸三肽(L-α-aminoadipate, L-cysteine and L-valine tripeptide, ACV)，ACV經異青霉素N合成酶(isopenicillin N synthetase, IPNS)催化環化形成青霉素母核的雙環結構，生成異青霉素N(isopenicillin N, IPN)，異青霉素N酰基轉移酶(isopenicillin N acyltransferase, IAT)催化疏水性酰基取代IPN中的親水性L-α-AAA側鏈，前體不同則合成青霉素不同，不添加前體時產黃青霉可將苯丙氨酸轉化為苯乙酸(phenylacetic acid, PAA)來合成青霉素G[6]。其中，ACVS、IPNS、IAT[7]分別存在于液泡的膜表面或高爾基體上、細胞質基質中和微體中，前體物質需通過細胞器之間的轉運來完成青霉素的合成[8]。
圖1
產黃青霉工業菌株改良進程圖
Figure1.
Industrial progressive improvement of Penicillium chrysogenum strain
2 產黃青霉等絲狀真菌蛋白質組學研究策略及技術
產黃青霉合成青霉素是其他許多微生物活性代謝產物合成的模型，其過程涉及諸多復雜的生命活動。產黃青霉基因組的建立，使我們知道了青霉素過表達的分子過程，但是僅靠基因序列研究其功能和生命現象是很不精確的。產黃青霉蛋白質組復雜多樣、不斷變化，不同細胞個體中所含蛋白的數量和種類不盡相同，即使是同一細胞，不同環境或不同時期，蛋白質表達也隨時變化[9]。因此，要想對合成過程有全面深入的認識，闡明青霉素在生理或病理條件下合成機制的變化，就必須在整體、網絡、動態的水平上對產黃青霉蛋白質的結構和功能進行研究，即進行產黃青霉蛋白質組學的研究。
產黃青霉蛋白質組學研究主要集中在三方面，即表達蛋白質組學、比較蛋白質組學和免疫蛋白質組學。研究步驟包括蛋白樣品的提取、目的蛋白的分離、蛋白的鑒定和鑒定結果的分析[10]。其中，樣品的預處理對產黃青霉蛋白質組分析是非常關鍵的步驟。產黃青霉作為絲狀真菌具有自身的特殊性，其樣品的預處理和其他絲狀真菌類似，都比較復雜：①與細菌不同，其細胞壁結構堅固緊致，破壁處理相對困難；②提取到的蛋白質需全部溶解在適宜的緩沖液中，以便接下來進行二維凝膠電泳(two dimensional gel electrophoresis, 2DE)分離和質譜分析；③可能會產生分泌蛋白酶，導致蛋白降解。近年，蛋白質分離與鑒定技術如雙向熒光差異電泳[11]、同位素標記技術[12]、蛋白質芯片技術[13]、質譜技術[14]、定量異位標簽技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)[15]等相繼建立，產黃青霉蛋白質組學研究也逐步實現了高通量。目前，研究蛋白質組的策略主要是液質聯用，通過二維液相色譜(two-dimensional liquid chromatography, 2D-LC)將酶解得到肽段分離，再結合串聯質譜(mass spectrometry/mass spectrometry, MS/MS)進行鑒定，最后對相關數據整合分析[16]。
蛋白提取方法在很大程度上影響著蛋白質的得率。胡彬彬等[17]采用了五種方法對釀酒酵母、尖孢鐮刀菌、綠色木霉、產黃青霉、黑曲霉五種真菌總蛋白進行了提取，并用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylanide gelelectmphoresis, SDS-PAGE)分析了條帶豐度。