自體熒光檢測技術是目前新興的癌癥診斷技術, 它與傳統白光內窺鏡相比, 在癌前病變和早期癌癥的診斷上有很大的優勢。本文總結了國內外關于自體熒光檢測技術的研究現狀和進展, 重點闡述了生物組織的內源性熒光分子、正常和異常生物組織熒光信號差異的來源、熒光激發光光源和波長的選擇, 以及熒光圖像和光譜信號的處理方法。最后, 本文分析并討論了自體熒光成像與光譜技術在癌前病變和早期癌癥診斷中的不足和發展方向。
引用本文： 劉剛, 顏國正. 自體熒光診斷技術的研究進展及發展方向. 生物醫學工程學雜志, 2015, 32(6): 1348-1353. doi: 10.7507/1001-5515.20150238 復制
0 引言
隨著經濟的增長、生活節奏的加快，癌癥已經成為人類健康的“頭號殺手”。全世界每年癌癥發病人數約為1 300萬，死亡人數約為800萬，且有逐年上升的趨勢[1]。其中，肺癌、胃癌、結直腸癌、食管癌、女性宮頸癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤，也是今后防控惡性腫瘤的重點。眾所周知，當惡性腫瘤出現臨床癥狀而被確診時，多處于進展期，已經錯失了最佳治療時機[2]，因此及時發現和治療癌前病變是有效預防惡性腫瘤發展和降低死亡率的關鍵。目前，臨床上診斷惡性腫瘤的一項主要手段是白光內鏡(white light endoscopy, WLE)，但是WLE檢查只能診斷出黏膜表面較大的病變，難以發現微小的組織病變和黏膜下的癌前病變，容易出現漏診甚至誤診。研究者們一直致力于尋找新的診斷方法以有效、正確地指導或代替手術活檢[3-5]。自體熒光內鏡(autofluorescence endoscopy, AFE)作為一種新型內鏡檢查技術，可以檢測包括口腔、上消化道、結腸、宮頸、支氣管等不同腔道甚至視網膜中WLE尚無法診斷的特殊微小結構的變化[6-7]，這促進了早期癌癥診斷技術的微觀化進程。在分子水平上，AFE以安全、無創、實時和靈敏度高等特點受到臨床醫生和研究者們越來越多的關注[8-9]。
生物組織的細胞和基質中含有許多分子，如氨基酸、卟啉、結構蛋白等，它們在一定波長的激發光照射下，能夠產生與其吸收光譜相對應的自體熒光輻射信號。這種熒光現象不依賴于任何外源性物質，在體內固有存在，故被稱為“自體熒光”。在激發光的照射下，生物組織中各種不同的內源性熒光分子可產生自體熒光輻射。這些自體熒光通過換能器的采集和處理，會顯示出特有的熒光圖像或光譜。組織的生物化學特性和形態結構以及組織的吸收和散射均會影響熒光圖像的色彩和熒光光譜曲線。根據分子生物學研究，從正常細胞轉化為惡性細胞要經歷多個步驟。在這個過程中周邊生化環境會產生質的變化，如內源性熒光基團的濃度、黏膜厚度、微血管分布和血液濃度等。因此，我們可根據不同組織自體熒光圖像或光譜信號所表現出來的差異，區分正常組織和不同階段的異常組織[10-12]。
為了實現自體熒光診斷技術對癌前病變和早期癌癥的有效篩查，我們的研究工作主要有：①深入研究生物組織內源性熒光分子以及正常和異常生物組織自體熒光信號差異的來源；②研發自體熒光信號采集和顯示系統，以獲取正常和異常組織的自體熒光信號；③采用活檢取樣方法對可疑病灶進行病理學分析，結合自體熒光圖像和光譜，制定更精確的癌變組織診斷標準；④開發智能算法，處理和分析采集到的自體熒光圖像和光譜數據，更加快速、有效地鑒別不同類型的癌變組織。本文總結了國內外自體熒光檢測技術的研究現狀和進展，重點闡述了生物組織的內源性熒光分子、正常和異常生物組織熒光信號差異的來源、熒光激發光光源和波長的選擇，以及熒光圖像和光譜信號的處理方法。在此基礎上，分析討論自體熒光成像與光譜技術在癌前病變和早期癌癥診斷中的不足，并預測其發展方向。
1 自體熒光診斷技術原理
1.1 內源性熒光物質及其熒光特性
Policard等早在1924年就已報道，離體腫瘤組織在紫外線的照射下可以發出熒光。此后，生物學家開始研究細胞中各種分子的熒光，證實了各種分子的熒光特性與其理化性質有關[13-14]。MIT光譜實驗室的Georgakoudi等[15]認為：人體內主要的熒光物質是NADPH和膠原；人體局部組織產生異常變化會引起去氧化代謝過程，從而造成自體熒光信號強度的變化；異常組織中膠原誘發的熒光強度比正常組織強，而NADPH誘發的熒光強度則相反, 因此正常組織與異常組織的熒光特性有明顯差異。此外，Pandey等[16]通過體外實驗研究自體熒光的機制，發現氨基酸、酶和輔酶等也能激發出熒光。Thekkek等[17]在分子水平上全面概括和解釋了人體內的熒光物質。他們提出，不同分子產生不同熒光光譜的原因是其分子結構及自身共價鍵能量不同，因此表現出不同的能級。生物體內各種熒光物質及其對應的激發波長和熒光峰值如表 1所示。
表1
內源性熒光物質的熒光特性
Table1.