基于此結果對提取方法進行了改進，菌體經液氮研磨破壁處理時，將提取液Ⅰ中的尿素和硫脲提高到8 mol/L和2.5 mol/L，用1×蛋白酶抑制劑混合物替代苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)，提取液Ⅱ中增加0.5% SDS，二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)濃度提高到4%，提取液加入量分別為750μL/100 mg、250μL/100 mg，同時將提取時間增加為60 min和30 min。結果顯示，改進的方法所提取的總蛋白質濃度達到了2.99 mg/mL，比原來的方法相比提高了75%。取相同提取體積的樣品進行SDS-PAGE分析，結果表明改進后的方法在提取效果上有明顯提高，蛋白質得率提高，不僅低豐度的條帶更加明顯，而且高豐度條帶的蛋白點也得到了保持。
利用2DE法分離絲狀真菌的蛋白質，比分離細菌蛋白質相對復雜，處理方法和分離動植物細胞蛋白質類似，一般需用三氯乙酸或甲醇沉淀法進行純化處理[18-19]，這些預處理步驟可以去除干擾二維電泳的雜質，如多糖、脂類、色素等。劉紅等[20]以三氯乙酸-丙酮沉淀蛋白法來制備頂頭孢霉蛋白質組。液氮研磨破壁后，加入預冷的10％三氯乙酸-丙酮溶液混勻，-20℃過夜以沉淀蛋白，離心棄上清后再加入預冷的丙酮溶液洗滌，加入400μL雙向電泳樣品裂解液浸提2 h，得到胞內蛋白質。結果顯示，此方法可減少干擾物的存在，顯著提高蛋白樣品的純度和質量。
研究菌體代謝的分析實驗中，常采用在培養基中添加同位素標記的方法，在產黃青霉等絲狀真菌的蛋白質組學研究中也常用到這種方法，iTRAQ技術就是根據此原理衍生出來的，并在植物(如葡萄)、真菌(如產黃青霉、鏈霉菌)的蛋白質組研究上有一定應用[21]。崔少飛[22]利用2D-LC及MS進行了蛋白鑒定，分析了利迪鏈霉菌添加氨基酸后使利迪鏈菌素增產的同時，對胞內蛋白組帶來的擾動，標記策略為對照組用iTRAQ試劑114標記，添加谷氨酸實驗組用iTRAQ試劑115標記，添加脯氨酸實驗組用iTRAQ試劑116進行標記，結果顯示，該方法能夠很好地得到該菌蛋白的定量信息，一共得到利迪鏈霉菌發酵12 h時98個帶有定量信息的蛋白。
3 產黃青霉胞內蛋白質組學
產黃青霉的蛋白質組分析起始于其細胞內蛋白質組。隨著上述相關技術的發展成熟，建立產黃青霉胞內蛋白質組譜圖就不僅僅是依賴二維凝膠電泳和液質聯用技術了。為了更方便地利用蛋白質組學信息對相關基因進行研究，以及對產黃青霉野生菌及工業改良過程中的變種進行分析，研究者采用了更多新興的高通量技術來得到產黃青霉細胞內蛋白質組信息。Jami等[23]深入研究了產黃青霉在工業菌種改良過程中所得到的3株不同的菌株NRRL 1951、Wis 54-1255、AS-P-78的胞內蛋白質組。將2DE、肽質量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting, PMF)和二維液相質譜(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 2D-LC-MS/MS)等技術用于蛋白質鑒別，鑒定到約1 000個蛋白點，利用基質輔助激光解吸飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)和MS/MS鑒別出950個蛋白質(包括549個不同類型蛋白質)。比較三種菌株的胞內蛋白質組，說明該菌種在工業菌種改良過程發生了全局性代謝重排。