Characteristics of fluorescent materials
生物組織的自體熒光信號是在激發光照射下，各種不同內源性熒光分子誘發熒光信號的疊加。當采用不同波長的激發光時，起主要作用的內源性熒光物質各不相同。此外，不同生物體腔道中所包含的內源性熒光物質也不相同，這為不同腔道癌前病變診斷的激發光波長的選擇提供了指導。
2.2 正常和異常生物組織熒光信號差異的來源
自體熒光診斷技術是根據正常和異常的生物組織呈現出來的熒光信號差異實現醫學疾病診斷的。近幾年研究表明，正常與異常生物組織自體熒光信號差異的來源主要有:生物組織的黏膜厚度和層結構；生物組織中內源性熒光分子的濃度和分布。
2.2.1 黏膜厚度增加或者層結構被破壞
Cothren等[18]采用370 nm的光激發腸道組織的自體熒光，分別采集結腸正常、增生和腺瘤組織的熒光光譜。他們發現390 nm和460 nm的熒光峰在不同組織中都存在，但在460 nm處增生組織的熒光強度只有正常組織的1/3，腺瘤組織的熒光強度則更低，而且只有腺瘤組織中存在630 nm和690 nm的熒光峰。Schomacker等[19]采用337 nm的激發光，得出結論：390 nm和460 nm熒光峰分別來自膠原和NADH，FAD只產生大約5%的熒光。他們還認為，黏膜層厚度增加使異常組織黏膜下層中膠原誘發的熒光發射受阻，造成熒光強度減弱。此外，Kobayashi等采用437 nm的激發光，采集異常組織及其周圍正常組織的熒光圖像。他們認為異常組織的黏膜層結構遭到破壞，進而組織中血管增加，血紅素吸收更多綠色熒光，使得熒光圖像呈現紅色。
2.2.2 內源性熒光物質濃度的改變
劉麗娜等[8, 20]選取337、375、405、460 nm的激發光波長，分別采集離體結腸正常組織和腺瘤組織的熒光光譜，發現腺瘤組織熒光光譜出現特有的635 nm熒光峰。他們運用時間分辨光譜技術得出PpIX的濃度比正常組織高很多。Banerjee等[10]測量了純品內源性熒光物質的熒光光譜以及正常、增生和腺瘤組織的熒光光譜。他們發現自體熒光光譜的形狀沒有變化，但熒光物質的相對濃度不同導致熒光峰值強度不同，新陳代謝較快的組織細胞密集、細胞核質較多，而結締組織的密度較低(膠原變少)。由此表明，不同組織由于新陳代謝不同，造成組織中熒光物質不同，從而導致自體熒光光譜產生明顯差異。
當然，也有學者認為，正常組織和異常組織的自體熒光信號差異是組織結構改變和內源性熒光物質濃度改變二者綜合作用的結果。Su等[21]認為不同類型組織自體熒光強度的不同不僅取決于組織中DADH、FAD濃度的變化，還取決于組織黏膜厚度的變化。異常組織黏膜層厚度增加，降低了激發光和熒光的穿透率，從而降低了熒光強度。
3 自體熒光診查系統
3.1 熒光激發光光源和波長的選擇
熒光激發光光源及其波長的選擇是研制自體熒光診查系統的重要步驟。為了最大限度地誘發生物組織的自體熒光，提高自體熒光診查系統的可靠性，我們應該選擇合適的光源和最佳的激發波長。
3.1.1 激發光源的選擇
激發光源的性能關乎診斷結果的準確性，所以選擇一種合適的激發光源對自體熒光診查儀器的研制十分關鍵。選擇激發光源應綜合考慮激發光的單色性、均勻性、穩定性、功率密度，還有體積、壽命、價格等多種因素。研究者的相關實驗指出，激發光源的功率密度必須大于0.1 mJ/cm2。如果采用激光器，其單次脈沖功率應該大于5 mJ。如表 2所示，本文總結了目前國內外常用的激發光源，并對其性能做了一個調研。
表2
自體熒光激發光源及其性能
Table2.