產黃青霉的胞內蛋白質組分析集中于代謝調控、轉運、應激、翻譯等過程。Barreiro等[24]研究了產黃青霉菌株改良過程中蛋白質組的變化，結果顯示，在高生產菌株(AS-P-78)中，與色素、有毒物質等合成相關的蛋白質明顯減少，如葡萄糖氧化酶，它是與產黃青霉導致蘋果病變相關的蛋白；又如一種感染蛋白Cap20，它是與產黃青霉菌感染鱷梨和番茄相關的蛋白。出人意料的是，雖然AS-P-78中與青霉素合成相關的基因拷貝增加了5～6倍，但直接與青霉素合成相關的蛋白并沒有顯著增高。此外，García-Estrada等[25]研究了產黃青霉Wis 54-1255在青霉素生產過程中，經1, 3-二氨基丙烷(1, 3-diaminopropane, 1, 3-DAP)或亞精胺誘導后蛋白組發生的變化。結果顯示兩種誘導劑產生了大致相同的蛋白質組變化，這表明它們可以通過相同的機制發生作用。兩種誘導劑的添加導致青霉素合成途徑中IAT的大量增加，且亞精胺作為誘導劑時，培養物中檢測到了新修飾型的IAT蛋白。加入這兩種誘導劑后，與PAA降解相關兩種酶均減少了，這樣也就增加了PAA的利用率，促進了青霉素G的合成。通常，誘導劑的添加能夠通過改變青霉素合成途徑中的相關酶系從而影響青霉素的生物合成[26]。
空氣中真菌孢子濃度過高可引起過敏反應、呼吸性疾病等。產黃青霉孢子中含有許多與應激響應及免疫應答相關的蛋白質組學信息，使其得到研究人員的關注。Goodman等[27]對產黃青霉孢子的蛋白質組學進行了分析，說明孢子的蛋白質組成與其應激響應以及免疫應答有很大關系。通過用蛋白免疫印跡法(western blotting)將孢子蛋白與患者血清樣品進行免疫反應檢測。結果顯示：反應呈陽性的蛋白質組中60%被發現有甘油醛-3-磷酸脫氫酶。共鑒定分析出了18種與血清樣品免疫反應呈陽性的蛋白，其中有些蛋白的生物學功能尚不明確，推測其可能與孢子的侵襲性生長和傳播有關。
4 產黃青霉分泌蛋白質組學
產黃青霉為腐生菌，會分泌多種胞外酶來分解底物，攝取多種營養物質。這些分泌蛋白的許多酶學特性都與工業合成息息相關，因此研究產黃青霉分泌蛋白質組學對工業生產具有重要意義。
Jami等[28]先研究了產黃青霉Wis 54-1255的胞外蛋白質組，鑒定到131種不同的蛋白質，其中102個蛋白含有分泌信號肽序列。這些蛋白多是與植物細胞壁降解(多聚半乳糖酶、果膠酸裂解酶等)、營養物質的利用(細胞外酸性磷酸酶)和應激反應(過氧化氫酶R)相關的蛋白。又通過3株產黃青霉菌NRRL1951、Wis 54-1255、AS-P-78在培養68 h分泌蛋白質組的比較，發現隨著菌株的逐步改良，與使植物發病、侵襲組織及感染性相關的酶逐漸減少，應激反應蛋白增多，果膠分解酶的量也逐漸增多，如聚半乳糖醛酸酶。
近年來iTRAQ技術逐漸被應用在產黃青霉等真菌的分泌蛋白組分析中。Jami等[23]利用此技術同時對3個工業菌株的分泌蛋白質組進行了研究，發現半胱氨酸(青霉素合成的前體)合成以及磷酸戊糖途徑中的某些酶和應激響應蛋白均有增加，有毒物質等其它次級代謝產物(如異黃酮類、色素)合成明顯降低。通過對NRRL 1951菌株蛋白質組研究，發現了一些可以利用纖維素、山梨醇和其它碳源的酶存在，在AS-P-78菌株卻并不存在這些酶。
由于產黃青霉分泌的蛋白質樣品的分離相對方便，因此產黃青霉等真菌分泌蛋白質組學受到了廣泛關注。但其代謝過程相對復雜，分泌蛋白質組易受外界條件的影響[29]，也就使其研究受到了限制。
5 產黃青霉亞蛋白質組學
亞蛋白質組學主要是對一些細胞器蛋白質組學進行的研究。例如，微體與青霉素的合成密切相關，所以它就成為了產黃青霉亞蛋白質組學研究的熱點。微體是產黃青霉合成青霉素的必需細胞器，為了更好地理解微體在青霉素生產中的作用，Kiel等[30]對產黃青霉蛋白質組進行了分析研究，鑒定到200個微體定位信號蛋白PTSs。通過對產黃青霉微體蛋白質組學分析，確定了89種微體蛋白質，其中79個都有PTS，包括兩個已知的青霉素生物合成酶-異青霉素N酰基輔酶A轉移酶和苯乙酰基輔酶A連接酶。其中，一個特殊的微體蛋白——色素b5融合蛋白，被鑒定為一種新的延胡索酸還原酶，在它兩個功能域之間含有一個內部PTS2。
建立產黃青霉亞細胞蛋白質組的研究方法，能夠鑒定多種功能性蛋白，理解其代謝過程。其研究優勢在于降低了蛋白樣品的復雜性，減少了冗余信息對分析的干擾，更易獲得低豐度蛋白質。