Autofluorescence excitation light sources and performance
如表 2所示，現有的激發光源各有不足，我們仍需尋找更好的替代光源，要求其單色性能更高，穩定性能更好，光功率密度適中，成本更加低廉。當然，為了迎合未來自體熒光檢測設備的微型化趨勢，激發光源的體積和重量還應該更加小巧。
3.1.2 激發光波長的選擇
為了最大限度地激發內源性熒光物質，以有效地反映正常組織和不同階段癌變組織熒光信號的差異，選擇激發光波長應主要考慮激發光對生物組織的穿透深度、激發內源性熒光物質產生熒光的效率等因素。根據相關的實驗研究，波長大于300 nm時，光對人體的損傷相對較小，這是自體熒光激發光波長的下限。根據自體熒光激發原理，激發光的波長小于所誘發的熒光的波長。而目前能分析處理的自體熒光的波長在可見光區域內，即400~700 nm。因此，激發光波長不能大于700 nm，這是自體熒光激發光波長的上限。當前，國內外的研究人員普遍選擇的自體熒光的激發波長為325~480 nm。在此范圍內，波長越長，激發光穿透生物組織的深度越大，如波長為442 nm的激發光穿透生物組織的深度約為600μm，而337 nm的激發光穿透生物組織深度只有約200μm。另外，不同波長的激發光激發的熒光物質不同，對組織的穿透深度也不同。
自體熒光激發-發射矩陣(excitation-emission matrix, EEM)是尋找最佳自體熒光激發波長的主要途徑。劉麗娜等[20]采用260~540 nm、間隔20 nm的激發光檢測結腸組織的熒光光譜，得到結腸組織EEM矩陣，通過對比不同組織在不同激發波長下的自體熒光光譜，得出診查結腸病變的最佳激發波長為340、380、460和540 nm。Angelova等[22]利用280~440 nm的激發光分別誘發胃腸道正常組織和癌變組織的自體熒光光譜，采集兩種組織在300~800 nm波段的自體熒光，做出激發光與發射光對應的準三維EEM彩圖，并且利用EEM彩圖的差異辨別正常和癌變組織。Luo等[23]則利用(400±50) nm的激發光測量結腸正常、增生、癌變組織的自體熒光光譜，通過比較460 nm處熒光光譜的強度，得出最佳激發波長為380 nm。
此外，在實際應用中，不同腔道含有的內源性熒光物質及其濃度不同，而且不同的組織癌變階段需要不同的穿透深度。所以，針對不同腔道和不同階段的癌變診斷，需要的最佳激發波長也不同。
3.2 熒光信號的數據處理方法
正確采集和提取有效的熒光信號信息對于提高癌前病變和早期癌癥診斷的靈敏度和特異度至關重要。目前，自體熒光信號的采集和數據處理方法主要分為兩大類：熒光圖像法(表 3中1~4)和熒光光譜法(表 3中5~10)。
表3
不同波長激發光和不同算法的自體熒光診斷結果
Table3.
Diagnosis results using different excitation wavelengths and algorithms
3.2.1 熒光圖像法
熒光圖像法通過CCD圖像傳感器采集不同組織的自體熒光圖像，直接根據圖像顏色差異進行診斷。其優點是簡單、直觀，診查范圍大，可以實時診斷，并且不需要復雜的設備，這對于臨床應用十分有利。曾堃等[24]通過研究數萬例離體癌癥標本，制定了自體熒光圖像診斷的診斷標準。他們認為正常組織熒光圖像呈藍白色，良性病變熒光圖像呈橘黃色，重度不典型增生的熒光圖像呈紫紅色，中度不典型增生的熒光圖像呈暗紫色，輕度不典型增生的熒光圖像呈暗色。Takeuchi等[25]采用偽彩色圖像處理方法將復合的自體熒光圖像顯示出來，通過圖像差異區分正常組織和癌變組織，診斷的靈敏度和特異度分別達到95%和64%。
當然，熒光圖像法也存在許多缺點，例如圖像判斷的主觀性強，實時性判斷耗費醫生大量的時間；圖像質量容易受到周圍環境的影響，以致帶來診斷誤差甚至誤診。因此，熒光圖像診斷方法有待進一步改進以減少醫生的工作時間，降低診斷結果對醫生個人經驗的依賴性。更智能、更有效的圖像識別算法還有待于研究人員開發。
3.2.2 熒光光譜法