總之，產黃青霉蛋白質組的研究表明，蛋白質組學研究可得到許多與青霉素合成相關的蛋白信息，對理解生產青霉素的分子機制有很大的幫助。這些信息不僅有利于提高產黃青霉生產青霉素，而且對其它許多絲狀真菌具有生物活性的次級代謝產物的合成具有指導意義。
6 結語
隨著蛋白質組學的快速發展，科學家進一步理解了菌株改良的分子基礎和調控機制。此外，系統生物學的日趨成熟及合成生物學的迅速發展，使得與β-內酰胺類抗生素生物合成相關的亞細胞結構、合成基因、轉運機制和相關酶系等知識進一步明確。蛋白質組學研究表明，通過菌株改良，產黃青霉的初級和次級代謝發生了修飾和變化(如PAA代謝、微體的合成、應激蛋白的修飾、前體氨基酸的合成等)，一些細胞過程發生調整，從而使得目前的產黃青霉工業菌株具有卓越的青霉素生產能力。這些研究結果不僅有助于繼續研究產黃青霉蛋白質組學和青霉素生產之間的關系，還可以據此探索更多類似的有益代謝產物的合成機制，實現工業化生產。
0 引言
青霉素是β-內酰胺類抗生素中的一類，因抗菌活性強、低毒、便宜等因素而被廣泛應用。隨著科技的發展，抗生素加快了更新換代的趨勢，但青霉素仍被廣泛用于革蘭陽性細菌感染的臨床治療，效果顯著。與此同時，很多新出現的疾病也對青霉素產量提出了更高的要求，高通量研究勢在必行。21世紀后，生物工程進入了“組學”研究時代，如基因組學、蛋白質組學等。蛋白質組學是在整體水平研究蛋白質的動態變化，能更好地幫助人們了解蛋白質間的相互作用與細胞的活動規律、功能及調控相應功能的機制等。對產黃青霉的蛋白質組學研究，將會成為研究青霉素生產的新方向，這不僅有利于研究產黃青霉的蛋白表達和青霉素生產之間的協同關系，而且可以進一步探索以這種通用型真菌作為生產其他化合物的細胞工廠的新途徑，以期合成更多對人類有益的生物代謝產物。
1 青霉素和產黃青霉菌
青霉素可與細胞壁粘肽結構競爭轉肽酶活性中心，干擾細菌細胞壁的合成，從而達到抑制細菌生長的目的[1]。1928年Fleming首次發現該種抗生素，之后將其命名為青霉素[2]。產黃青霉是工業上典型的青霉素生產菌，1943年首次分離出產黃青霉NRRL 1951，青霉素產量150 mg/L，由此產黃青霉成為生產青霉素的主要菌種[3]。NRRL 1951經多代誘變，得到了青霉素產量日益增高、性狀越來越優良的產黃青霉菌株，如X-1612、Wis Q-176、Wis BL3-D10、Wis 48-701、Wis 49-133、Wis 54-1255、DS04825、AS-P-78等[4]，如圖 1所示。產黃青霉合成青霉素的途徑也得到闡釋[5]，首先是L-半胱氨酸、L-纈氨酸和L-α-氨基己二酸經三肽合成酶(L-α-aminoadipate, L-cysteine and L-valine tripeptide synthetase, ACVS)催化形成L-α-氨基己二酸-L-半胱氨酸-D-纈氨酸三肽(L-α-aminoadipate, L-cysteine and L-valine tripeptide, ACV)，ACV經異青霉素N合成酶(isopenicillin N synthetase, IPNS)催化環化形成青霉素母核的雙環結構，生成異青霉素N(isopenicillin N, IPN)，異青霉素N酰基轉移酶(isopenicillin N acyltransferase, IAT)催化疏水性酰基取代IPN中的親水性L-α-AAA側鏈，前體不同則合成青霉素不同，不添加前體時產黃青霉可將苯丙氨酸轉化為苯乙酸(phenylacetic acid, PAA)來合成青霉素G[6]。其中，ACVS、IPNS、IAT[7]分別存在于液泡的膜表面或高爾基體上、細胞質基質中和微體中，前體物質需通過細胞器之間的轉運來完成青霉素的合成[8]。
圖1
產黃青霉工業菌株改良進程圖
Figure1.