熒光光譜法是按“點”采集不同組織的自體熒光光譜，根據熒光強度差異進行診斷的方法。與熒光圖像法相比，熒光光譜法更為嚴謹，而且光譜信號的信息量很大，幾乎涵蓋了已知的各種異常信息，包括不同的病變、癌變的分化程度、基因突變等。曾堃等[24]在制定自體熒光圖像診斷標準的同時，還制定了自體熒光光譜診斷標準。他們假設正常組織的自體熒光光譜強度為100%，得出良性病變組織的自體熒光光譜在470 nm的光譜峰值大于70%，重度不典型增生的自體熒光光譜在470 nm的光譜峰值小于50%，并且有400 nm和680 nm的熒光峰，中度不典型增生的自體熒光光譜在470 nm的光譜峰值小于50%，并且有400 nm的熒光峰，輕度不典型增生的自體熒光光譜在470 nm的光譜峰值小于50%。目前，常用的自體熒光光譜采集和處理方法有：逐步回歸分析法[19]、雙峰比值法[29]、主成分分析法(principal component analysis, PCA)[8, 23]、人工神經網絡法(artificial neural network, ANN)[23]和模式識別法[8]等。
與熒光圖像法一樣，熒光光譜法也存在許多缺點，其設備成本較高、結構復雜，不能直觀地顯示病變，而且在指導組織活檢時不如熒光圖像法精確、方便。因此，熒光光譜法的推廣使用仍有一定局限。在自體熒光診查技術的實際臨床應用，有時會將熒光圖像法和熒光光譜法結合使用，使二者在診斷過程中相互補充。
4 自體熒光技術的發展方向
自體熒光診斷技術在臨床上對于癌癥疾病的及時發現和治療具有非常重要的意義。同時，它在臨床上還可以引導甚至替代組織活檢，為異常組織的病理學分析提供有利條件。但是，在現有階段，自體熒光技術還存在著有多不足之處，它在臨床上的廣泛應用還需要研究者們付出更多的努力。
4.1 深入研究自體熒光診斷機制
隨著研究的深入，我們知道生物組織不同的熒光物質與自體熒光光譜峰值的對應關系，并利用自體熒光信號的差異區分正常組織和癌變組織。但是，如何根據這種差異診斷不同分化程度的癌變還沒有統一的標準。另外，不同腔道的生物組織，還有激發光的波長及入射角度等參數對自體熒光信號的測量結果都有很大影響。因此，針對不同腔道和不同階段的癌前病變，選擇合適的參數和制定精確的診斷標準具有十分重要的意義。這也是未來自體熒光技術發展的一個新趨勢。
4.2 優化自體熒光檢測系統
現有的自體熒光檢測設備分辨率低、體積重大、價格昂貴，很難在普通醫院推廣應用。而且激發光源要通過有線光纖深入診斷部位，這只適用于各種短腔道和上消化道的診斷，難以實現全消化道的檢查，容易造成漏檢。因此，選擇分辨率更高的熒光信號采集設備，選用性能更好的激發光源，同時減小設備的體積，實現更加全面的檢查是自體熒光診斷技術發展的一個新趨勢。
4.3 與外源性熒光技術結合
自體熒光檢測技術在診斷平坦型腫瘤時的靈敏度和特異度不高，對于腫瘤邊界定位的準確度也較低。隨著高分辨率成像技術和熒光探針的發展，熒光標記分子成像技術在臨床上越來越受到關注。將熒光標記的外源性探針靶向到癌變組織的過表達生物分子，利用熒光成像系統觀察組織病變的生物過程，可以提高平坦型腫瘤診斷的靈敏度和腫瘤邊界定位的精度。Zhang等[30]采用玫瑰紅作為標記，檢測活體動物的癌前病變，使用比值法判別不同程度的癌變組織，取得了積極的效果。因此，將自體熒光檢測技術與外源熒光分子標記法結合起來，對于癌前病變和早期癌癥的診斷具有非常重要的意義。
4.4 開發更精確和智能的診斷算法
在診斷過程中，自體熒光圖像的顏色辨別主要依賴醫生的個人經驗，造成自體熒光技術對癌前病變和早期癌癥的診斷特異度較低(＜67%)，這制約著自體熒光技術在臨床上的推廣應用。針對這一難題，開發更智能的圖像處理算法以增強熒光圖像的對比度是提高早期癌癥診斷靈敏度和特異度的重要方向。而前文提到，熒光光譜信號的信息量很大，幾乎涵蓋了已知的各種異常信息，具有較高的診斷特異性。因此，將熒光光譜算法和圖像處理算法相結合是提高診斷靈敏度和特異度的另一種發展趨勢。
5 結論
自體熒光技術作為診斷癌前病變和早期癌癥的新興技術，對于真正實現癌癥的及時發現與治療具有重要意義。本文總結了國內外關于自體熒光檢測技術的研究現狀和進展，對自體熒光技術的檢測原理和診斷系統組成作了詳細地概括和分析。最后指出自體熒光成像和光譜技術在癌前病變和早期癌癥診斷中的不足和發展方向。希望能為未來自體熒光診斷技術的研究和進一步改進提供有價值的參考。
0 引言
隨著經濟的增長、生活節奏的加快，癌癥已經成為人類健康的“頭號殺手”。全世界每年癌癥發病人數約為1 300萬，死亡人數約為800萬，且有逐年上升的趨勢[1]。其中，肺癌、胃癌、結直腸癌、食管癌、女性宮頸癌是威脅人類健康的主要惡性腫瘤，也是今后防控惡性腫瘤的重點。眾所周知，當惡性腫瘤出現臨床癥狀而被確診時，多處于進展期，已經錯失了最佳治療時機[2]，因此及時發現和治療癌前病變是有效預防惡性腫瘤發展和降低死亡率的關鍵。目前，臨床上診斷惡性腫瘤的一項主要手段是白光內鏡(white light endoscopy, WLE)，但是WLE檢查只能診斷出黏膜表面較大的病變，難以發現微小的組織病變和黏膜下的癌前病變，容易出現漏診甚至誤診。研究者們一直致力于尋找新的診斷方法以有效、正確地指導或代替手術活檢[3-5]。自體熒光內鏡(autofluorescence endoscopy, AFE)作為一種新型內鏡檢查技術，可以檢測包括口腔、上消化道、結腸、宮頸、支氣管等不同腔道甚至視網膜中WLE尚無法診斷的特殊微小結構的變化[6-7]，這促進了早期癌癥診斷技術的微觀化進程。在分子水平上，AFE以安全、無創、實時和靈敏度高等特點受到臨床醫生和研究者們越來越多的關注[8-9]。
生物組織的細胞和基質中含有許多分子，如氨基酸、卟啉、結構蛋白等，它們在一定波長的激發光照射下，能夠產生與其吸收光譜相對應的自體熒光輻射信號。這種熒光現象不依賴于任何外源性物質，在體內固有存在，故被稱為“自體熒光”。在激發光的照射下，生物組織中各種不同的內源性熒光分子可產生自體熒光輻射。這些自體熒光通過換能器的采集和處理，會顯示出特有的熒光圖像或光譜。組織的生物化學特性和形態結構以及組織的吸收和散射均會影響熒光圖像的色彩和熒光光譜曲線。根據分子生物學研究，從正常細胞轉化為惡性細胞要經歷多個步驟。在這個過程中周邊生化環境會產生質的變化，如內源性熒光基團的濃度、黏膜厚度、微血管分布和血液濃度等。因此，我們可根據不同組織自體熒光圖像或光譜信號所表現出來的差異，區分正常組織和不同階段的異常組織[10-12]。
為了實現自體熒光診斷技術對癌前病變和早期癌癥的有效篩查，我們的研究工作主要有：①深入研究生物組織內源性熒光分子以及正常和異常生物組織自體熒光信號差異的來源；②研發自體熒光信號采集和顯示系統，以獲取正常和異常組織的自體熒光信號；③采用活檢取樣方法對可疑病灶進行病理學分析，結合自體熒光圖像和光譜，制定更精確的癌變組織診斷標準；④開發智能算法，處理和分析采集到的自體熒光圖像和光譜數據，更加快速、有效地鑒別不同類型的癌變組織。本文總結了國內外自體熒光檢測技術的研究現狀和進展，重點闡述了生物組織的內源性熒光分子、正常和異常生物組織熒光信號差異的來源、熒光激發光光源和波長的選擇，以及熒光圖像和光譜信號的處理方法。在此基礎上，分析討論自體熒光成像與光譜技術在癌前病變和早期癌癥診斷中的不足，并預測其發展方向。
1 自體熒光診斷技術原理
1.1 內源性熒光物質及其熒光特性
Policard等早在1924年就已報道，離體腫瘤組織在紫外線的照射下可以發出熒光。此后，生物學家開始研究細胞中各種分子的熒光，證實了各種分子的熒光特性與其理化性質有關[13-14]。MIT光譜實驗室的Georgakoudi等[15]認為：人體內主要的熒光物質是NADPH和膠原；人體局部組織產生異常變化會引起去氧化代謝過程，從而造成自體熒光信號強度的變化；異常組織中膠原誘發的熒光強度比正常組織強，而NADPH誘發的熒光強度則相反, 因此正常組織與異常組織的熒光特性有明顯差異。此外，Pandey等[16]通過體外實驗研究自體熒光的機制，發現氨基酸、酶和輔酶等也能激發出熒光。Thekkek等[17]在分子水平上全面概括和解釋了人體內的熒光物質。他們提出，不同分子產生不同熒光光譜的原因是其分子結構及自身共價鍵能量不同，因此表現出不同的能級。生物體內各種熒光物質及其對應的激發波長和熒光峰值如表 1所示。
表1
內源性熒光物質的熒光特性
Table1.