Industrial progressive improvement of Penicillium chrysogenum strain
2 產黃青霉等絲狀真菌蛋白質組學研究策略及技術
產黃青霉合成青霉素是其他許多微生物活性代謝產物合成的模型，其過程涉及諸多復雜的生命活動。產黃青霉基因組的建立，使我們知道了青霉素過表達的分子過程，但是僅靠基因序列研究其功能和生命現象是很不精確的。產黃青霉蛋白質組復雜多樣、不斷變化，不同細胞個體中所含蛋白的數量和種類不盡相同，即使是同一細胞，不同環境或不同時期，蛋白質表達也隨時變化[9]。因此，要想對合成過程有全面深入的認識，闡明青霉素在生理或病理條件下合成機制的變化，就必須在整體、網絡、動態的水平上對產黃青霉蛋白質的結構和功能進行研究，即進行產黃青霉蛋白質組學的研究。
產黃青霉蛋白質組學研究主要集中在三方面，即表達蛋白質組學、比較蛋白質組學和免疫蛋白質組學。研究步驟包括蛋白樣品的提取、目的蛋白的分離、蛋白的鑒定和鑒定結果的分析[10]。其中，樣品的預處理對產黃青霉蛋白質組分析是非常關鍵的步驟。產黃青霉作為絲狀真菌具有自身的特殊性，其樣品的預處理和其他絲狀真菌類似，都比較復雜：①與細菌不同，其細胞壁結構堅固緊致，破壁處理相對困難；②提取到的蛋白質需全部溶解在適宜的緩沖液中，以便接下來進行二維凝膠電泳(two dimensional gel electrophoresis, 2DE)分離和質譜分析；③可能會產生分泌蛋白酶，導致蛋白降解。近年，蛋白質分離與鑒定技術如雙向熒光差異電泳[11]、同位素標記技術[12]、蛋白質芯片技術[13]、質譜技術[14]、定量異位標簽技術(isobaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)[15]等相繼建立，產黃青霉蛋白質組學研究也逐步實現了高通量。目前，研究蛋白質組的策略主要是液質聯用，通過二維液相色譜(two-dimensional liquid chromatography, 2D-LC)將酶解得到肽段分離，再結合串聯質譜(mass spectrometry/mass spectrometry, MS/MS)進行鑒定，最后對相關數據整合分析[16]。
蛋白提取方法在很大程度上影響著蛋白質的得率。胡彬彬等[17]采用了五種方法對釀酒酵母、尖孢鐮刀菌、綠色木霉、產黃青霉、黑曲霉五種真菌總蛋白進行了提取，并用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylanide gelelectmphoresis, SDS-PAGE)分析了條帶豐度。基于此結果對提取方法進行了改進，菌體經液氮研磨破壁處理時，將提取液Ⅰ中的尿素和硫脲提高到8 mol/L和2.5 mol/L，用1×蛋白酶抑制劑混合物替代苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF)，提取液Ⅱ中增加0.5% SDS，二硫蘇糖醇(DL-dithiothreitol, DTT)濃度提高到4%，提取液加入量分別為750μL/100 mg、250μL/100 mg，同時將提取時間增加為60 min和30 min。結果顯示，改進的方法所提取的總蛋白質濃度達到了2.99 mg/mL，比原來的方法相比提高了75%。取相同提取體積的樣品進行SDS-PAGE分析，結果表明改進后的方法在提取效果上有明顯提高，蛋白質得率提高，不僅低豐度的條帶更加明顯，而且高豐度條帶的蛋白點也得到了保持。