Characteristics of fluorescent materials
生物組織的自體熒光信號是在激發光照射下，各種不同內源性熒光分子誘發熒光信號的疊加。當采用不同波長的激發光時，起主要作用的內源性熒光物質各不相同。此外，不同生物體腔道中所包含的內源性熒光物質也不相同，這為不同腔道癌前病變診斷的激發光波長的選擇提供了指導。
2.2 正常和異常生物組織熒光信號差異的來源
自體熒光診斷技術是根據正常和異常的生物組織呈現出來的熒光信號差異實現醫學疾病診斷的。近幾年研究表明，正常與異常生物組織自體熒光信號差異的來源主要有:生物組織的黏膜厚度和層結構；生物組織中內源性熒光分子的濃度和分布。
2.2.1 黏膜厚度增加或者層結構被破壞
Cothren等[18]采用370 nm的光激發腸道組織的自體熒光，分別采集結腸正常、增生和腺瘤組織的熒光光譜。他們發現390 nm和460 nm的熒光峰在不同組織中都存在，但在460 nm處增生組織的熒光強度只有正常組織的1/3，腺瘤組織的熒光強度則更低，而且只有腺瘤組織中存在630 nm和690 nm的熒光峰。Schomacker等[19]采用337 nm的激發光，得出結論：390 nm和460 nm熒光峰分別來自膠原和NADH，FAD只產生大約5%的熒光。他們還認為，黏膜層厚度增加使異常組織黏膜下層中膠原誘發的熒光發射受阻，造成熒光強度減弱。此外，Kobayashi等采用437 nm的激發光，采集異常組織及其周圍正常組織的熒光圖像。他們認為異常組織的黏膜層結構遭到破壞，進而組織中血管增加，血紅素吸收更多綠色熒光，使得熒光圖像呈現紅色。
2.2.2 內源性熒光物質濃度的改變
劉麗娜等[8, 20]選取337、375、405、460 nm的激發光波長，分別采集離體結腸正常組織和腺瘤組織的熒光光譜，發現腺瘤組織熒光光譜出現特有的635 nm熒光峰。他們運用時間分辨光譜技術得出PpIX的濃度比正常組織高很多。Banerjee等[10]測量了純品內源性熒光物質的熒光光譜以及正常、增生和腺瘤組織的熒光光譜。他們發現自體熒光光譜的形狀沒有變化，但熒光物質的相對濃度不同導致熒光峰值強度不同，新陳代謝較快的組織細胞密集、細胞核質較多，而結締組織的密度較低(膠原變少)。由此表明，不同組織由于新陳代謝不同，造成組織中熒光物質不同，從而導致自體熒光光譜產生明顯差異。
當然，也有學者認為，正常組織和異常組織的自體熒光信號差異是組織結構改變和內源性熒光物質濃度改變二者綜合作用的結果。Su等[21]認為不同類型組織自體熒光強度的不同不僅取決于組織中DADH、FAD濃度的變化，還取決于組織黏膜厚度的變化。異常組織黏膜層厚度增加，降低了激發光和熒光的穿透率，從而降低了熒光強度。
3 自體熒光診查系統
3.1 熒光激發光光源和波長的選擇
熒光激發光光源及其波長的選擇是研制自體熒光診查系統的重要步驟。為了最大限度地誘發生物組織的自體熒光，提高自體熒光診查系統的可靠性，我們應該選擇合適的光源和最佳的激發波長。
3.1.1 激發光源的選擇
激發光源的性能關乎診斷結果的準確性，所以選擇一種合適的激發光源對自體熒光診查儀器的研制十分關鍵。選擇激發光源應綜合考慮激發光的單色性、均勻性、穩定性、功率密度，還有體積、壽命、價格等多種因素。研究者的相關實驗指出，激發光源的功率密度必須大于0.1 mJ/cm2。如果采用激光器，其單次脈沖功率應該大于5 mJ。如表 2所示，本文總結了目前國內外常用的激發光源，并對其性能做了一個調研。
表2
自體熒光激發光源及其性能
Table2.