利用2DE法分離絲狀真菌的蛋白質，比分離細菌蛋白質相對復雜，處理方法和分離動植物細胞蛋白質類似，一般需用三氯乙酸或甲醇沉淀法進行純化處理[18-19]，這些預處理步驟可以去除干擾二維電泳的雜質，如多糖、脂類、色素等。劉紅等[20]以三氯乙酸-丙酮沉淀蛋白法來制備頂頭孢霉蛋白質組。液氮研磨破壁后，加入預冷的10％三氯乙酸-丙酮溶液混勻，-20℃過夜以沉淀蛋白，離心棄上清后再加入預冷的丙酮溶液洗滌，加入400μL雙向電泳樣品裂解液浸提2 h，得到胞內蛋白質。結果顯示，此方法可減少干擾物的存在，顯著提高蛋白樣品的純度和質量。
研究菌體代謝的分析實驗中，常采用在培養基中添加同位素標記的方法，在產黃青霉等絲狀真菌的蛋白質組學研究中也常用到這種方法，iTRAQ技術就是根據此原理衍生出來的，并在植物(如葡萄)、真菌(如產黃青霉、鏈霉菌)的蛋白質組研究上有一定應用[21]。崔少飛[22]利用2D-LC及MS進行了蛋白鑒定，分析了利迪鏈霉菌添加氨基酸后使利迪鏈菌素增產的同時，對胞內蛋白組帶來的擾動，標記策略為對照組用iTRAQ試劑114標記，添加谷氨酸實驗組用iTRAQ試劑115標記，添加脯氨酸實驗組用iTRAQ試劑116進行標記，結果顯示，該方法能夠很好地得到該菌蛋白的定量信息，一共得到利迪鏈霉菌發酵12 h時98個帶有定量信息的蛋白。
3 產黃青霉胞內蛋白質組學
產黃青霉的蛋白質組分析起始于其細胞內蛋白質組。隨著上述相關技術的發展成熟，建立產黃青霉胞內蛋白質組譜圖就不僅僅是依賴二維凝膠電泳和液質聯用技術了。為了更方便地利用蛋白質組學信息對相關基因進行研究，以及對產黃青霉野生菌及工業改良過程中的變種進行分析，研究者采用了更多新興的高通量技術來得到產黃青霉細胞內蛋白質組信息。Jami等[23]深入研究了產黃青霉在工業菌種改良過程中所得到的3株不同的菌株NRRL 1951、Wis 54-1255、AS-P-78的胞內蛋白質組。將2DE、肽質量指紋圖譜(peptide mass fingerprinting, PMF)和二維液相質譜(two-dimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 2D-LC-MS/MS)等技術用于蛋白質鑒別，鑒定到約1 000個蛋白點，利用基質輔助激光解吸飛行時間質譜(matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)和MS/MS鑒別出950個蛋白質(包括549個不同類型蛋白質)。比較三種菌株的胞內蛋白質組，說明該菌種在工業菌種改良過程發生了全局性代謝重排。
產黃青霉的胞內蛋白質組分析集中于代謝調控、轉運、應激、翻譯等過程。Barreiro等[24]研究了產黃青霉菌株改良過程中蛋白質組的變化，結果顯示，在高生產菌株(AS-P-78)中，與色素、有毒物質等合成相關的蛋白質明顯減少，如葡萄糖氧化酶，它是與產黃青霉導致蘋果病變相關的蛋白；又如一種感染蛋白Cap20，它是與產黃青霉菌感染鱷梨和番茄相關的蛋白。出人意料的是，雖然AS-P-78中與青霉素合成相關的基因拷貝增加了5～6倍，但直接與青霉素合成相關的蛋白并沒有顯著增高。此外，García-Estrada等[25]研究了產黃青霉Wis 54-1255在青霉素生產過程中，經1, 3-二氨基丙烷(1, 3-diaminopropane, 1, 3-DAP)或亞精胺誘導后蛋白組發生的變化。結果顯示兩種誘導劑產生了大致相同的蛋白質組變化，這表明它們可以通過相同的機制發生作用。兩種誘導劑的添加導致青霉素合成途徑中IAT的大量增加，且亞精胺作為誘導劑時，培養物中檢測到了新修飾型的IAT蛋白。加入這兩種誘導劑后，與PAA降解相關兩種酶均減少了，這樣也就增加了PAA的利用率，促進了青霉素G的合成。通常，誘導劑的添加能夠通過改變青霉素合成途徑中的相關酶系從而影響青霉素的生物合成[26]。