Autofluorescence excitation light sources and performance
如表 2所示，現有的激發光源各有不足，我們仍需尋找更好的替代光源，要求其單色性能更高，穩定性能更好，光功率密度適中，成本更加低廉。當然，為了迎合未來自體熒光檢測設備的微型化趨勢，激發光源的體積和重量還應該更加小巧。
3.1.2 激發光波長的選擇
為了最大限度地激發內源性熒光物質，以有效地反映正常組織和不同階段癌變組織熒光信號的差異，選擇激發光波長應主要考慮激發光對生物組織的穿透深度、激發內源性熒光物質產生熒光的效率等因素。根據相關的實驗研究，波長大于300 nm時，光對人體的損傷相對較小，這是自體熒光激發光波長的下限。根據自體熒光激發原理，激發光的波長小于所誘發的熒光的波長。而目前能分析處理的自體熒光的波長在可見光區域內，即400~700 nm。因此，激發光波長不能大于700 nm，這是自體熒光激發光波長的上限。當前，國內外的研究人員普遍選擇的自體熒光的激發波長為325~480 nm。在此范圍內，波長越長，激發光穿透生物組織的深度越大，如波長為442 nm的激發光穿透生物組織的深度約為600μm，而337 nm的激發光穿透生物組織深度只有約200μm。另外，不同波長的激發光激發的熒光物質不同，對組織的穿透深度也不同。
自體熒光激發-發射矩陣(excitation-emission matrix, EEM)是尋找最佳自體熒光激發波長的主要途徑。劉麗娜等[20]采用260~540 nm、間隔20 nm的激發光檢測結腸組織的熒光光譜，得到結腸組織EEM矩陣，通過對比不同組織在不同激發波長下的自體熒光光譜，得出診查結腸病變的最佳激發波長為340、380、460和540 nm。Angelova等[22]利用280~440 nm的激發光分別誘發胃腸道正常組織和癌變組織的自體熒光光譜，采集兩種組織在300~800 nm波段的自體熒光，做出激發光與發射光對應的準三維EEM彩圖，并且利用EEM彩圖的差異辨別正常和癌變組織。Luo等[23]則利用(400±50) nm的激發光測量結腸正常、增生、癌變組織的自體熒光光譜，通過比較460 nm處熒光光譜的強度，得出最佳激發波長為380 nm。
此外，在實際應用中，不同腔道含有的內源性熒光物質及其濃度不同，而且不同的組織癌變階段需要不同的穿透深度。所以，針對不同腔道和不同階段的癌變診斷，需要的最佳激發波長也不同。
3.2 熒光信號的數據處理方法
正確采集和提取有效的熒光信號信息對于提高癌前病變和早期癌癥診斷的靈敏度和特異度至關重要。目前，自體熒光信號的采集和數據處理方法主要分為兩大類：熒光圖像法(表 3中1~4)和熒光光譜法(表 3中5~10)。
表3
不同波長激發光和不同算法的自體熒光診斷結果
Table3.
Diagnosis results using different excitation wavelengths and algorithms
3.2.1 熒光圖像法
熒光圖像法通過CCD圖像傳感器采集不同組織的自體熒光圖像，直接根據圖像顏色差異進行診斷。其優點是簡單、直觀，診查范圍大，可以實時診斷，并且不需要復雜的設備，這對于臨床應用十分有利。曾堃等[24]通過研究數萬例離體癌癥標本，制定了自體熒光圖像診斷的診斷標準。他們認為正常組織熒光圖像呈藍白色，良性病變熒光圖像呈橘黃色，重度不典型增生的熒光圖像呈紫紅色，中度不典型增生的熒光圖像呈暗紫色，輕度不典型增生的熒光圖像呈暗色。Takeuchi等[25]采用偽彩色圖像處理方法將復合的自體熒光圖像顯示出來，通過圖像差異區分正常組織和癌變組織，診斷的靈敏度和特異度分別達到95%和64%。
當然，熒光圖像法也存在許多缺點，例如圖像判斷的主觀性強，實時性判斷耗費醫生大量的時間；圖像質量容易受到周圍環境的影響，以致帶來診斷誤差甚至誤診。因此，熒光圖像診斷方法有待進一步改進以減少醫生的工作時間，降低診斷結果對醫生個人經驗的依賴性。更智能、更有效的圖像識別算法還有待于研究人員開發。
3.2.2 熒光光譜法
熒光光譜法是按“點”采集不同組織的自體熒光光譜，根據熒光強度差異進行診斷的方法。與熒光圖像法相比，熒光光譜法更為嚴謹，而且光譜信號的信息量很大，幾乎涵蓋了已知的各種異常信息，包括不同的病變、癌變的分化程度、基因突變等。曾堃等[24]在制定自體熒光圖像診斷標準的同時，還制定了自體熒光光譜診斷標準。他們假設正常組織的自體熒光光譜強度為100%，得出良性病變組織的自體熒光光譜在470 nm的光譜峰值大于70%，重度不典型增生的自體熒光光譜在470 nm的光譜峰值小于50%，并且有400 nm和680 nm的熒光峰，中度不典型增生的自體熒光光譜在470 nm的光譜峰值小于50%，并且有400 nm的熒光峰，輕度不典型增生的自體熒光光譜在470 nm的光譜峰值小于50%。目前，常用的自體熒光光譜采集和處理方法有：逐步回歸分析法[19]、雙峰比值法[29]、主成分分析法(principal component analysis, PCA)[8, 23]、人工神經網絡法(artificial neural network, ANN)[23]和模式識別法[8]等。
與熒光圖像法一樣，熒光光譜法也存在許多缺點，其設備成本較高、結構復雜，不能直觀地顯示病變，而且在指導組織活檢時不如熒光圖像法精確、方便。因此，熒光光譜法的推廣使用仍有一定局限。在自體熒光診查技術的實際臨床應用，有時會將熒光圖像法和熒光光譜法結合使用，使二者在診斷過程中相互補充。
4 自體熒光技術的發展方向
自體熒光診斷技術在臨床上對于癌癥疾病的及時發現和治療具有非常重要的意義。同時，它在臨床上還可以引導甚至替代組織活檢，為異常組織的病理學分析提供有利條件。但是，在現有階段，自體熒光技術還存在著有多不足之處，它在臨床上的廣泛應用還需要研究者們付出更多的努力。
4.1 深入研究自體熒光診斷機制
隨著研究的深入，我們知道生物組織不同的熒光物質與自體熒光光譜峰值的對應關系，并利用自體熒光信號的差異區分正常組織和癌變組織。但是，如何根據這種差異診斷不同分化程度的癌變還沒有統一的標準。另外，不同腔道的生物組織，還有激發光的波長及入射角度等參數對自體熒光信號的測量結果都有很大影響。因此，針對不同腔道和不同階段的癌前病變，選擇合適的參數和制定精確的診斷標準具有十分重要的意義。這也是未來自體熒光技術發展的一個新趨勢。
4.2 優化自體熒光檢測系統
現有的自體熒光檢測設備分辨率低、體積重大、價格昂貴，很難在普通醫院推廣應用。而且激發光源要通過有線光纖深入診斷部位，這只適用于各種短腔道和上消化道的診斷，難以實現全消化道的檢查，容易造成漏檢。因此，選擇分辨率更高的熒光信號采集設備，選用性能更好的激發光源，同時減小設備的體積，實現更加全面的檢查是自體熒光診斷技術發展的一個新趨勢。
4.3 與外源性熒光技術結合
自體熒光檢測技術在診斷平坦型腫瘤時的靈敏度和特異度不高，對于腫瘤邊界定位的準確度也較低。隨著高分辨率成像技術和熒光探針的發展，熒光標記分子成像技術在臨床上越來越受到關注。將熒光標記的外源性探針靶向到癌變組織的過表達生物分子，利用熒光成像系統觀察組織病變的生物過程，可以提高平坦型腫瘤診斷的靈敏度和腫瘤邊界定位的精度。Zhang等[30]采用玫瑰紅作為標記，檢測活體動物的癌前病變，使用比值法判別不同程度的癌變組織，取得了積極的效果。因此，將自體熒光檢測技術與外源熒光分子標記法結合起來，對于癌前病變和早期癌癥的診斷具有非常重要的意義。
4.4 開發更精確和智能的診斷算法
在診斷過程中，自體熒光圖像的顏色辨別主要依賴醫生的個人經驗，造成自體熒光技術對癌前病變和早期癌癥的診斷特異度較低(＜67%)，這制約著自體熒光技術在臨床上的推廣應用。針對這一難題，開發更智能的圖像處理算法以增強熒光圖像的對比度是提高早期癌癥診斷靈敏度和特異度的重要方向。而前文提到，熒光光譜信號的信息量很大，幾乎涵蓋了已知的各種異常信息，具有較高的診斷特異性。因此，將熒光光譜算法和圖像處理算法相結合是提高診斷靈敏度和特異度的另一種發展趨勢。
5 結論
自體熒光技術作為診斷癌前病變和早期癌癥的新興技術，對于真正實現癌癥的及時發現與治療具有重要意義。本文總結了國內外關于自體熒光檢測技術的研究現狀和進展，對自體熒光技術的檢測原理和診斷系統組成作了詳細地概括和分析。最后指出自體熒光成像和光譜技術在癌前病變和早期癌癥診斷中的不足和發展方向。希望能為未來自體熒光診斷技術的研究和進一步改進提供有價值的參考。