空氣中真菌孢子濃度過高可引起過敏反應、呼吸性疾病等。產黃青霉孢子中含有許多與應激響應及免疫應答相關的蛋白質組學信息，使其得到研究人員的關注。Goodman等[27]對產黃青霉孢子的蛋白質組學進行了分析，說明孢子的蛋白質組成與其應激響應以及免疫應答有很大關系。通過用蛋白免疫印跡法(western blotting)將孢子蛋白與患者血清樣品進行免疫反應檢測。結果顯示：反應呈陽性的蛋白質組中60%被發現有甘油醛-3-磷酸脫氫酶。共鑒定分析出了18種與血清樣品免疫反應呈陽性的蛋白，其中有些蛋白的生物學功能尚不明確，推測其可能與孢子的侵襲性生長和傳播有關。
4 產黃青霉分泌蛋白質組學
產黃青霉為腐生菌，會分泌多種胞外酶來分解底物，攝取多種營養物質。這些分泌蛋白的許多酶學特性都與工業合成息息相關，因此研究產黃青霉分泌蛋白質組學對工業生產具有重要意義。
Jami等[28]先研究了產黃青霉Wis 54-1255的胞外蛋白質組，鑒定到131種不同的蛋白質，其中102個蛋白含有分泌信號肽序列。這些蛋白多是與植物細胞壁降解(多聚半乳糖酶、果膠酸裂解酶等)、營養物質的利用(細胞外酸性磷酸酶)和應激反應(過氧化氫酶R)相關的蛋白。又通過3株產黃青霉菌NRRL1951、Wis 54-1255、AS-P-78在培養68 h分泌蛋白質組的比較，發現隨著菌株的逐步改良，與使植物發病、侵襲組織及感染性相關的酶逐漸減少，應激反應蛋白增多，果膠分解酶的量也逐漸增多，如聚半乳糖醛酸酶。
近年來iTRAQ技術逐漸被應用在產黃青霉等真菌的分泌蛋白組分析中。Jami等[23]利用此技術同時對3個工業菌株的分泌蛋白質組進行了研究，發現半胱氨酸(青霉素合成的前體)合成以及磷酸戊糖途徑中的某些酶和應激響應蛋白均有增加，有毒物質等其它次級代謝產物(如異黃酮類、色素)合成明顯降低。通過對NRRL 1951菌株蛋白質組研究，發現了一些可以利用纖維素、山梨醇和其它碳源的酶存在，在AS-P-78菌株卻并不存在這些酶。
由于產黃青霉分泌的蛋白質樣品的分離相對方便，因此產黃青霉等真菌分泌蛋白質組學受到了廣泛關注。但其代謝過程相對復雜，分泌蛋白質組易受外界條件的影響[29]，也就使其研究受到了限制。
5 產黃青霉亞蛋白質組學
亞蛋白質組學主要是對一些細胞器蛋白質組學進行的研究。例如，微體與青霉素的合成密切相關，所以它就成為了產黃青霉亞蛋白質組學研究的熱點。微體是產黃青霉合成青霉素的必需細胞器，為了更好地理解微體在青霉素生產中的作用，Kiel等[30]對產黃青霉蛋白質組進行了分析研究，鑒定到200個微體定位信號蛋白PTSs。通過對產黃青霉微體蛋白質組學分析，確定了89種微體蛋白質，其中79個都有PTS，包括兩個已知的青霉素生物合成酶-異青霉素N酰基輔酶A轉移酶和苯乙酰基輔酶A連接酶。其中，一個特殊的微體蛋白——色素b5融合蛋白，被鑒定為一種新的延胡索酸還原酶，在它兩個功能域之間含有一個內部PTS2。
建立產黃青霉亞細胞蛋白質組的研究方法，能夠鑒定多種功能性蛋白，理解其代謝過程。其研究優勢在于降低了蛋白樣品的復雜性，減少了冗余信息對分析的干擾，更易獲得低豐度蛋白質。
總之，產黃青霉蛋白質組的研究表明，蛋白質組學研究可得到許多與青霉素合成相關的蛋白信息，對理解生產青霉素的分子機制有很大的幫助。這些信息不僅有利于提高產黃青霉生產青霉素，而且對其它許多絲狀真菌具有生物活性的次級代謝產物的合成具有指導意義。
6 結語
隨著蛋白質組學的快速發展，科學家進一步理解了菌株改良的分子基礎和調控機制。此外，系統生物學的日趨成熟及合成生物學的迅速發展，使得與β-內酰胺類抗生素生物合成相關的亞細胞結構、合成基因、轉運機制和相關酶系等知識進一步明確。蛋白質組學研究表明，通過菌株改良，產黃青霉的初級和次級代謝發生了修飾和變化(如PAA代謝、微體的合成、應激蛋白的修飾、前體氨基酸的合成等)，一些細胞過程發生調整，從而使得目前的產黃青霉工業菌株具有卓越的青霉素生產能力。這些研究結果不僅有助于繼續研究產黃青霉蛋白質組學和青霉素生產之間的關系，還可以據此探索更多類似的有益代謝產物的合成機制，實現工業化生產。
